miRNA(microRNA)是通过识别认知序列和转录、转化或表观遗传过程的干扰来调节基因表达的小型非编码单链RNA分子^[1]。有研究表明，血清miRNA可以作为生物剂量计，用于早期评估辐射损伤^[2]。其中，miR-150-5p和miR-23a-3p通过与不同的基因之间形成靶向、调控或被调控的关系在多种肿瘤中执行不同的功能，包括乳腺癌^[3-4]、肺癌^[5-6]和其他肿瘤。此外，恒河猴经⁶⁰Co全身照射(WBI)后，血浆中miR-150随受照剂量和照后时间依赖性降低^[7]；小鼠全脑10 Gy照射30 min和6 h后，皮层和神经元中miR-23a-3p水平均快速下降^[8]。故这些miRNAs是对辐射较为敏感的分子生物指标。然而，miR-150-5p与miR-23a-3p在经射线照射后的人外周血血清中的表达情况尚不明确。本研究以某医院的肿瘤患者为研究对象，探究经放疗后外周血血清中这两种miRNAs的表达变化，为寻找电离辐射生物标志物提供实验基础。

1. 研究对象：在知情同意的原则下(河南省职业病防治研究院伦理委员会审批号：202106)，选取某三甲医院2021年10月至2022年3月行放疗的63例肿瘤患者为研究对象。研究对象纳入标准：首次接受放疗的肿瘤患者；患者卡氏(KPS)评分≥70；年龄>25岁。排除标准：曾接受过放疗的患者；有远处转移的患者；同时患有第二原发肿瘤的患者。

2. 仪器与试剂：PRISM 7500实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)；医用直线加速器(瑞典Elekta公司)；miRcute血清/血浆miRNA提取试剂盒(北京天根公司)；hsa-miR-150-5p引物(MQPS0000669)、hsa-miR-23a-3p引物(MQPS0000870)、外参cel-miR-39-3p Standard RNA及引物(MQPS0000071)、miRNA反转录试剂盒及qPCR试剂盒均购自广州市锐博生物科技有限公司。

3. 治疗方案：患者均进行肿瘤切除手术，44例患者于术后1个月进行化疗，化疗结束4~5周后进行放疗，19例未化疗患者在术后1个月进行放疗。化疗方案：主要采用AC-T方案(AC：多柔比星+环磷酰胺；T：多西他赛或紫杉醇)或TP方案(多西他赛或紫杉醇+顺铂或卡铂)，具体用药方案和用药剂量依据肿瘤类型和患者体表面积。放疗方案：所有患者均按照临床路径行规范化术后放疗，参考术中放置的金属夹、体表放置的金属标记勾画临床靶区(CTV)，放疗采用医院放射治疗科的瑞典Elakta Synergy医用直线加速器6 MV X射线进行照射，100%靶区达到95%处方剂量。处方剂量为50~60 Gy/25~30次，2 Gy/次，5次/周。

4. 血清RNA提取：分别采集放疗前和放疗后肿瘤患者外周血4 ml，乙二胺四乙酸钾(EDTA-K₂)真空抗凝，混匀后3 000 r/min，离心半径16.7 cm，离心10 min，分离血清至1.5 ml EP管中，-80℃保存备用。采用miRcute血清/血浆miRNA提取试剂盒提取所有样本血清中RNA(液相分离前加入25 fmol的cel-miR-39-3p Standard RNA作外源性内参)。

5. cDNA合成：采用miRNA反转录试剂盒，以3 μl总RNA为模板合成cDNA。10 μl RT反应体系如下：1 μl miRNA RT引物，2 μl 5×RT Buffer, 2 μl RTase Mix，2 μl ddH₂O。反应条件：42℃ 60 min, 70℃ 10 min。

6. 实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)：使用PRISM 7500实时荧光定量PCR仪检测miRNAs的表达水平。采用qPCR试剂盒, 20 μl qPCR反应体系包含：10 μl 2X SYBR Green Mix, 2 μl RT产物，0.8 μl miRNA正向引物，0.8 μl miRNA通用反向引物，0.04 μl ROX染料，6.36 μl ddH₂O。PCR反应程序：95℃，10 min; 95℃，15 s; 60℃，1 min，40个循环。每个miRNA做3个平行样，并设立空白对照。采用2^-ΔΔCt法，将每个miRNA的Ct值标准化为每个样本中cel-miR-39-3p的Ct值，以消除RNA分离和定量过程中产生的差异。

