放射治疗是临床肿瘤常规且有效的治疗方法之一，但在盆腹腔肿瘤患者的放射治疗过程中，高剂量的电离辐射会引起肠黏膜炎症和内皮细胞(EC)损伤，导致急性肠损伤^[1]。因此，为临床上寻找减轻放射治疗引起的肠道损伤的方法至关重要。

血管性血友病因子裂解蛋白酶(ADAMTS13)是血管性血友病因子(vWF)的裂解酶，主要由肝星状细胞和EC合成，具有调节炎症反应和血栓形成等功能。辐射会引起EC通透性增加、间质纤维蛋白沉积以及血栓-出血平衡偏向凝血，进而直接促进辐射暴露后的肠道损伤^[2]；此外，有动物实验证明急性放射性肠损伤EC中vWF表达和分泌增加^[3]，加重微血管和组织损伤，故EC被认为是辐射诱发肠病的关键部分^[4]。而ADAMTS13可水解切割vWF，防止微血管血栓形成、功能障碍和组织损伤^[5-6]。Zitomersky等^[7]研究发现ADAMTS13缺乏会加重肠道炎症，前期也有研究表明rhADAMTS13可以通过抑制急性肾损伤炎症反应和氧化应激水平进而改善EC功能^[8-9]。然而，目前鲜有关于rhADAMTS13是否能改善放射性肠损伤的研究，本研究重点关注rhADAMTS13能否通过调节炎症和氧化应激水平发挥辐射防护作用，为以EC中ADAMTS13-vWF平衡轴为靶点的辐射防护提供基础研究线索。

1. 药品试剂：rhADAMTS13蛋白购于美国R&D Systems公司；vWF、ADAMTS13及C-反应蛋白(CRP)试剂盒购于上海酶联生物技术有限公司；丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)和二氨基联苯胺(DAB)辣根过氧化物酶显色试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司；免疫组织化学使用Ki67抗体购自英国Abcam公司，髓过氧化物酶(MPO)及肿瘤坏死因子α(TNF-α)抗体购于美国Proteintech公司。

2. 实验动物及分组：8~10周龄C57BL/6 J雄性SPF级小鼠30只，体重(25±2)g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK[京]2019-0009)。饲养于苏州大学动物实验中心(许可证号：XCYK [苏] 2002-0008)，环境温度为22~25℃，湿度为55%~65%。1周适应喂养后，根据体重随机数表法分为3组，健康对照组(6只)、单纯照射组(12只)和联合组(12只)，自由摄食饮水。联合组小鼠于照射前3 d给予尾静脉注射2.5 μg/kg rhADAMTS13，3 d后单纯照射组和联合组给予单次12 Gy X射线腹部照射。

3. 照射方案：5%水合氯醛麻醉小鼠，将小鼠于固定于特制固定架上。采用美国X-RAD 320直线加速器(美国Precision X-Ray公司)6 MV的X射线照射，源皮距为51 cm，剂量率为1 Gy/min，总照射剂量为12 Gy，照射范围为小鼠全腹部，其余用铅板遮挡。

4. 标本采集与处理：照射后1和3 d处死小鼠，腹主动脉取血(枸橼酸钠抗凝)，离心半径为30 cm，3 000 r/min，4℃条件下离心15 min，取上清，-80℃冻存备用。用4%多聚甲醛溶液固定小肠组织，用于石蜡包埋切片及病理染色实验。

5. 病理切片观察及评价：取肠组织石蜡包埋切片，5 μm切片脱蜡至水后，苏木素-伊红(HE)染色。电子显微镜观察并采集图像分析。

6. Ki67、MPO和TNF-α免疫组织化学分析：取肠组织石蜡切片，脱蜡至水化，高压修复，3%过氧化氢灭活内源性过氧化物酶，牛血清白蛋白(BSA)封闭。加入50 μl的一抗Ki67 (1 ∶1 000稀释)，MPO (1 ∶400稀释)和TNF-α(1 ∶500稀释)，4℃孵育过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗后加入二抗，常温孵育1 h，二氨基联苯胺(DAB)显色后复染苏木素，中性树胶封片待拍摄。免疫组织化学染色阳性细胞呈棕黄，染色深者呈褐色，每张切片随机取6个视野(×400)读片，并用Image Pro Plus图像分析软件对图像进行定量计算。

