2022, Vol. 42
大规模核辐射事故可能导致大人群受到电离辐射，对潜在受照人员进行伤情分类，是医学处置和临床救治的重要依据，现有生物学方法不能满足快速、高通量的要求。因此，探索新的生物学方法和指标，是解决该问题的关键[1-2]。脂质化合物参与机体能量调节、信息传导等生理过程，具有重要的生物学功能，脂质代谢异常与糖尿病、肥胖等疾病密切相关[3-4]。脂质组学可全面解析机体脂质分子及其功能，揭示生命活动本质[5]，已在生物标志物、疾病早期诊断等领域广泛应用[6-7]，对生命科学和临床研究具有重大意义。脂质组学的研究方法主要包括非靶向和靶向，非靶向脂质组学能够得到丰富的质谱信息，但存在数据复杂、重复性差等缺点；靶向脂质组学具有线性范围宽、重复性好等优势，但需要使用内标化合物[8]。本研究采用脂质组学方法，筛选全身受照大鼠血浆辐射敏感脂质，应用脂质组合模型进行剂量分类，并分析其剂量-效应关系，为辐射损伤标志物研究和大规模核辐射事故伤员分类提供实验依据。
材料与方法1. 实验动物：SPF级雄性SD大鼠75只，6~8周龄、200~250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司(生产许可证号为SYXK京2016-0006)。其中50只大鼠用于非靶向脂质组学，25只用于靶向脂质组学。本研究所有动物实验已通过中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所实验动物伦理福利委员会的审查(2019-001号)。
2. 照射条件和分组：在北京市辐射中心用60Co γ射线(剂量率为1 Gy/min)对大鼠进行全身照射。非靶向脂质组学研究中，将大鼠分为6组，每组8~9只，照射剂量为0、1、2、3、5和8 Gy；靶向脂质组学研究中，将大鼠分为5组，每组5只，照射剂量为0、0.5、2.5、4和6 Gy。
3.血浆制备：大鼠受照后4 h，采集眼内眦静脉血约1 ml置于乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，离心半径15 cm、4 ℃、3 000 r/min离心10 min，分离血浆置于-80 ℃。上样前取血浆100 μl，解冻后加入1 ml甲基叔丁基醚和300 μl甲醇，混匀后4 ℃、离心半径5 cm、12 000 r/min离心10 min，取上清400 μl挥干后加入100 μl甲醇复溶。取所有血浆样本各10 μl，混匀后作为质量控制样本。脂质内标包括PC(12：0/13：0)、PE(12：0/13：0)、SM(d18：1/12：0)和Cer(d18：1/12：0)，购自美国Avanti公司。
4.液相色谱-质谱联用(LC-MS)：用超快速液相色谱-电喷雾离子源四极杆轨道离子阱质谱(ThermoFisher，美国)对血浆样本进行分析，色谱柱为UPLC HSS T3(美国Waters公司)。流动相A为乙腈∶水(6 ∶4)、甲酸(0.1%)和乙酸铵(10 mmol/L)；流动相B为乙腈∶异丙醇(9 ∶1)、甲酸(0.1%)和乙酸铵(10 mmol/L)。洗脱程序为：0 min，80%流动相A；2 min，70%流动相A；5 min，55%流动相A；6.5 min，40%流动相A；12 min，35%流动相A；14 min，15%流动相A；17.5 min，0%流动相A；18~19.5 min，80%流动相A。色谱分离后进行一级全扫描，质荷比扫描设定为50~1 500。
5. 统计学处理：应用Progenesis QI和Skyline软件进行数据处理，SIMCA-P 14.1和SPSS 26.0统计软件进行数据分析。筛选差异脂质标准为：变量权重值(VIP)>1，以及8与0 Gy组峰面积t检验错误发现率(FDR) < 0.05。用人类代谢组数据库(HMDB)及脂质数据库(Lipidmaps)进行脂质鉴定。代谢通路和受试者工作特征曲线(ROC)分析应用MetaboAnalyst5.0。多组间脂质相对浓度的比较用单因素方差分析，用LSD-t检验进行两两比较。建立脂质相对浓度和剂量之间的回归方程。P < 0.05为差异具有统计学意义。
结果1. 辐射差异脂质的筛选：为探索大鼠受照后脂质变化，对0~8 Gy组血浆样本进行非靶向脂质组学分析。主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)结果显示，大鼠受到全身照射后血浆脂质发生明显变化，0 Gy与8 Gy组能够被区分，但不同剂量组间聚集程度不明显，部分组间有所重叠(图 1)。根据VIP>1且FDR < 0.05的条件，共筛选出15个差异脂质(表 1)，包括3个溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LysoPC)、4个磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、3个磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)、1个溶血磷脂酰乙醇胺(lysophosphatidylethanolamine，LysoPE)、4个鞘磷脂(sphingomyelin，SM)。其中上调的有7个、下调的有8个(图 2)。将差异脂质进行代谢通路分析，发现大鼠受照后有6条脂质代谢通路发生变化，包括甘油磷脂代谢、亚油酸代谢、亚麻酸代谢、糖基磷脂酰肌醇生物合成、鞘脂类代谢和花生四烯酸代谢。
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A.主成分分析；B.正交偏最小二乘方判别分析 图 1 不同剂量γ射线全身照射大鼠后血浆脂质变化 A.Principal component analysis; B.Orthogonal partial least squares discriminant analysis Figure 1 Lipid changes in rat plasma after 0-8 Gy TBI |