7. 统计学处理：采用SPSS 21.0软件进行统计分析。计量资料经正态性检验，服从正态分布则采用配对t检验，不服从正态分布则采用Mann-Whitney U检验。采用多重线性回归分析方法，分析miRNAs的表达差异与年龄、性别、化疗、肿瘤类型等因素的关系。P < 0.05为差异有统计学意义。

1. 肿瘤患者基本情况：入选患者男性19名，女性44名，其中乳腺癌患者均为女性。入选患者年龄25~85岁，平均(55.6±12.4)岁。研究对象包括32例乳腺癌、8例食管癌、6例肺癌、11例头颈部肿瘤和6例其他消化道肿瘤患者。将样本量≤5的肿瘤归到同一放疗部位处(表 2)，其中11例头颈部肿瘤包括2例鼻咽癌、5例脑癌、2例喉癌和2例腮腺癌，6例其他消化道肿瘤包括3例直肠癌和3例胃癌。

2. 放疗前、后患者血清中两种miRNAs相对表达量变化情况：表 1列出了63名肿瘤患者放疗前、后血清中两种miRNAs的相对表达量。结果显示，与放疗前相比，放疗后患者血清中miR-150-5p与miR-23a-3p的相对表达量明显降低，差异具有统计学意义(t=4.97，Z=-2.77，P < 0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 放疗前、后患者血清中2种miRNAs的相对表达量变化(x±s) Table 1 The relative expression levels of two miRNAs in serum of patients before and after radiotherapy (x±s) miRNAs 例数 放疗前 放疗后 t值 P值 miR-150-5p 63 1.841±1.520 0.925±0.580 4.97 0.000 miR-23a-3p 63 0.812±0.632 0.588±0.604 -2.77a 0.006 注：aZ值

表 1 放疗前、后患者血清中2种miRNAs的相对表达量变化(x±s) Table 1 The relative expression levels of two miRNAs in serum of patients before and after radiotherapy (x±s)

3. 肿瘤类型对肿瘤放疗患者血清中两种miRNAs相对表达量的影响：在乳腺癌、食管癌和其他消化道肿瘤患者血清中，miR-150-5p的表达量在放疗后明显降低(t=3.47、2.47、2.87，P < 0.05)，在肺癌、头颈部肿瘤患者血清中，放疗前、后miR-150-5p的表达量差异无统计学意义(P>0.05)；miR-23a-3p在放疗后除食管癌的其他消化道肿瘤患者血清中表达量下降(Z=-1.99，P < 0.05)，其余肿瘤患者血清中miR-23a-3p在放疗后的表达量呈下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 肿瘤类型对患者放疗前、后患者血清中两种miRNAs的相对表达量的影响(x±s) Table 2 Effects of cancer types on the relative expression levels of two miRNAs in serum of patients before and after radiotherapy(x±s) 组别 例数 放疗前 放疗后 t值 P值 miR-150-5p   乳腺癌 32 1.995±1.613 1.003±0.644 3.47 0.002   食管癌 8 2.269±1.759 0.686±0.283 2.47 0.043   肺癌 6 1.413±0.668 0.720±0.343 1.78 0.136   头颈部肿瘤 11 1.280±1.582 0.936±0.662 -0.27a 0.790   其他消化道肿瘤 6 1.903±1.165 1.007±0.552 2.87 0.035 miR-23a-3p   乳腺癌 32 0.717±0.528 0.561±0.531 -1.28a 0.200   食管癌 8 0.923±0.795 0.478±0.336 -1.54a 0.123   肺癌 6 0.759±0.570 0.353±0.105 1.62 0.166   头颈部肿瘤 11 0.911±0.750 0.966±1.031 -0.29 0.776   其他消化道肿瘤 6 1.042±0.850 0.423±0.196 -1.99a 0.046 注：a为Z值

表 2 肿瘤类型对患者放疗前、后患者血清中两种miRNAs的相对表达量的影响(x±s) Table 2 Effects of cancer types on the relative expression levels of two miRNAs in serum of patients before and after radiotherapy(x±s)

4. 化疗对肿瘤放疗患者血清中两种miRNAs相对表达量的影响：63例放疗患者中进行过化疗的患者和未进行化疗的患者放疗前、后血清中两种miRNAs的相对表达量结果见表 3。结果显示，在进行过化疗的患者中，放疗后血清中两种miRNAs的相对表达量均明显降低，差异具有统计学意义(t=4.43，Z=-3.05，P < 0.05)；在未进行化疗的患者中，放疗后血清中miR-150-5p的相对表达量明显降低，差异具有统计学意义(t=3.05，P < 0.05)，而放疗后血清中miR-23a-3p的表达量呈下降趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)。本研究中化疗在放疗前进行，miR-150-5p在放疗前44名化疗患者与19名未化疗患者中及其在放疗后两组患者中的表达量差异无统计学意义(P>0.05)；miR-23a-3p在化疗与未化疗患者放疗前及放疗后的表达量差异也无统计学意义(P>0.05)。