7. 酶联免疫吸附法(ELISA)检测血浆因子：血浆vWF、ADAMTS13和CRP按照试剂盒说明书检测，酶标仪450 nm波长检测吸光度(A₄₅₀)值，计算各因子含量。

8. 氧化应激生化指标：血清MDA、T-AOC和SOD按照试剂盒说明书检测，酶标仪450 nm波长检测吸光度(A₄₅₀)值，计算各氧化应激指标水平。

9. 统计学处理：采用SPSS 24.0软件进行统计学分析，数据符合正态分布，用x ±s表示。组间比较使用两独立样本t检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

1.照射致小鼠血浆ADAMTS13-vWF轴紊乱：与健康对照组比较，照射后小鼠血浆vWF及ADAMTS13抗原水平均发生改变，其中照射后1和3 d血浆vWF含量上升(t=6.20、12.29，P < 0.05)，而ADAMTS13水平下降(t=9.82、22.83，P < 0.05)，差异均具有统计学意义，见图 1。

注：1.健康对照组；2.单纯照射组照射后1 d；3.单纯照射组照射后3 d；与健康对照组比较，at=6.20、12.29，P < 0.05；bt=9.82、22.83，P < 0.05；vWF.血管性血友病因子；ADAMTS13. 血管性血友病因子裂解蛋白酶 图 1 单纯照射组小鼠照后不同时间血浆ADAMTS13-vWF轴抗原水平变化  A.vWF抗原变化倍数；B.ADAMTS13抗原变化倍数 Figure 1 Changes of the antigen levels in plasma ADAMTS13-vWF axis at different time after irradiation A. Fold change of vWF antigen; B. Fold change of ADAMTS13 antigen

2. rhADAMTS13调节血浆ADAMTS13-vWF水平：与健康对照组比较，单纯照射组和联合组照射后1和3d vWF抗原含量均有不同程度增加(t= 7.47、3.72、12.29、8.58，P < 0.05)，ADAMTS13抗原含量降低(t= 13.93、6.71、22.83、13.21，P < 0.05)。体内给予rhADAMTS13，联合组与单纯照射组比较，照后1和3 d小鼠血浆vWF含量降低差异具有统计学意义(t=2.93、3.96，P < 0.05)，对于ADAMTS13水平被逆转而升高差异具有统计学意义(t=5.09、9.82，P < 0.05)，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组小鼠照射后不同时间血浆vWF和ADAMTS13抗原水平变化倍数(x ±s) Table 1 Changes of plasma vWF and ADAMTS13 antigen at different time after irradiation in each group of mice (x ±s) 组别 只数 vWF ADAMTS13 健康对照组 6 1.00±0.10 1.00±0.04 单纯照射组 1 d 6 1.41±0.09a 0.65±0.05a 3 d 6 1.70±0.10a 0.42±0.04a 联合照射组 1 d 6 1.23±0.12ab 0.80±0.06ab 3 d 6 1.48±0.09ac 0.67±0.03ac 注：a与健康对照组比，t= 7.47、3.72、12.29、8.58、13.93、6.71、22.83、13.21，P < 0.05；b与单纯照射组照后1 d比较，t=2.93、3.96，P < 0.05；c与单纯照射组照后3 d比较，t=5.09、9.82，P < 0.05；vWF.血管性血友病因子；ADAMTS13.血管性血友病因子裂解蛋白酶

表 1 各组小鼠照射后不同时间血浆vWF和ADAMTS13抗原水平变化倍数(x ±s) Table 1 Changes of plasma vWF and ADAMTS13 antigen at different time after irradiation in each group of mice (x ±s)

3. rhADAMTS13减轻辐射引起的肠道损伤：分别取单纯照射组和联合组照射后3 d的小鼠小肠进行HE和Ki67染色，以评估肠组织形态及修复能力。HE染色结果见图 2，与健康对照组比较，单纯照射组肠绒毛长度明显缩短，差异有统计学意义(t=10.53, P < 0.05)；与单纯照射组比较，联合组绒毛缩短程度显著减轻(t=8.51，P < 0.05)。Ki67免疫组织化学染色结果见图 2，与健康对照组比较，单纯照射组隐窝Ki67⁺细胞数量明显减少(t=10.89, P < 0.05)；与单纯照射组比较，联合组Ki67⁺细胞数量明显增加(t=9.82，P < 0.05)。