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表 1 8 Gy γ射线照射后大鼠血浆差异脂质参数 Table 1 Differential lipids in ratplasma exposure to 8 Gy γ-ray total body irradiation |
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注：L1. LysoPC(18：2)；L2. LysoPC(20：5)；L3. LysoPC(22：0)；L4. LysoPE(20：4/0：0)；L5. LysoPE(20：4/0：0)；L6. PC(18：0/18：2)；L7. PC(18：0/22：5)；L8. PC(20：4/18：0)；L9. PE(18：2/16：0)；L10. PE(18：2/18：0)；L11. PE(18：2/18：1)；L12. SM(d18：0/16：1)；L13. SM(d18：1/20：0)；L14. SM(d18：1/22：1)；L15. SM(d18：1/23：0) 图 2 大鼠受照后血浆差异脂质热图分析 Figure 2 Heatmap of differential lipids in rat plasma after total body irradiation |
2. 辐射敏感脂质的确定：为对辐射差异脂质进行进一步验证，应用靶向脂质组学方法对另一批次受到0~6 Gy γ射线照射的大鼠血浆进行定量分析，从而降低假阳性结果，辐射差异脂质浓度见表 2。15个辐射差异脂质中，其中LysoPC(18：2)、LysoPC(20：5)、LysoPC(22：0)、PC(18：0/18：2)、PE(18：2/16：0)、PE(18：2/18：0)、PE(18：2/18：1)等7个脂质在受到6 Gy γ射线照射后显著下调(t=3.29、2.43、4.66、5.14、3.78、2.60、4.20，P < 0.05)，变化趋势与非靶向脂质组学结果一致，被认为本研究的辐射敏感脂质。
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表 2 各剂量组大鼠γ射线全身照射后血浆辐射敏感脂质浓度及其变异系数(μmol/L，x±s) Table 2 Concentrations and coefficients of radiation sensitive lipids in rat plasma irradiated with 0-6 Gy γ -rays(μmol/L, x±s) |
根据公式：变异系数=均数/标准差×100%，由各组脂质浓度均值和标准差计算得到变异系数。7个辐射敏感脂质的变异系数分别为9.98%、6.56%、10.46%、8.28%、27.28%、16.76%、27.32%。辐射敏感脂质在0 Gy组变异系数的平均值为14.07%，略低于在照射组变异系数的平均值(15.53%)，但差异无统计学意义(P> 0.05)，辐射敏感脂质变异系数随照射剂量的上升无明显变化规律。
3.辐射敏感脂质受试者工作特征曲线分析：对7个辐射敏感脂质进行ROC分析，区分0 Gy与>0 Gy组、< 2 Gy与≥ 2 Gy组的曲线下面积(area under curve，AUC)均>0.75(表 3)。将7个辐射敏感脂质组合后进行ROC分析，区分0 Gy与>0 Gy组、< 2 Gy与≥ 2 Gy组的AUC值为0.96和0.94。
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表 3 不同剂量大鼠血浆辐射敏感脂质受试者工作特征曲线分析 Table 3 The receiver operating characteristic curve of radiation sensitive lipids |
4.辐射敏感脂质的剂量-效应关系：7个辐射敏感脂质中，有5个具有良好的剂量-效应关系(R2> 0.80)，分别为LysoPC(18：2)、LysoPC(22：0)、PC(18：0/18：2)、PE(18：2/16：0)和PE(18：2/18：0)。在0~6 Gy范围内，其浓度均随照射剂量的上升而下降，剂量-效应回归方程见表 4。其中，LysoPC(22：0)的R2值最高，为0.968。与0 Gy组相比，PE(18：2/18：1)浓度在0.5 Gy及以上组均显著下调(t=2.15、3.42、4.13、4.20，P < 0.05)，LysoPC(22：0)、PC(18：0/18：2)、PE(18：2/16：0)在2.5 Gy及以上组均显著下调(t=2.33、2.68、4.66、4.04、4.03、5.14、3.10、3.65、3.78，P < 0.05)，PE(18：2/18：0)在4 Gy及以上组均显著下调(t=3.08、2.60，P < 0.05)。
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表 4 大鼠血浆辐射敏感脂质剂量-效应回归方程 Table 4 Dose-response regression equations of radiation sensitive lipids in rat plasma |
讨论
大规模核辐射事故后，对潜在暴露人员进行快速、有效的医学分类，能挽救成千上万人的生命[9]。一般认为，人体受到2 Gy以上的照射，可能导致急性放射病，需要立即给予治疗，否则可能引起严重损伤甚至死亡[10]。因此，对受到>2 Gy照射的人群进行医学分类及其关键。脂质组学可通过无创或微创获得尿液或血液样本，反映机体脂质代谢变化，具有快速、高通量的优势，可筛选出大量潜在辐射生物标志物[11]。本研究组前期已应用脂质组学或代谢组学方法筛选了大鼠小肠组织或血浆中的辐射敏感标志物[12-13]，在前期研究基础上，本研究以全身照射大鼠为模型，分析了受照后早期血浆脂质代谢特征，应用辐射敏感脂质组合进行剂量分类，并探索了其剂量-效应关系。
