2022, Vol. 42
2. 军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所 北京市放射生物学重点实验室，北京 100850
2. Beijing Key Laboratory for Radiobiology, Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, Beijing 100850, China
DNA双链断裂(DSBs)是最严重的DNA损伤类型之一，由外源性因素及内源性代谢应激产生[1-2]。DSB修复缺陷导致基因组不稳定，细胞修复DSBs对于维持基因组稳定和影响细胞放射敏感性密切相关[3-4]。DSBs主要由非同源末端连接(NHEJ)和同源重组(HR)两种途径修复[5]。NHEJ是一种易错的修复方式，其可发生于细胞分裂的所有阶段[6-8]。与NHEJ相比，HR修复是一种更为保守和无错的修复[9-10]。
TAB182是一个与多聚ADP核糖聚合酶家族成员TNKS1相互作用的蛋白，因此又称TNKS1BP1[11-14]。TAB182通过肌动蛋白骨架重排调节癌细胞的侵袭[11]；腺病毒感染后，TAB182被靶向降解；且TAB182是分解代谢阻抑物4的一个组成部分，具有调节转录功能、去腺苷酸化和E3连接酶活性[15]。在HeLa细胞中，辐射照射后TAB182表达上调，TAB182的缺失增加癌细胞的放射敏感性。在A549细胞中，TAB182通过抑制RAD51焦点(foci)的形成影响同源重组途径，调节基因组的稳定性[16-17]。且TAB182缺失的细胞过表达TAB182可以恢复G2/M检查点及放射抗性[18]。通过公共数据库的数据发现，TAB182高表达与乳腺癌患者的生存率呈现正相关关系(Proteinatlas.Version: 20.1：http://www.proteinatlas.org/)。TAB182在DSB修复中发挥着重要作用，本研究旨在阐述TAB182如何调控DSBs的HR修复及反应机制，为TAB182作为临床放疗中的治疗靶点提供参考。
材料与方法1. 试剂：anti-TAB182购自美国Santa Cruz公司，anti-actin购自北京中杉金桥公司，anti-RPA2/32、anti-RAD51购自英国Abcam公司，anti-BrdU购自武汉Proteintech公司，anti-FLAG购自美国Sigma公司；Anti-Alexa FluorTM488，Anti-Alexa Fluor@568，购自美国Life technology公司；嘌呤霉素、lipofectmine2000 (11668-019) 购自美国Invitrogen公司，放射菌素D(Act-D)购自美国Selleck公司，Olaparib购自美国Selleck公司，反转录试剂、qPCR试剂购自日本TOYOBO公司，凋亡试剂、周期试剂购自日本DOJINDO公司。
2. 细胞培养：人乳腺癌细胞(MCF-7细胞)购自美国模式培养物集存库(ATCC)细胞库，由本实验室保存。MCF-7细胞在含有10%胎牛血清，100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的高糖培养基DMEM中生长，细胞培养均在37℃，5% CO2的细胞培养箱中进行。
3. 细胞照射：在军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所用60Co γ射线进行8 Gy单次照射，60.3 cGy/min，源靶距3 m，照射后4 h收样。
4. 慢病毒的培养与感染：TAB182的慢病毒液购自苏州吉玛基因公司，TAB182 shRNA序列为：5′AAGACGAGGAGUAAUCUUCACCCUG 3′(sense)，将TAB182慢病毒液感染MCF-7细胞，加入2 μg/ml嘌呤霉素进行筛选得到稳定表达的细胞系。shRNA慢病毒感染后筛选TAB182敲低的MCF-7细胞为TAB182沉默组，加入慢病毒阴性对照物TAB182未敲低的MCF-7细胞为TAB182阴性对照组。
5. qRT-PCR：细胞经过处理后，磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗3遍，加入TRIzol裂解液，按照RNA提取步骤提取RNA，用NANO Drop 2000C(美国赛默飞科技公司)测定RNA浓度。将得到的RNA储存在-80℃或进行下一步实验，按试剂盒说明书进行反转录及qRT-PCR反应。RPA2上游引物：5′AGGGAGAGCACCTATCAGCA 3′，下游引物：5′AGATGTGCCCCTCATTGCTC 3′。β-肌动蛋白上游引物：5′TGGCACCCAGCACAATGAA 3′，下游引物5′CTAAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA 3′。反应完成后，对实验数据以2-ΔΔCt法计算出目的基因mRNA表达水平的相对变化。此实验检测RPA2基因在mRNA的表达。
