2022, Vol. 42
2. 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所, 北京 100850
2. Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China
随着电子信息技术迅猛发展，微波辐射的生物学效应日渐受到关注。研究表明，脑是微波辐射损伤的敏感靶器官之一，其中海马是微波辐射损伤的重要脑区，然其损伤机制仍未阐明[1-3]。海马脑区与学习记忆功能密切相关，主要负责短时记忆的存储转换和定向等功能[4]。研究发现，一定剂量电磁辐射可对学习记忆功能产生影响，其影响程度与辐射剂量相关。关于微波辐射对学习记忆功能影响的经典动物模型及检测方法尚未建立，其机制未完全揭示，尚有待于进一步研究。本研究采用与日常生活中常见电磁频段相近的2.856 GHz微波，建立微波辐射小鼠模型。同时，首次开展平均功率密度8 mW/cm2、比吸收率(SAR)值9.4 W/kg的微波辐射生物学效应研究，通过适宜敏感的行为学检测和组织病理学观察，证实微波辐射脑损伤效应，以期建立稳定良好的微波辐射脑损伤动物模型及其评价方法，为下一步损伤机制研究奠定基础。
材料与方法1. 实验动物及分组：采用10周龄SPF级C57BL/6N小鼠共54只，雌雄各半，体重(20±2)g，由斯贝福(北京)生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(京)2019-0010。动物饲养于军事科学院军事医学研究院实验动物中心。对小鼠进行行为学训练后，按随机数表法分为假辐射组(C组)和微波辐射组(R组)，各27只，其中水迷宫实验每组12只，穿梭箱实验共30只。
2. 微波辐射方法：采用军事科学院军事医学研究院自建的微波模拟源进行辐射，中心频率2.856 GHz、平均功率密度8 mW/cm2、SAR值9.4 W/kg，动物置于透明带孔有机玻璃盒内，全身均匀辐射，辐射时间15 min。假辐射组小鼠进行同等条件伪辐射。
3. 水迷宫实验检测小鼠空间学习记忆能力：采用Morris水迷宫实验系统(XR-XM101，上海欣软信息科技有限公司)检测微波辐射对小鼠空间参考记忆能力的影响。Morris水迷宫实验系统包括圆形水池、图像自动采集和处理系统圆形水池直径150 cm，水深30 cm，实验过程中水温控制在(22±2)℃。在目标象限内距离池壁35 cm处放置站台，站台位于水面1 cm下。水池周围用蓝色布帘遮挡，测试房间内光照恒定。
水迷宫实验步骤如下：①训练阶段：于微波辐射前，将动物面向池壁分别从4个象限入水，训练动物于1 min内找到平台，如果动物1 min内找不到平台，则引导动物到平台上停留10 s。每只动物每天训练4次，两次训练间隔15~20 min，连续训练3 d。②定位航行：分别于微波辐射后6 h、1、2、3 d进行定位航行实验，记录动物1 min内游泳轨迹，并计算其平均逃避潜伏期。③空间探索：微波辐射后4 d将平台撤除，将动物于平台象限对侧象限入水，记录动物1 min内跨越平台次数及平台象限游泳时间。④反向定位航行：微波辐射后5、6和7 d，将平台放置于对侧象限，记录动物1 min内游泳轨迹，并计算其平均逃避潜伏期。⑤反向空间探索：微波辐射后8 d将平台撤除，将动物于平台象限入水，记录动物1 min内跨越平台次数及平台象限游泳时间。
4. 穿梭箱实验检测小鼠联合型学习记忆能力：采用穿梭箱实验系统(DB079，北京智鼠多宝科技有限公司)及其数据自动采集和处理系统检测微波辐射对小鼠联合型学习记忆能力的影响。穿梭箱为360 mm×300 mm×130 mm四方箱体，内部由2个独立箱体并排组成，中间具有自动开关的阀门。箱体顶部装有红外摄像机，内壁为金属薄板，底部为可通电的金属栅。
穿梭箱实验步骤如下：①环境适应：实验前1 d将动物置于测试箱中自由活动5 min，以消除探索反射。②每天实验前将小鼠称重，根据体重调节电流参数，一般而言，体重20~22 g的小鼠，起始电流强度0.8 mA，体重每增加1 g，刺激电流强度增加0.1 mA。③将小鼠置于穿梭实验箱电击区。先给予条件刺激蜂鸣音5 s，然后给予电刺激10 s。如果在声音刺激5s内小鼠逃向安全区为主动逃避反应，电击后才逃向安全区则为被动逃避反应。④每只动物训练50个循环/d，经过8~10 d训练后，小鼠可逐渐形成条件性主动逃避反应，从而获得记忆。⑤分别于辐射前、辐射后6 h、3、7 d，记录小鼠平均主动逃避时间、电击时间、主动逃避率，研究微波辐射对小鼠联合型学习记忆能力的影响。
