中华放射医学与防护杂志  2022, Vol. 42 Issue (4): 248-255   PDF    
ZNF451通过调控53BP1/MDC1促进A549和HeLa细胞DNA损伤修复
夏琪1 , 赵国平2 , 吴李君1     
1. 中国科学技术大学环境科学与光电技术学院,合肥 230026;
2. 中国科学院合肥物质科学研究院强磁场中心,合肥 230031
[摘要] 目的 探究SUMO E3连接酶(zinc finger protein 451,ZNF451)介导非小细胞肺癌A549细胞和宫颈癌HeLa细胞DNA损伤修复的功能及机制。方法 采用γ射线或依托泊苷处理A549细胞和HeLa细胞,CCK-8法检测细胞增殖活力,蛋白免疫印迹法检测蛋白表达量。DR-GFP质粒系统检测DNA损伤修复水平,免疫荧光法检测蛋白的空间定位。结果 依托泊苷抑制了ZNF451的表达并呈剂量及时间依赖性。30、50、80 μmol/L依托泊苷处理,敲低ZNF451后的A549和HeLa细胞增殖活力显著降低(A549:t = 27.62、25.61、5.32, P < 0.01;HeLa:t = 30.77、21.28、4.18,P < 0.01)。ZNF451在DNA损伤位点处募集并与γ-H2AX存在胞内共定位和内源性的相互作用,且在30、50、80 μmol/L依托泊苷处理的ZNF451敲低细胞中,γ-H2AX的表达水平显著增加(A549:t = 6.12、10.67、4.68,P < 0.01;HeLa:t = 7.94、9.81、15.12,P < 0.01)。敲低ZNF451的细胞非同源末端连接(NHEJ)修复效率降低(t = 18.60,P < 0.05)。在辐射和依托泊苷处理后,ZNF451与P53结合蛋白1(53BP1)和DNA损伤检查点介质1(MDC1)有明显的共定位。结论 敲低ZNF451抑制A549和HeLa细胞增殖并诱导DNA损伤水平加剧。ZNF451可以募集至DNA损伤位点,通过与DNA损伤修复因子53BP1/MDC1共定位参与NHEJ修复。
[关键词] ZNF451    DNA损伤修复    放疗敏感性    NHEJ    53BP1/MDC1    
ZNF451 promotes DNA damage repair by recruiting 53BP1/MDC1 in A549 and HeLa cells
Xia Qi1 , Zhao Guoping2 , Wu Lijun1     
1. School of Environmental Science and Optoelectronic Technology, University of Science and Technology of China, Hefei 230026, China;
2. Key Laboratory of High Magnetic Field and Ion Beam Physical Biology, Hefei Institutes of Physical Science, Chinese Academy of Science, Hefei 230031, China
[Abstract] Objective To investigate the role of SUMO E3 ligase ZNF451 in DNA damage repair and explore the underlying mechanism in non-small cell lung cancer A549 cells and cervical cancer HeLa cells. Methods A549 cells and HeLa cells were irradiated with γ-ray irradiation or treated with etoposide. Cell proliferation viability was detected by the cell counting kit-8 assay. Protein expression was detected by Western blot assay. DNA damage repair level was detected by DR-GFP plasmid system, and the spatial positioning was detected by immunofluorescence. Results Etoposide decreased the expression level of ZNF451 in a dose- and time- dependent manner. After treatment with 30, 50, 80 μmol/L etoposide, the cell viability were reduced after the knockdown of ZNF451 in A549 and HeLa cells(A549: t = 27.62, 25.61, 5.32, P < 0.01; HeLa: t = 30.77, 21.28, 4.18, P < 0.01). Furthermore, ZNF451 was recruited at DNA damage sites. A co-localization and endogenous interaction were found between ZNF451 and γ-H2AX after the treatment of irradiation or etoposide. Moreover, the expression level of γ-H2AX was significantly increased after treatment with 30, 50, 80 μmol/L etoposide(A549: t = 6.12, 10.67, 4.68, P < 0.01; HeLa: t = 7.94, 9.81, 15.12, P < 0.01)and the repair efficiency of NHEJ was reduced in ZNF451 knockdown cells(t = 18.60, P < 0.05). Finally, the immunofluorescence assay showed that ZNF451 was co-localizated with 53BP1 and MDC1 after irradiation or etoposide treatment. Conclusions Knockdown of ZNF451 inhibits cell proliferation and increases the level of DNA damage in A549 and HeLa cells. ZNF451 was recruited to DNA damage sites after DSBs and participated in NHEJ repair by co-localizing with DNA damage repair factor 53BP1/MDC1.
[Key words] ZNF451    DNA damage repair    Radiosensitivity    Non-homologous end joining    53BP1/MDC1    