注：1.健康对照组；2.单纯照射组；3.联合组。a与健康对照组比较，t=10.53、10.89, P < 0.05；b与单纯照射组比较，t=8.51、9.82，P < 0.05；Ki67.增殖相关的核蛋白 图 2 照射后3 d小鼠肠组织病理染色及定量分析  A.HE染色  ×200；B.肠绒毛长度定量分析；C.Ki67免疫组织化学染色  ×400；D.隐窝Ki67+细胞数定量分析 Figure 2 Histopathological staining and quantitative analysis of mouse intestine 3 days after irradiation A. HE staining ×200; B. Quantitative analysis of intestinal villi length; C. Ki67 immunohistochemical staining ×400; D. Quantitative analysis of crypt Ki67+ cell count

4. rhADAMTS13抑制由辐射诱导的肠道炎症：为了评估rhADAMTS13对放射性肠损伤的保护作用是否通过改善肠组织炎症水平实现，分别取单纯照射组和联合组照射后3 d肠组织进行TNF-α和MPO免疫组织化学染色。与健康对照组相比，单纯照射组与联合组TNF-α⁺水平增加(t=18.14、2.32，P < 0.05)；联合组与单纯照射组相比，TNF-α⁺细胞在肠组织浸润水平降低，差异有统计学意义(t=15.44，P < 0.05)。与健康对照组比较，单纯照射组3 d MPO⁺细胞浸润明显增加(t=16.53，P < 0.05)，联合组与单纯照射组比较MPO⁺细胞在肠组织浸润水平明显减低差异有统计学意义(t=14.33，P < 0.05)，见图 3。此外，还检测了血浆炎症指标CRP的含量，结果见表 2，与健康对照组比，照射后1及3 d血浆CRP含量明显增加(t=7.63、3.42，P < 0.05)；与单纯照射组比较，联合组照后1和3 d的CRP含量明显减低，差异具有统计学意义(t=5.02、2.96，P < 0.05)。

注：1.健康对照组；2.单纯照射组；3.联合组。a与健康对照组比较，t=18.14、2.32、16.53，P < 0.05；b与单纯照射组比较，t=15.44、14.33，P < 0.05；TNF-α.肿瘤坏死因子α；MPO.髓过氧化物酶 图 3 照射后3 d小鼠肠组织炎症细胞浸润程度  A.TNF-α免疫组织化学染色  ×400；B.TNF-α+细胞数定量分析；C.MPO免疫组织化学染色  ×400；D.MPO+细胞数定量分析 Figure 3 Status of inflammatory cell infiltration in mouse intestinal tissue 3 d after irradiation A. Immunohistochemical staining of TNF-α ×400; B. Quantitative analysis of TNF-α+ cell count; C. Immunohistochemical staining of MPO ×400; D. Quantitative analysis of MPO+ cell count

表 2(Table 2)

表 2 各组小鼠照射后不同时间血浆CPR及氧化应激相关指标水平变化(x ±s) Table 2 Changes of plasma CPR and oxidative stress-related indexes at different time after irradiation in various groups of mice (x ±s) 组别 只数 CRP (ng/ml) MDA (μmol/L) SOD (U) T-AOC (mmol/L) 健康对照组 6 0.29±0.07 1.99±0.74 2.68±0.67 1.71±0.28 单纯照射组 1 d 6 0.77±0.13a 4.24±1.49a 1.47±0.50a 1.10±0.17a 3 d 6 0.55±0.17a 3.79±0.68a 0.69±0.36a 0.69±0.15a 联合照射组 1 d 6 0.41±0.11b 2.25±1.29b 2.06±0.21b 1.48±0.26b 3 d 6 0.32±0.08c 2.41±1.14c 2.18±0.53c 1.15±0.16ac 注：CRP.C-反应蛋白；MDA.丙二醛；SOD.超氧化物歧化酶；T-AOC.总抗氧化能力。a与健康对照组比较，t= 7.63、3.42、3.31、4.40、3.54、6.39、4.58、7.86、4.23，P < 0.05；b与单纯照射组照射后1 d比较，t=5.02、2.47、2.64、3.05，P < 0.05；c与单纯照射组照射后3 d比较，t=2.96、2.55、5.64、5.07，P < 0.05