5. 脑组织取材及苏木精-伊红(HE)染色：微波辐射后8 d，小鼠经腹腔注射0.5%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后断头处死后取脑，脑组织先后经4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、石蜡包埋和切片，切片厚度3 μm，经HE染色后，镜下观察海马组织形态结构，并进行显微摄像。
6. 透射电镜标本制作及观察：微波辐射后8 d，小鼠经腹腔注射0.5%戊巴比妥(50 mg/kg)麻醉后断头处死，冰上剥离脑组织，取约1 mm3海马CA3区组织块置于2.5%戊二醛固定2 h，1%锇酸后固定2 h，梯度乙醇和丙酮脱水，Epon812树脂包埋，半薄切片定位后，制作超薄切片，切片厚度70 nm，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜(HITACHI H7650, 日本)下观察海马组织超微结构并摄像。
7. 统计学处理：应用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计量数据符合正态分布，用x±s表示；Morris水迷宫定位航行及反向定位航行实验数据方差齐性，采用单因素方差分析；空间探索和反向空间探索实验数据采用独立样本t检验，穿梭箱实验数据选取辐射前连续3 d数据的平均值与辐射后各时间点数据分别进行配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果1. 微波辐射对小鼠空间学习记忆功能的影响：Morris水迷宫实验结果显示，微波辐射后小鼠定位航行及反向定位航行实验平均逃避潜伏期较假辐射组均未见明显改变(P>0.05)；空间探索实验结果显示，微波辐射后4 d，小鼠1 min内穿越平台次数具有增多趋势[(1.7±0.37)次vs. (2.63±0.41)次]，但差异无统计学意义(P>0.05)；进一步反向空间探索实验结果表明，小鼠穿越平台次数较假辐射组显著减少[(3.60±0.79)次vs. (2.55±0.47)次，t=2.21，P=0.046]，提示微波辐射可导致小鼠空间学习记忆能力下降。
2. 微波辐射对小鼠联合型学习记忆功能的影响：穿梭箱实验结果显示，辐射前训练阶段第8~10天小鼠平均主动逃避率均达80%以上，表明小鼠成功建立了基于声刺激的条件反射，且联合型学习记忆能力良好。选取辐射前1、2、3 d数据的平均值作为辐射前数据，微波辐射后6 h小鼠平均主动逃避率较辐射前显著下降(t=2.70，P < 0.05)、平均主动潜伏期和总电击时间均显著延长(t=-3.09、-3.02，P < 0.05)。提示微波辐射可引起小鼠联合型学习记忆能力下降，见表 1。
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表 1 微波辐射前后小鼠穿梭箱实验平均主动逃避率、主动逃避时间及总电击时间变化(x±s) Table 1 The shuttle chamber experimental results of the changes of average active escape rate, active escape time and total shock time in the shuttle chamber experiment of mice before and after microwave radiation (x±s) |
3. 微波辐射后小鼠海马组织形态学改变：微波辐射后8 d，假辐射组海马组织结构基本正常，辐射组部分海马神经元变性，主要表现为细胞核固缩、深染，胞体皱缩，血管周间隙轻度增宽。病变以海马CA3和DG区较为明显，提示微波辐射可导致海马组织结构改变，见图 1。