放疗和化疗是目前临床癌症治疗的主要手段[1]。辐射和化疗药物能通过诱导癌细胞的DNA双链断裂(double-strand breakage,DSB)达到抑制癌细胞存活的目的。DSB修复的主要途径是非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)和同源重组(homologous recombination,HR)[2]。针对DNA损伤修复因子的特异性靶向药物已应用于临床[3],药物通过干预这些修复因子的生物学功能,使肿瘤细胞丧失DNA损伤修复能力,进而增加肿瘤放化疗的敏感性[4-5]

锌指蛋白451(ZNF451)是一种SUMO E3连接酶,它有两个N端SUMO2相对作用基序(SIMs),1个PilT N端“PIN”域,1个泛素交互基序(UIM),11个锌指区域[6]。之前的研究表明,ZNF451可以参与DNA-蛋白质交联、转化生长因子-β信号、PML小体和上皮细胞-间充质转化等多种生物学过程[7-11]

目前对于ZNF451的研究未涉及DNA损伤修复且其在DNA损伤修复中的作用亟待阐明。本研究以ZNF451为关键靶点,探讨其对A549细胞和HeLa细胞DNA损伤修复的影响及相关的分子生物学机制,以期为癌症的诊断和治疗提供新的调控因子。

材料与方法

1. 细胞培养和辐射处理:A549和HeLa细胞系购自中国科学院细胞库,并在补充有10%胎牛血清(以色列Biological公司)和1% (V/V)青霉素/链霉素(上海Beyotime公司)的DMEM(美国HyClone公司)中培养。细胞由德国贝欧宝BioBeam GM2000 γ射线辐照仪单次照射,吸收剂量率为3.27 Gy/min,总剂量6 Gy。辐照后放回培养箱继续培养。

2. 化学品和试剂:CCK-8试剂盒(合肥Biosharp公司),依托泊苷(上海TargetMol公司),Lipofectamine 2000(美国Thermo Fishier公司),蛋白A/G珠(美国Santa公司),ZNF451(美国Sigma公司),MDC1(英国Absin公司),γ-H2AX(上海Novus公司),53BP1(美国CST公司),β-肌动蛋白(美国Affinity公司)。siRNA序列为:5′ GCUCAACUGUAAGAUUUAUTTAUAAAUCUUACAGUUGAGCTT 3′。

3. 慢病毒包装shRNA细胞及细胞计数:使用pLKO.1-shRNA、psPAX2和pMD2.G的三质粒系统在HEK293 T细胞中构建慢病毒颗粒,将稳转细胞以80 000个/皿的初始密度接种在60 mm培养皿中。每24 h重悬细胞后计数。记录6 d内细胞生长情况并绘制生长曲线。细胞分为对照组和敲低组。

4. CCK-8法检测细胞活力:接种细胞悬液于96孔板中,每孔约5 000个细胞,用10~100 μmol/L的依托泊苷处理细胞。连续暴露48 h后,每孔加入10 μl CCK-8溶液,孵育4 h。使用酶标仪测定450 nm处的吸光度( A )值。

5. 蛋白质印迹分析:细胞裂解液于4℃、12 000×g离心15 min,上清液用BCA试剂盒(上海Sangon Biotech公司)检测 A 值。20~40 μg总蛋白样品通过8%~12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离并转移至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)膜上,膜在室温下用0.1% Tween 20 (TBST)和5%牛血清白蛋白(BSA)封闭。4℃下孵育一抗,过夜后室温下孵育二抗1 h。化学发光底物(武汉BOSTER公司)显示蛋白条带。