6. 放射菌素D处理：在对照组细胞及TAB182沉默组细胞中添加RNA合成抑制剂放射菌素D(Act-D)处理，在不同时间点收取细胞，qRT-PCR检测RPA2 mRNA表达水平的相对变化。
7. 免疫印迹实验：细胞经过处理后，用PBS洗3遍，收集细胞，3 000 r/min、离心半径6 cm，离心3 min，弃上清。加入适量细胞裂解液，冰上裂解15~20 min，12 000 r/min，离心半径6 cm，离心10 min，取上清，用BCA法沉淀蛋白浓度。加入5 × SDS上样缓冲液(loading buffer)沸水中煮10 min，每孔按40 μg的蛋白进行凝胶电泳，随后转移至硝酸纤维素膜(NC)膜上，用牛奶室温封闭1 h，然后与配好的一抗4℃孵育过夜。次日，等渗盐溶液加Tris-HCl缓冲液(TBST)清洗3次后，加入相应二抗，室温孵育1 h，TBST清洗3次，显影液按1 ∶1的比例配制，显影，观察结果。此实验用于检测RPA2蛋白水平的表达。
8. 免疫荧光实验：取对数生长期的各组细胞，接种于6孔培养板中；次日，60 Co γ射线8 Gy照射后4 h吸去细胞培养液，PBS溶液洗涤3次，加入4%多聚甲醛后常温固定30 min；用通透液(0.25% Triton X-100/PBS)通透15 min，用牛血清蛋白(BSA)封闭液37℃封闭1 h，然后与稀释好的一抗4℃孵育过夜；加入稀释好的二抗，室温避光孵育1 h；封片，4℃保存；使用共聚焦显微镜观察各组细胞。此实验用于检测RPA2、Rad51、BrdU荧光水平的表达。
9. 集落形成实验：用PBS将对数生长期细胞洗3遍，用胰酶消化制备成细胞悬液，进行细胞计数，将细胞接种于6孔板中，接种密度为每孔200、200、400、1 000和2 000个细胞，12 h后进行0、1、2、4和8 Gy照射处理，并继续培养10 d，姬姆萨染液固定染色，计数各组细胞克隆数量并进行分析。
10. 细胞凋亡：将对数生长期的细胞以每升1×105的密度接种于6孔板中，12 h后进行8 Gy照射，24及48 h后用胰酶消化，1 000 r/min，离心半径11 cm，离心3 min，去上清，PBS清洗两遍。每个样本依次加入500 μl结合缓冲液(binding buffer)、5 μl磷脂结合蛋白-异硫氰酸荧光素(annexin V-FITC)、5 μl碘化丙啶(PI)，用TAB182阴性对照组照射后的细胞额外分出3组，一组不加染液，一组加入磷脂结合蛋白-异硫氰酸荧光素染液及一组加入碘化丙啶，室温混匀避光反应15 min，上机检测。
11. 细胞周期检测：用PBS将对数生长期细胞洗3遍后用胰酶消化制备成细胞悬液，传代至培养皿中，待细胞生长密度达到60%~80%时，对细胞进行8 Gy 60Co γ射线照射，照后4、8、12、24 h收取细胞，未照射细胞设为对照组。细胞经PBS洗3遍，胰酶消化后加入培养基终止消化，3 000 r/min，离心半径6 cm，离心3 min。收集的细胞用70%的乙醇4℃固定过夜。第2天加入300 μl含RNAase的PI溶液重悬细胞，室温孵育10~30 min，流式细胞仪检测细胞周期的变化。
12. 统计学处理：采用SPSS 24.0统计软件进行分析，数据符合正态分布，计量资料以x±s表示。两组间比较采用独立样本t检验。计数资料采用百分率表示，组间比较采用χ2检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1. TAB182影响HR修复蛋白RPA2的表达：对TAB182沉默组细胞进行了RNA测序，发现DNA损伤修复相关蛋白RPA2 mRNA表达降低。在TAB182沉默组的细胞中，RPA2的mRNA表达水平降低了73%，差异具有统计学意义(t=17.97，P < 0.05)；相比于TAB182阴性对照组，TAB182沉默组细胞的RPA2蛋白水平也降低了97%，见图 1。相比于TAB182阴性对照组，TAB182沉默组中RPA2的foci显著降低，见图 2。提示TAB182的减少导致作为HR修复途径中的重要蛋白RPA2减少，可能影响DNA损伤的HR修复途径。
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注：1.TAB182阴性对照组；2.TAB182沉默组 图 1 RPA2蛋白在TAB182阴性对照组和TAB182沉默组表达的变化 Figure 1 RPA2 protein expression in TAB182 negative control group and TAB182 knockdown group |
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Anti-Alexa Fluor 488 568二抗染色×100 图 2 RAP2 foci在TAB182阴性对照组和TAB182沉默组表达的变化 Anti-Alexa Fluor 488 568 secondary antibody ×100 Figure 2 RPA2 foci expression in TAB182 negative control group and TAB182 knockdown group |