表 3(Table 3)

表 3 化疗对放疗前、后患者血清中两种miRNAs的相对表达量的影响(x±s) Table 3 Effects of chemotherapy on the relative expression levels of two miRNAs in serum of patients before and after radiotherapy (x±s) 组别 例数 放疗前 放疗后 t值 P值 miR-150-5p   化疗 44 2.104±1.709 0.990±0.616 4.43 0.000   未化疗 19 1.231±0.643 0.773±0.466 3.05 0.007 miR-23a-3p   化疗 44 0.811±0.603 0.519±0.477 -3.05a 0.002   未化疗 19 0.815±0.712 0.747±0.820 -0.44a 0.658 注：a为Z值

表 3 化疗对放疗前、后患者血清中两种miRNAs的相对表达量的影响(x±s) Table 3 Effects of chemotherapy on the relative expression levels of two miRNAs in serum of patients before and after radiotherapy (x±s)

5. 放疗前、后患者血清中两种miRNAs表达的多重线性回归分析：分别单独以患者放疗前、后血清中两种miRNAs表达量作为因变量，性别、年龄、化疗、肿瘤类型等因素为自变量，进行多重线性回归分析(表 4)。结果显示，miR-150-5p与miR-23a-3p在患者放疗前血清中的表达改变与性别、年龄、化疗和肿瘤类型无显著相关(P>0.05)；miR-150-5p在患者放疗后血清中的表达改变与放疗前一致(P>0.05)，而miR-23a-3p的表达改变与性别、年龄和化疗显著相关(t=2.04、-3.34、-2.29，P < 0.05)。

表 4(Table 4)

表 4 放疗前、后患者血清中两种miRNAs表达相关因素的多重线性回归分析 Table 4 Multiple linear regression analysis of factors related to the expression of two miRNAs in serum of patients before and after radiotherapy 变量 放疗前 放疗后 b值 Sb值 b′值 t值 P值 b值 Sb值 b′值 t值 P值 miR-150-5p   性别 0.232 0.529 0.071 0.44 0.663 -0.033 0.203 -0.026 -0.16 0.871   年龄 0.004 0.019 0.033 0.21 0.836 -0.010 0.007 -0.213 -1.35 0.182   化疗 0.796 0.474 0.242 1.68 0.099 0.192 0.182 0.153 1.05 0.297   肿瘤类型 -0.098 0.168 -0.095 -0.58 0.561 0.052 0.065 0.131 0.80 0.426 miR-23a-3p   性别 0.140 0.224 0.103 0.62 0.535 0.401 0.196 0.307 2.04 0.046   年龄 -0.007 0.008 -0.131 -0.82 0.418 -0.024 0.007 -0.491 -3.34 0.001   化疗 0.031 0.201 0.023 0.16 0.877 -0.403 0.176 -0.309 -2.29 0.026   肿瘤类型 0.076 0.071 0.176 1.07 0.291 0.019 0.062 0.046 0.30 0.763 注：b.回归系数；Sb.标准误差；b′.标准化的回归系数

表 4 放疗前、后患者血清中两种miRNAs表达相关因素的多重线性回归分析 Table 4 Multiple linear regression analysis of factors related to the expression of two miRNAs in serum of patients before and after radiotherapy

应用电离辐射进行放射治疗是对抗人类肿瘤的主要治疗方法之一，约超过一半的肿瘤患者接受放射治疗。有研究表明，在接受过放射治疗的肿瘤患者中，部分患者会出现辐射诱发的心脏病、放射性皮炎等^[9-10]。因此，减少放疗的辐射损伤是放射治疗研究的重要内容。miRNAs通过调节DNA损伤修复、细胞周期检查点和细胞凋亡的重要基因，参与转录后细胞变化，从而影响细胞放射性反应^[11-12]。miRNAs作为生物标志物，在肿瘤放疗反应和正常组织的放射不良反应中的表达变化也是业界关注的焦点^[12-13]。研究显示，血清中miR-375-3p升高可能预测暴露于高辐射剂量诱导的组织损伤^[14]。在用200 mGy ⁶⁰Co γ射线单次照射人冠状动脉内皮细胞，照后4 h和24 h检测到的6个miRNAs中，miR-21在照后4 h显著下调，miR-146b在照后24 h显著上调^[15]。采用X射线对5名健康志愿者全血进行0~8 Gy离体照射，照后8和24 h全血miR-150均出现了不同程度的下调^[16]。miRNA-95在20例放疗敏感患者的宫颈癌肿瘤组织中表达水平显著低于放疗耐受患者^[17]。因此miRNAs有作为辐射损伤和肿瘤放疗敏感性分子生物标志的潜力。