6. 免疫沉淀分析:总细胞裂解液以12 000×g离心15 min。取上清,加入一抗4℃孵育12 h后,加入20 μlG蛋白修饰琼脂糖珠(protein G sepharose bead),捕获蛋白复合物。4℃温和翻转孵育3 h,离心半径13.5 cm,2 500 r/min,离心5 min。用预冷的磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤复合颗粒,将免疫沉淀物重新悬浮在SDS-PAGE上样缓冲液中用于蛋白质印迹分析。

7. 免疫荧光染色:预冷至-20℃的甲醇固定细胞20 min。用PBS洗涤细胞,0.5% Triton X-100渗透细胞,含有5% BSA和0.5% Triton X-100的PBS室温封闭1 h。4℃孵育一抗,过夜后用荧光标记的二抗室温孵育细胞1 h。细胞核用DAPI复染。使用荧光显微镜捕获图像。细胞分为对照组、辐照处理组、依托泊苷处理组。

8. DR-GFP质粒及HR和NHEJ检测:基于I-SceI内切酶的DNA损伤报告系统由军事科学院王治东课题组馈赠。该质粒系统包含DR-GFP质粒、EJ-GFP质粒及I-SceI内切酶。对于NHEJ测定,NHEJ-GFP在20 μl Hind Ш酶体系(包括cutmart和ddH2O缓冲液)中孵育3 h。用Lipofectamine 2000将混合物转染到细胞中。对于HR测定,将DR-GFP在基础培养基中孵育并用Lipofectamine 2000转染到细胞悬浮液中,24 h后将I-SceI内切酶转染到细胞中。质粒转染6 h后,细胞均用完全培养基代替基础培养基培养至48 h。使用流式细胞仪对阳性细胞进行测定。

9. 统计学处理:所有实验至少独立进行3次,计量资料符合正态分布,以x±s表示,采用GraphPad Prism 9软件进行分析。Student′s t检验用于两组之间的比较,ANOVA用于多组之间的比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

结果

1. 化疗药物诱导ZNF451的表达:检测不同浓度的依托泊苷处理A549和HeLa细胞后不同时间ZNF451蛋白表达的变化,结果如表 1表 2所示,依托泊苷抑制了ZNF451的表达,且呈时间及剂量依赖性(P < 0.01)。如图 1所示,利用慢病毒包装技术构建稳定敲低ZNF451的HeLa细胞系,该细胞中ZNF451蛋白表达水平显著降低,敲低组ZNF451的蛋白表达量相对于对照组降>低至20%±3%(t = 27.93,P < 0.01);ZNF451敲低组在接种第4~6天,生长速率较对照组明显变缓(t = 5.95、21.27、34.16,P < 0.01)。这些结果表明,ZNF451对临床化疗药物敏感,抑制ZNF451的表达阻滞了HeLa细胞的生长速率。

表 1 不同浓度依托泊苷处理细胞24 h后ZNF451的相对表达(x±s) Table 1 ZNF451 expression level in A549 and Hela cells after the treatment of etoposide with different concentrations for 24 h (x±s)

表 2 50 μmol/L依托泊苷处理细胞不同时间后ZNF451的相对表达(x±s) Table 2 ZNF451 expression level in A549 and HeLa cells after the treatment of 50 μmol/L etoposide for 0-24 h (x±s)

注:a与同一时间对照组比较,t = 5.95、21.27、34.16,P < 0.01
A.蛋白表达量变化;B.生长曲线变化
图 1 ZNF451敲低后对细胞生长的影响
A. The expression level of ZNF451 after ZNF451knockdown; B. Cell growth ability was simulated after ZNF451 knockdown Figure 1 The effect of ZNF451 knockdown on cell growth

2. ZNF451对DNA损伤刺激的反应:6 Gy γ射线和50 μmol/L依托泊苷分别处理细胞6 h后,两处理组均出现了明显的焦点(foci)(图 2),说明ZNF451可以在DNA损伤位点形成foci。在30、50、80 μmol/L依托泊苷处理48 h后,ZNF451敲低组的细胞存活率均低于对照组(A549: t = 27.62、25.61、5.32, P < 0.01; HeLa: t = 30.77、21.28、4.18, P < 0.01),见图 3,表明ZNF451介导了辐射或依托泊苷诱导的DNA损伤反应,敲低ZNF451的A549和HeLa细胞在依托泊苷处理后增殖活力受到显著抑制。