2. TAB182的缺失导致同源重组修复异常：相比于TAB182阴性对照组，在TAB182沉默组的细胞中，Rad51在细胞核的定位显著减少，见图 3。照射后，TAB182阴性对照组的BrdU foci水平显著高于TAB182沉默组的细胞，见图 4。提示TAB182的缺失可影响HR修复过程中的关键蛋白Rad51及BrdU的形成，导致同源重组修复异常。
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Anti-Alexa Fluor 488 568二抗染色×100 图 3 Rad51 foci在TAB182阴性对照组和TAB182沉默组的表达变化 Anti-Alexa Fluor 488 568 secondary antibody ×100 Figure 3 Rad51 foci expression in TAB182 negative control group and TAB182 knockdown group |
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Anti-Alexa Fluor 488 568二抗染色×100 图 4 BrdU foci在TAB182阴性对照组和TAB182沉默组形成的变化 Anti-Alexa Fluor 488 568 secondary antibody ×100 Figure 4 The formation of BrdU foci in TAB182 negative control group and TAB182 knockdown group |
3. TAB182对RPA2 mRNA稳定性的影响：在TAB182阴性对照组及TAB182沉默组细胞中分别转染不同浓度的FLAG-RPA2质粒，结果表明TAB182不影响RPA2的外源性表达，见图 5。相比于TAB182阴性对照组，放射菌素D处理后第4、8、12小时，TAB182沉默组细胞中的RPA2 mRNA的衰减加快，差异具有统计学意义(t=5.37、3.79、3.69，P < 0.05)，见图 6。且TAB182沉默组RPA2 mRNA衰减一半的速度是TAB182阴性对照组的3倍(2 h和6 h)，差异具有统计学意义(t=3.48，P < 0.05)。表明TAB182通过维持RPA2 mRNA的稳定性，从而促进同源重组修复。
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图 5 FLAG-RPA2在TAB182阴性对照组和TAB182沉默组表达的变化 Figure 5 FLAG-RPA2 expression in TAB182 negative control group and TAB182 knockdown group |
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注：a与同一时间TAB182阴性对照组比较，t=5.37、3.79、3.69，P < 0.05 图 6 Act-D处理后不同时间RPA2 mRNA在TAB182阴性对照组和TAB182沉默组表达的变化 Figure 6 RPA2 mRNA expression in TAB182 negative control group and TAB182 knockdown group at different times after Act-D treatment |
4. TAB182沉默对细胞放射敏感性的影响：照射后TAB182沉默组的细胞凋亡率较TAB182阴性对照组显著增高，差异具有统计学意义(12.94% vs.7.24%；t=11.05，P < 0.001)，见图 7。相比于TAB182阴性对照组，TAB182沉默组的细胞在第24小时周期G2/M的阻滞时间延长，差异具有统计学意义(t=8.40，P < 0.01)，见图 8。相比于TAB182阴性对照组，TAB182沉默组的细胞对辐照更加敏感，差异具有统计学意义(t=8.18，P < 0.05)，见图 9。上述结果揭示了TAB182缺失的细胞对辐照十分敏感。
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图 7 照射对TAB182阴性对照组和TAB182沉默组细胞凋亡的影响 Figure 7 Effects of irradiation on apoptosis of cells in TAB182 negative control group and TAB182 knockdown group |