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图 1 微波辐射后小鼠海马组织形态学改变HE染色 A.假辐射组小鼠海马CA3区组织×100；B.微波辐射组小鼠海马CA3区神经元 ×100；C.假辐射组小鼠海马DG区神经元 ×200；D.微波辐射组小鼠海马DG区神经元 ×200 Figure 1 Morphological changes of mouse hippocampus after microwave radiation HE staining A. Neurons in hippocampal CA3 region of mice in sham radiation group (×100); B. Neurons in hippocampal CA3 region of mice in microwave radiation group (×100); C. Neurons in hippocampal DG region of mice in sham radiation group (×200); D. Neurons in the hippocampal DG region of mice in microwave radiation group (×200) |
4. 微波辐射后海马超微结构改变：透射电镜观察显示，微波辐射后8 d，假辐射组海马组织CA3区神经细胞结构完整，边界清晰，神经突触和血管结构基本正常；辐射组可见部分海马神经元核染色质凝聚、边集，核型不整，核膜边界不清，凋亡发生(图 2E)；胶质细胞线粒体肿胀、局灶性空化、嵴断裂或消失，粗面内质网扩张、脱颗粒(图 2F)；突触双层膜结构模糊、部分融合，突触前囊泡堆积(图 2H)；血管周间隙增宽(图 2G)。提示微波辐射可导致海马组织超微结构改变。
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注：E中箭头指神经元核染色质凝聚、边集；F中箭头指线粒体肿胀、局灶性空化；G中*指血管周间隙增宽；H中箭头指突触间隙模糊、部分融合，突触前囊泡堆积 图 2 微波辐射后小鼠海马CA3区组织超微结构改变 A-D. 假辐射组神经元(×1 000)、胶质细胞(×12 000)、血管(×20 000)及突触结构(×80 000)；E-H. 微波辐射组神经元(×10 000)、胶质细胞(×10 000)、血管(×15 000)、突触间隙(×80 000) Figure 2 Ultrastructural changes of hippocampal CA3 region of mice after microwave radiation A-D. Neurons (×1 000), glial cells (×12 000), blood vessels (×20 000) and synaptic structure (×80 000) in sham radiation group, respectively; E-H. Neurons (×10 000), glial cells (×10 000), blood vessels (×15 000) and synaptic structure (×80 000) in radiation group, respectively |
讨论
研究表明，海马是电磁辐射敏感脑区。海马主要参与短期记忆、长期记忆、空间定位导航和情绪行为功能的调节[5-7]。电磁辐射可引起神经行为改变，如逆行性遗忘，空间学习效率降低和空间参照记忆能力下降等[8]。Morris水迷宫实验应用于电磁辐射对神经行为影响的研究较为常见。Narayanan等[9]将大鼠在900 MHz、功率密度为146.6 μW/cm2下连续暴露28 d，辐射后大鼠平均逃避潜伏期较辐射前显著延长，且探索目标平台所在象限时间显著降低，穿越平台次数显著减少。Sharma等[10]采用微波(10 GHz、0.25 mW/cm2、0.179 W/kg)辐射小鼠，2 h/d，连续暴露15 d，辐射后小鼠平均逃避潜伏期显著延长。提示一定剂量微波辐射长期暴露可导致小鼠空间学习记忆能力下降。Wang等[11]采用中心频率2.856 GHz，平均功率密度为5、10、50 mW/cm2，SAR值分别为3.5、7、35 W/kg的脉冲微波辐射Wistar大鼠6 min，结果显示，10和50 mW/cm2微波辐射后6 h、1 d，大鼠平均逃避潜伏期均显著延长。