图 2 依托泊苷(50 μmol/L)或6 Gy γ射线照射A549细胞(A)和HeLa细胞(B)6 h后ZNF451的定位变化荧光标记二抗染色×100 Figure 2 Immunofluorescence staining of the localization of ZNF451 in A549 cells (A) or HeLa cells (B) exposed to 50 μmol/L etoposide or 6 Gy γ-rays for 6 h ×100

注:a与同一浓度下A549对照组比较,t = 27.62、25.61、5.32,P < 0.01;b与同一浓度下HeLa对照组比较,t = 30.77、21.28、4.18,P < 0.01 图 3 ZNF451敲低组及对照组A549(A)和HeLa (B)细胞经不同浓度依托泊苷处理的存活曲线 Figure 3 Cell viabilities of ZNF451 knocked-down A549 (A) or HeLa (B) cells after the treatment of etoposide with different concentrations

3. ZNF451对γ-H2AX表达的影响:结果如图 4所示,以6 Gy γ射线和50 μmol/L依托泊苷分别处理细胞6 h后,ZNF451和γ-H2AX在损伤位点均形成foci,且两者的foci在合成图中出现共定位现象,说明ZNF451与γ-H2AX在定位分布上存在密切的联系。此外,免疫共沉淀的结果表明,ZNF451与γ-H2AX具有内源性的相互作用(图 5)。如图 6所示,30、50、80 μmol/L依托泊苷诱导后,敲低组相较于对照组γ-H2AX的表达水平显著增加(A549:t = 6.12、10.67、4.68,P < 0.01;HeLa:t = 7.94、9.81、15.12,P < 0.01)。提示ZNF451通过与γ-H2AX相互作用而被招募至DNA损伤位点,抑制A549和HeLa细胞中的ZNF451蛋白表达量,加剧了依托泊苷诱导的DNA损伤水平。

图 4 6 Gy γ射线和50 μmol/L依托泊苷处理后A549(A)和HeLa(B)细胞中ZNF451和γ-H2AX免疫荧光分布图荧光标记二抗染色×100 Figure 4 Distribution of ZNF451 and γ-H2AX in A549 (A) and HeLa (B) cells after γ-ray irradiation and 50 μmol/L etoposide treatment ×100

注:IP. 以蛋白ZNF451作为诱饵蛋白,ZNF451的抗体做免疫沉淀,对靶蛋白γ-H2AX进行蛋白质印迹检测;Input. 阳性对照,用ZNF451和γ-H2AX的抗体进行蛋白质印迹检测 图 5 HeLa细胞中ZNF451和γ-H2AX免疫共沉淀图 Figure 5 Co-immunoprecipitation of ZNF451 and γ-H2AX in HeLa cells

注:a与同一浓度下A549对照组比较,t = 6.12、10.67、4.68,P < 0.01;b与同一浓度下HeLa对照组比较,t = 7.94、9.81、15.12,P < 0.01 图 6 ZNF451敲低组及对照组A549(A)和HeLa(B)细胞经不同浓度依托泊苷处理后γ-H2AX的蛋白表达 Figure 6 The expression levels of γ-H2AX in ZNF451 knocked-down A549 (A) and HeLa (B) cells treated with different constructions of etoposide

4. ZNF451与53BP1/MDC1形成共定位参与NHEJ修复:本研究利用NHEJ/DR-GFP报告质粒探究ZNF451参与的DNA损伤修复路径,敲低ZNF451会降低NHEJ的修复效率,敲低组的修复效率相当于对照组的76%(t = 18.60,P < 0.05),而HR的修复效率不受影响。以6 Gy γ射线和50 μmol/L依托泊苷分别处理细胞6 h,ZNF451与53BP1和MDC1的foci在合成图中存在共定位现象(图 7)。表明ZNF451通过与DNA损伤修复因子53BP1和MDC1共定位参与到NHEJ修复中。