本研究发现，与放疗前相比，肿瘤患者放疗后血清中miR-150-5p与miR-23a-3p的表达水平均显著下降，Yadav等^[18]研究中发现，4名白血病患者血清中miR-150-5p的表达量在12 Gy(6×2 Gy) 分次照射后也明显下降，而miR-23a-3p的表达量在照后有下降趋势，但差异不具有统计学意义，结果与本研究略有不同，其原因可能与辐射剂量、样本量和疾病类型等因素有关。不同肿瘤类型中，这两种指标在放疗前后的表达也各有差异，miR-23a-3p的表达量在放疗后的消化道肿瘤患者中下降，miR-150-5p的表达量在乳腺癌、食管癌和消化道肿瘤患者放疗后显著下降，在肺癌患者中呈下降趋势，但差异无统计学意义。Dinh等^[19]研究中发现5名接受根治性放化疗的Ⅲ_A期非小细胞肺癌患者在放疗20和40 Gy后血浆中miR-150-5p的表达量均比放疗前显著降低，而放疗40 Gy与放疗20 Gy相比，miR-150-5p的表达量差异无统计学意义。这与本研究miR-150-5p的表达改变一致，但与在肺癌患者中表达差异略有不同，可能与肺癌患者样本量较小有关。

化疗是通过口服或静脉注射抗癌药物来治疗肿瘤的一种全身性治疗方法。在进行放疗的63例肿瘤患者中，约70 %患者都需要进行化疗。Meng等^[20]收集了40名肌层浸润性膀胱癌患者的癌组织，研究发现放化疗后20名临床完全缓解患者组织中miR-23a和miR-27a的表达水平明显低于20例未完全缓解的患者，miR-23a和miR-27a通过靶向SFRP1蛋白激活Wnt信号通路中β-catenin的上调从而介导膀胱癌细胞的增殖、迁移以及对放化疗的敏感性。本研究结果显示，做过化疗的研究对象，放疗后血清中两种miRNAs的相对表达量与放疗前相比均显著下降，未做化疗者，放疗后血清中仅miR-150-5p的相对表达量显著下降，而miR-23a-3p的相对表达量差异不具有统计学意义。而且放疗前接受化疗的患者与未化疗患者两组间的miR-150-5p表达量差异均无统计学意义，可能化疗不是miR-150-5p表达水平主要影响因素。

单独分析患者放疗前和放疗后血清miR-150-5p的影响因素结果显示，均不受性别、年龄、化疗和肿瘤类型的影响，但结合患者放疗后miR-150-5p相对表达量比放疗前明显下降，故可推测miR-150-5p的表达改变可能仅与放疗相关，其有作为辐射反应生物学标志的潜力。miR-23a-3p放疗前的表达改变与miR-150-5p一致，而放疗后的相对表达量受性别、年龄和化疗等因素的影响，再结合放疗后miR-23a-3p相对表达量比放疗前明显下降，表明miR-23a-3p的表达不仅与放疗相关，还受性别、年龄等多种因素的影响，可能还需要进一步探讨其作为辐射分子生物指标的可行性。放疗剂量超过50 Gy后，miR-150-5p与miR-23a-3p表达量均下降，可能与机体产生放射性损伤增大有关。此外，两种指标均不受肿瘤类型的影响，这可能与其他肿瘤患者(除乳腺癌外)样本量均较少有关。国内外关于miR-150-5p与miR-23a-3p在放疗患者中的研究较少，需扩大样本量进一步深入研究。

综上所述，放疗可影响肿瘤患者血清中miR-150-5p与miR-23a-3p的表达，miR-150-5p的表达不受性别、年龄和化疗、肿瘤类型等因素的影响，miR-23a-3p的表达与性别、年龄和化疗有关。因此，血清中miR-150-5p的表达改变可能与放疗有关，其有作为辐射生物标志物的潜力。

利益冲突  无

作者贡献声明  闫青洁、王平负责数据整理与分析、论文撰写与修改，并参与整个实验过程；李敏杰、宋俊华、韩林、李杰、杜沙沙、张云飞负责血液样品的采集、血清的分离、收集整理病历资料；张巧、吕玉民负责项目整体设计、论文撰写指导及修改