Qiao等[12]采用2.856 GHz，30 mW/cm2，SAR值14 W/kg微波辐射Wistar大鼠5 min，发现辐射后大鼠空间记忆能力下降。提示一定条件微波辐射短期暴露可导致小鼠空间认知功能障碍。前期研究发现，Wistar大鼠暴露于2.856 GHz、30 mW/cm2，SAR值9.4 W/kg的脉冲微波辐射15 min，辐射组大鼠平均逃避潜伏期显著延长，且穿越平台次数较对照组显著减少[13]。与以往的研究报道一致。本研究首次采用2.856 GHz、8 mW/cm2、SAR值9.4 W/kg微波辐射小鼠，发现辐射后小鼠空间参考记忆能力显著下降。进一步证实了微波辐射对空间学习记忆能力的影响，同时，为下一步微波辐射神经生物学效应机制研究提供了良好的动物模型。
作为另一种定量检测动物行为学改变的重要手段，穿梭箱实验属于经典的联合型学习条件反射[14]。关于穿梭箱实验在电磁辐射神经生物学效应中的应用少见报道。本研究通过微波辐射前穿梭箱实验训练，建立基于声电联合刺激的小鼠主动回避的条件反射能力，并于辐射后检测小鼠的联合型学习记忆能力，发现辐射后6 h，小鼠平均主动逃避率显著降低，平均主动潜伏期和总电击时间均较辐射前显著延长，表明微波辐射可导致小鼠联合型学习记忆能力下降。辐射后3、6 d，小鼠平均主动逃避率、平均主动潜伏期和总电击时间较辐射前差异均无统计学意义，提示微波辐射所致小鼠联合型学习记忆下降以辐射后早期为主，至辐射后3和6 d明显恢复，其机制可能与辐射后早期机体的应激反应有关，也可能涉及海马神经元电活动及突触可塑性异常，具体机制尚待进一步深入研究。总之，本研究首次采用穿梭箱实验，揭示了微波辐射对小鼠联合型学习记忆能力的影响，为电磁辐射神经生物学效应研究提供了一种敏感的行为学检测方法。
许多研究发现，微波辐射可导致海马组织结构损伤，主要表现为部分海马神经元变性、坏死，损伤以DG区较为常见，且存在一定剂量-效应关系[15-16]。Delen等[15]将大鼠暴露于2 600 MHz射频辐射30 min/d，5 d/周，连续30 d，发现辐射组海马CA3区神经元排列紊乱、形态异常、数量减少，星形胶质细胞数量增加，CA1区神经胶质细胞周围血管扩张、水肿。关于微波辐射对海马组织超微结构影响的研究发现，2.45 MHz、200 mW/cm2微波辐射大鼠6min，导致海马CA1区锥体神经元排列紊乱，细胞肿胀，核皱缩凝集，胞浆染色深、结构不清；局部区域血管扩张[17]。2.856 GHz、50 mW/cm2微波辐射大鼠6 min，辐射后海马突触后致密物增加，突触间隙模糊[18]。
为进一步明确微波辐射对海马组织结构的影响，本研究发现，2.856 GHz、8 mW/cm2、9.4 W/kg微波辐射后8 d，小鼠部分海马神经元变性，可见细胞核深染固缩，胞体皱缩，血管周间隙轻度增宽。病变以CA3和DG区较为明显。超微结构显示，部分海马CA3神经元变性、凋亡，线粒体肿胀、局灶性空化、嵴断裂或消失，粗面内质网扩张、脱颗粒，突触双层膜结构模糊、部分融合，突触前囊泡堆积；血管周间隙增宽。以上均提示，一定条件微波辐射可导致海马组织及超微结构病理学改变。
综上所述，本研究首次采用中心频率2.856 GHz、平均功率密度8 mW/cm2、SAR值9.4 W/kg微波辐射小鼠，联合应用Morris水迷宫和穿梭箱实验，阐明了微波辐射对小鼠联合型学习记忆能力的影响，并通过海马组织形态和超微结构观察，确证了微波辐射所致海马组织结构损伤。海马组织结构改变可能影响其功能发挥，本研究中微波辐射后海马组织结构病理学改变与Morris水迷宫实验结果具有一致性，提示海马组织病理学改变是微波辐射致小鼠空间学习记忆能力下降的结构基础。本研究成功建立了微波辐射小鼠动物模型，同时提供了一种新型的适用于微波辐射神经生物学效应研究的行为学检测方法，并为下一步微波辐射脑损伤机制研究提供了实验依据和参考。
利益冲突 无
作者贡献声明 胡翠翠、刘亚东负责实验操作, 数据分析和论文撰写; 常晨旭、孔晓旭负责采集数据; 叶雨萌、郝延辉指导实验设计和论文修改; 左红艳、李杨负责指导论文撰写
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