A、B. A549、HeLa细胞中ZNF451和53BP1免疫荧光定位图;C、D. A549、HeLa细胞中ZNF451和MDC1免疫荧光定位图 图 7 辐射或依托泊苷处理对ZNF451与53BP1/MDC1蛋白共定位的影响荧光标记二抗染色×100 A, B. Immunofluorescence staining of the localizations of ZNF451 and 53BP1 in A549 and HeLa cells, respectively; C, D. Immunofluorescence staining of the localizations of ZNF451 and MDC1 in A549 and HeLa cells, respectively Figure 7 Influences of radiation or etoposide on the co-localization of ZNF451 and 53BP1/MDC1 protein in A549 and HeLa cells ×100

讨论

人类基因组DNA损伤可分为两大类:机体代谢引起的内源性损伤和环境因素引起的外源性损伤[12]。如果不及时修复DNA损伤,DSB会触发复杂的DNA损伤反应网络,包括DNA损伤的感知、DNA修复因子的组装、细胞凋亡、细胞周期传递的阻滞和DNA损伤修复的激活,以维持基因组的完整性[13-14]

文献表明,ZNF451可能在调节DNA损伤修复和蛋白酶体降解的SUMO相关功能中发挥重要作用[15]。在不存在蛋白酶体的情况下,敲低ZATT会导致依托泊苷治疗中的细胞增敏现象和DSB修复的延迟[16]。因此,阐明ZNF451信号在DNA损伤修复中的作用对癌症的放化疗至关重要。使用临床化疗药物依托泊苷处理A549和HeLa细胞,ZNF451表达降低与依托泊苷处理的时间和剂量相关。本研究显示,ZNF451在受到DNA损伤刺激后,可以被招募到DNA损伤位点参与DNA损伤修复,降低ZNF451的表达,显著抑制了A549和HeLa细胞的增殖活力。这表明ZNF451作为一种调控因子参与DNA损伤修复和细胞的生长增殖过程。

DNA损伤反应是一系列信号级联放大途径,将各种DNA损伤修复因子准确有序地募集到DNA损伤位点。当DNA损伤发生时,PIKKs家族的成员如共济失调毛细血管扩张症突变基因(ATM)、共济失调毛细血管扩张症和Rad3相关激酶基因(ATR)、DNA依赖性蛋白激酶(DNA-PK)和聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)被激活[17],其中H2AX的Ser 139被ATM/ATR磷酸化并转化为γ-H2AX[18-19]。本研究显示,敲低ZNF451,γ-H2AX的表达水平增加,表明敲低ZNF451增强了A549和HeLa细胞对依托泊苷治疗诱导的DNA损伤。此外,免疫荧光结果与免疫共定位结果分别显示,ZNF451和γ-H2AX在DNA损伤后存在共定位和内源性的相互作用,进一步证实ZNF451直接参与了DNA损伤修复。

在真核生物中,HR和NHEJ是细胞修复DNA双链断裂的两种主要方式[20]。P53结合蛋白1(53BP1)是促进NHEJ的DSB加工反应的重要因素[21]。DNA损伤检查点介质1(MDC1)可以特异性识别γ-H2AX,并通过C端串联的两个乳腺癌易感基因羧基端(BRCT)结构域将其与DSB位点结合[22]。然后MDC1激活RNF8/RNF168介导的染色质泛素化,从而诱导53BP1募集到DNA损伤位点[22-24]。在本研究中,构建了I-SceI-HR/NHEJ报告基因系统,通过流式细胞术分析了细胞的荧光比,结果表明ZNF451影响NHEJ的修复效率,但不影响HR的修复效率。ZNF451与53BP1和MDC1在辐射和依托泊苷处理后有明显的共定位。这些结果证明ZNF451是γ-H2AX招募启动下游修复因子53BP1和MDC1的关键调节因子。

本研究表明在A549和HeLa细胞中敲低ZNF451的表达可阻断NHEJ修复通路,从而增强辐射或依托泊苷导致的DNA损伤水平。基于上述研究,推测ZNF451/MDC1/53BP1通路可能在增强A549和HeLa细胞放化疗敏感性研究中具有潜在的研究价值,ZNF451参与DNA损伤修复的具体机制还需进一步阐明。

利益冲突  无

作者贡献声明  夏琪负责实验和数据分析,撰写论文;赵国平指导实验和论文修改;吴李君负责实验设计

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