本研究应用非靶向脂质组学方法，筛选出15个大鼠血浆辐射差异脂质，进一步用另一批次大鼠进行靶向脂质组学验证后，发现其中7个脂质具有良好的稳定性和可重复性，表明其具备辐射敏感标志物的基本要求。PC和PE是细胞膜的重要组分，参与生物体内信号传导、信息传递等。LysoPC及LysoPE均属于溶血磷脂，分别由PC、PE被磷脂酶A等降解后形成，具有调控T细胞功能、改变脂筏结构及细胞膜流动性等功能[14]。SM是以神经鞘氨醇为骨架的化合物，是神经酰胺的重要来源，在细胞凋亡中具有重要作用[15]。
在辐射生物标志物研究中，个体变异性是一个重要因素。本研究筛选出了5个辐射差异脂质变异系数 < 20%，提示其在个体间的变化相对稳定，是成为辐射生物标志物的优势条件。本研究结果还提示辐射敏感脂质在不同个体间的差异主要来源于大鼠自身，而电离辐射对脂质变异系数的影响相对较小，下一步将对辐射敏感脂质的影响因素进行深入分析。
为探索辐射敏感脂质对特定照射剂量的分类能力，对其进行ROC分析。AUC值越大则分类的准确性和可靠性越高。应用单一辐射敏感脂质对0 Gy与> 0 Gy组、< 2 Gy与≥ 2 Gy组进行分类准确性最高为PC(18：0/18：2)，AUC值分别为0.95和0.93。研究表明，在应用代谢物进行分组鉴别时，可用一组标志物代替单一标志物[16-17]。本研究将7个辐射敏感脂质进行组合后，对相应剂量分类的AUC值分别为0.96和0.94，将辐射敏感脂质组合后，可提高分类的准确性和可靠性，提示上述脂质及其组合有可能作为特定辐射剂量分类的潜在生物标志物。
本研究筛选出的LysoPC(18：2)、LysoPC(22：0)、PC(18：0/18：2)、PE(18：2/16：0)和PE(18：2/18：0)等5个大鼠血浆辐射敏感标志物，在受到0~6 Gy γ射线照射后4 h具有良好的剂量-效应关系。理想的辐射标志物应具有明确的时间响应范围，但由于辐射敏感脂质在受到照射后会随时间变化，因此还需探索受照射后不同时间点的辐射敏感脂质及其变化规律。此外，脂质组学方法还存在一定的局限性[18]，需要进行大量的人体样本研究和盲法验证，才有可能成为潜在的辐射生物剂量计，应用于核辐射事故伤员的生物剂量估算。
综上，本研究应用脂质组学方法，对大鼠受到电离辐射后4 h血浆脂质代谢特征进行分析，筛选出LysoPC(18：2)、LysoPC(20：5)、LysoPC(22：0)、PC(18：0/18：2)、PE(18：2/16：0)、PE(18：2/18：0)、PE(18：2/18：1)等7个辐射敏感脂质，应用其组合可对0 Gy、2 Gy射线照射样本进行剂量分类，LysoPC(18：2)、LysoPC(22：0)、PC(18：0/18：2)、PE(18：2/16：0)和PE(18：2/18：0)具有良好的剂量-效应关系。本研究为辐射生物标志物研究和应用辐射敏感脂质对潜在暴露人员进行受照剂量快速分类提供了实验基础。
利益冲突 无
作者贡献声明 赵骅负责实验操作和论文撰写；习聪、刘海翔、陆雪协助实验动物处理和样本制备；田梅、刘青杰指导课题设计和论文修改
| [1] |
Wathen LK, Eder PS, Horwith G, et al. Using biodosimetry to enhance the public health response to a nuclear incident[J]. Int J Radiat Biol, 2021, 97(sup1): S6-S9. DOI:10.1080/09553002.2020.1820605 |
| [2] |
Satyamitra MM, Cassatt DR, Hollingsworth BA, et al. Metabolomics in radiation biodosimetry: current approaches and advances[J]. Metabolites, 2020, 10(8): 328. DOI:10.3390/metabo10080328 |
| [3] |
Lu J, Lam SM, Wan Q, et al. High-Coverage Targeted lipidomics reveals novel serum lipid predictors and lipidpathway dysregulation antecedent to type 2 diabetes onset in normoglycemic Chinese adults[J]. Diabetes Care, 2019, 42(11): 2117-2126. DOI:10.2337/dc19-0100 |
| [4] |
Liakh I, Sledzinski T, Kaska L, et al. Sample preparation methods for lipidomics approaches used in studies of obesity[J]. Molecules, 2020, 25(22): 5307. DOI:10.3390/molecules25225307 |
| [5] |
Han X, Gross R W. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry: a bridge to lipidomics[J]. J Lipid Res, 2003, 44(6): 1071-1079. DOI:10.1194/jlr.R300004-JLR200 |
| [6] |
Huang J, Wang Q, Qi Z, et al. Lipidomic profiling for serum biomarkers in mice exposed to ionizing radiation[J]. Dose Response, 2020, 18(2): 1559325820914209. DOI:10.1177/1559325820914209 |
| [7] |
Upadhyay M, Rajagopal M, Gill K, et al. Identification of plasma lipidome changes associated with low dose space-type radiation exposure in a murine model[J]. Metabolites, 2020, 10(6): 252. DOI:10.3390/metabo10060252 |