表 2 各组小鼠照射后不同时间血浆CPR及氧化应激相关指标水平变化(x ±s) Table 2 Changes of plasma CPR and oxidative stress-related indexes at different time after irradiation in various groups of mice (x ±s)

5. rhADAMTS13减轻放射性肠损伤小鼠氧化应激水平：与健康对照组比，照射后1和3 d，MDA增加(t=3.31、4.40，P < 0.05)，SOD和T-AOC均减低(t=3.54、4.58、6.39、7.86，P < 0.05)。与单纯照射组比，联合组照射后1和3 d，MDA下降(t=2.47、2.55，P < 0.05)，且SOD及T-AOC增强，差异有统计学意义(t=2.64、3.05、5.64、5.07，P < 0.05), 见表 2。

rhADAMTS13已在动物水平开展广泛研究，主要集中在心肌损伤、肾脏损伤和结肠炎领域，其体内裂解底物vWF由内皮细胞棒杆状小体、血小板α颗粒和内皮下结缔组织合成并分泌至血浆，常被认为是血管内皮损伤标志物。Savchenko等^[10]认为EC损伤会释放vWF多聚体，促进白细胞和血小板募集，导致更多的棒杆状小体释放vWF，形成炎症浸润和氧化应激的恶性循环。ADAMTS13主要由肝脏星状细胞和血管内皮细胞合成，分泌于血液之中被证实可以通过对vWF蛋白的水解作用，在动脉粥样硬化、局灶性脑缺血和心肌缺血再灌注期间降低炎症反应^[11-13]。此外，有研究表明在接受5至6周放疗的盆腔癌患者中，大约80% 的患者会出现胃肠道功能障碍^[14]。由于胃肠道有大量EC和黏膜上皮细胞，因此EC障碍被认为是放射性肠病的关键因素之一^[15]。

本研究发现，辐照后小鼠血浆vWF抗原水平升高，而ADAMTS13水平下降，表明血浆ADAMTS13-vWF轴紊乱和血管内皮功能障碍。进一步体内给予rhADAMTS13，结果证明rhADAMTS13可恢复ADAMTS13-vWF轴和减轻辐照后小鼠肠损伤，具体表现为绒毛损伤减轻、隐窝Ki67⁺细胞数量增加等。以上结果表明辐射肠损伤的发生和损伤程度可能与vWF抗原水平升高以及ADAMTS13抗原水平降低有关。

与之前的研究一致，本研究结果表明rhADAMTS13可降低辐射后肠组织TNF-α和MPO⁺细胞浸润以及血浆CRP含量，发挥一定的抗炎作用。另一方面，氧化应激主要参与辐射引起的肠道损伤，尤其与EC和肠上皮损伤有关。目前的研究表明，氧化应激被vWF增强，但被rhADAMTS13抑制^[16]。因此，rhADAMTS13可能通过降低氧化应激水平来限制辐射肠损伤和功能障碍。Kremer等^[17]证明EC损伤刺激vWF释放，从而促进血小板聚集和单核细胞活化，而ADAMTS13的合成和分泌受到抑制，由此产生的低水平ADAMTS13不能再充分切割升高的vWF，并且血小板锚定在血管内皮腔中的vWF沉积物上，会进一步促进损伤部位的单核细胞渗出。这种活化的单核细胞会产生大量的ROS，进而增加氧化应激和组织炎症，形成恶性循环，加剧组织损伤^[18]。因此，ADAMTS13-vWF轴在氧化应激相关途径中也可能发挥重要作用。本研究结果表明rhADAMTS13可以通过降低MDA含量、增加SOD活性及T-AOC发挥抑制辐照后机体氧化应激功能，但具体作用机制还需进一步研究。

综上，rhADAMTS13通过降低炎症和氧化应激水平减轻放射性肠损伤，指出通过调控ADAMTS13-vWF轴对放射性肠损伤的防护与治疗可能具有积极意义。

利益冲突  所有研究者均未因进行该研究而接受任何不正当的职务或财务利益，在此对研究的独立性和科学性予以保证

作者贡献声明  许杰负责实验操作与数据分析、论文撰写；周雅丽、王文负责部分数据分析与实验操作；何杨负责课题设计与指导、论文修改