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注：a与TAB182阴性对照组比较，t=8.40，P < 0.01 图 8 照射后不同时间TAB182阴性对照组和TAB182沉默组细胞周期的比例变化 Figure 8 Cell cycle distributions of TAB182 negative control group and TAB182 knockdown group at different times after irradiation |
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注：a与TAB182阴性对照组比较，t=8.18，P < 0.05 图 9 照射对TAB182阴性对照组和TAB182沉默组细胞存活率的影响 Figure 9 Effects of irradiation on the survival rate of TAB182 negative control group and TAB182 knockdown group |
讨论
研究表明，TAB182作为一种DNA损伤修复相关蛋白参与DNA双链断裂修复，在A549细胞中通过HR途径参与DNA双链断裂修复，且主要是通过抑制Rad51 foci的形成[16]，但其具体机制还不清楚。本研究发现，在TAB182沉默的乳腺癌MFC-7细胞中RPA2的表达降低。Rad51作为RPA2下游蛋白，RPA2的减少导致Rad51招募到DNA损伤位点减少，与之前的研究报道TAB182通过抑制Rad51 foci的形成参与HR修复结果相吻合。BrdU是单链DNA标志物，HR修复途径末端剪切后生成单链DNA，照射后发现，TAB182沉默组的细胞BrdU foci数量显著少于TAB182阴性对照组，说明在DNA损伤后，由于TAB182的缺失导致RPA2的降低，DNA断裂末端ssDNA可能因未受保护而被降解，或者可能影响到HR途径上游的末端剪切过程。上述研究表明，TAB182可能通过影响RPA2的表达参与HR修复，但TAB182调节RPA2蛋白水平的机制还不清楚。
本研究添加mRNA合成抑制剂Act-D观察TAB182阴性对照组以及TAB182沉默组的MCF-7细胞中RPA2 mRNA稳定性，结果表明TAB182的缺失使RPA2 mRNA半衰期变短，说明TAB182通过促进RPA2 mRNA的稳定性进而促进RPA2的蛋白表达。在TAB182沉默组的MCF-7细胞系中梯度转染外源性FLAG-RPA2质粒，发现TAB182的缺失不影响外源性RPA2的表达。因与细胞内源RPA2基因不同，外源FLAG-RPA2表达载体中只含有RPA2的外显子区域，因此推测TAB182还有可能参与RPA2 mRNA的剪接与成熟过程。
TAB182通过维持RPA2 mRNA的稳定性参与HR修复。TAB182的缺失会损害同源重组修复，因此TAB182对细胞的生存十分重要。凋亡及集落形成实验发现，TAB182沉默组的细胞表现出更强的放射敏感性。但形成的细胞集落大小大于TAB182阴性对照组，与之前研究报道的TAB182的缺失可以加快细胞的S期进程，促使细胞的增殖加快相一致[17]。细胞周期检测结果表明，TAB182的缺失可延长电离辐射诱发MCF-7细胞的G2/M周期阻滞，此结果与本实验室前期报道在TAB182沉默的HeLa细胞中可引起G2/M期阻滞延长相吻合[19]。有研究报道TAB182可以通过G2/M期细胞累积，调节癌细胞的放射敏感性[18]。通过数据库挖掘的数据发现TAB182与乳腺癌患者的生存呈正相关，分子水平也验证了TAB182对乳腺癌细胞的生存十分重要。
同源重组修复(HR)在DNA双链断裂(DSBs)的修复中发挥重要作用。HR修复依赖姐妹染色单体，这种特性限制了HR修复只能发生在S/G2期[20-21]。HR修复通过末端剪切形成的3′ ssDNA将被RPA复合物包裹，RPA复合物由RPA1、RPA2和RPA3亚单位组成[22]。RPA2是一种ssDNA结合蛋白，可以保护3′ssDNA末端免被降解，并防止ssDNA自身退火形成二级结构[23]。随后，RPA复合物会被RAD51所取代，RAD51与DNA相互作用形成RAD51核纤丝结构，RAD51能促进ssDNA与同源DNA模板的结合，从而促进D环的形成[24-25]。RPA2作为HR途径的核心分子发挥着重要作用。本研究揭示了TAB182能促进RPA2 mRNA稳定性，维护HR修复功能。
总而言之，TAB182通过调控RPA2 mRNA的稳定性参与HR途径介导的DNA双链断裂修复，且TAB182缺失的肿瘤细胞对电离辐射高度敏感。在未来的工作中，需进一步探索TAB182是如何正确精准地进行DNA修复，降低肿瘤细胞的DNA损伤修复能力，从而为抗肿瘤治疗提供一个更好的应用前景。
利益冲突 无
作者贡献声明 李刚负责实验操作，撰写论文；赖淑婷、韩阳协助实验操作；白琛俊、关华提供相关建议；高山山、周平坤指导课题设计和修改论文
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