| [8] |
Hornemann T. Lipidomics in Biomarker Research[J]. Handb Exp Pharmacol, 2022, 270: 493-510. DOI:10.1007/164_2021_517 |
| [9] |
Swartz HM, Williams BB, Flood AB. Overview of the principles and practice of biodosimetry[J]. Radiat Environ Biophys, 2014, 53(2): 221-232. DOI:10.1007/s00411-014-0522-0 |
| [10] |
Singh VK, Seed TM. An update on sargramostim for treatment of acute radiation syndrome[J]. Drugs Today (Barc), 2018, 54(11): 679-693. DOI:10.1358/dot.2018.54.11.2899370 |
| [11] |
Vicente E, Vujaskovic Z, Jackson IL. A systematic review of metabolomic and lipidomic candidates for biomarkers in radiation injury[J]. Metabolites, 2020, 10(6): 259. DOI:10.3390/metabo10060259 |
| [12] |
习聪, 赵骅, 陆雪, 等. 60Co γ射线全身照射大鼠的小肠组织中辐射敏感脂质代谢物的筛选[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2021, 41(3): 172-177. Xi C, Zhao H, Lu X, et al. Screening of radiosensitive lipid metabolites in rat small intestine after total body irradiation with 60Co γ-rays[J]. Chin J Radiol Med Prot, 2021, 41(3): 172-177. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2021.03.003 |
| [13] |
赵骅, 习聪, 田雪蕾, 等. 全身照射后大鼠血浆代谢特征分析[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2021, 41(6): 401-406. Zhao H, Xi C, Tian XL, et al. Analysis of the metabolic characteristics in rat plasma after total body irradiation[J]. Chin J Radiol Med Prot, 2021, 41(6): 401-406. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2021.06.001 |
| [14] |
Miyata N, Goda N, Matsuo K, et al. Cooperative function of Fmp30, Mdm31, and Mdm32 in Ups1-independent cardiolipin accumulation in the yeast Saccharomyces cerevisiae[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 16447. DOI:10.1038/s41598-017-16661-2 |
| [15] |
Di Paolo G, De Camilli P. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics[J]. Nature, 2006, 443(7112): 651-657. DOI:10.1038/nature05185 |
| [16] |
Li S, Lu X, Feng JB, et al. Developing gender-specific gene expression biodosimetry using a panel of radiation-responsive genes for determining radiation dose in human peripheral blood[J]. Radiat Res, 2019, 192(4): 399-409. DOI:10.1667/RR15355.1 |
| [17] |
Mak TD, Laiakis EC, Goudarzi M, et al. Selective paired ion contrast analysis: a novel algorithm for analyzing postprocessed LC-MS metabolomics data possessing high experimental noise[J]. Anal Chem, 2015, 87(6): 3177-3186. DOI:10.1021/ac504012a |
| [18] |
Wood PL, Cebak JE. Lipidomics biomarker studies: errors, limitations, and the future[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2018, 504(3): 569-575. DOI:10.1016/j.bbrc.2018.03.188 |