2022, Vol. 42
2. 火箭军特色医学中心检验科, 北京 100088;
3. 火箭军特色医学中心锦州医科大学研究生培养基地, 北京 100088;
4. 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院辐射医学研究所, 北京 100850
2. Department of Clinical Laboratory, PLA Rocket Army Characteristic Medical Center, Beijing 100088, China;
3. Graduate Training Base of Jinzhou Medical University, PLA Rocket Army Characteristic Medical Center, Beijing 100088, China;
4. Institute of Radiation Medicine, Academy of Military Medical Sciences, Academy of Military Sciences, Beijing 100850, China
小肠黏膜上皮细胞是高度辐射敏感器官，终身在不断地自我更新，这一过程依赖小肠隐窝中干细胞的持续增殖、分化取代外层的终末分化细胞来完成。放射性肠炎(radiation enteritis，RE)是盆腔恶性肿瘤患者放疗后最常见的并发症，早期出现呕吐、腹泻、感染和体重减轻，严重时可能发生感染性休克导致死亡。目前，在临床上尚无针对放射性肠炎治疗的统一临床路径[1]。多项研究表明，中草药或提取物可能会降低受照动物由辐射诱导的脑、食管和血液系统的损伤[2-6]。
巴特日(Bateri)-7是由草乌叶、诃子、多叶棘豆、茜草、黑云香、银朱、麝香7味药材组成的水丸制剂，具有清瘟解毒，消“粘”，止痛，散瘀止痢的作用，是蒙医临床用于治疗肠炎的经典复方，具有蒙药抗菌药物之称[7]。虽然该药物临床应用较普遍，但未见用于治疗放射性肠炎的相关报道。本研究以放射性肠炎小鼠为模型，探讨蒙药巴特日-7对放射性肠炎的防治作用，为放疗导致的肠道损伤患者寻找新的防治药物提供实验依据。
材料与方法1. 实验动物：SPF级C57BL/6J雄性小鼠共65只，6~8周龄，体质量20~22 g，购于北京斯贝福公司，许可证号：SCXK(京)2019-0010。于军事医学研究院辐射医学研究所实验室内按组分笼喂养，环境温度18~22℃，实验期间小鼠自助摄食摄水。所有实验动物均经过适应性喂养7 d。
2. 试剂与仪器：蒙药巴特日-7由内蒙古民族大学附属医院蒙药制剂室生产。5-溴-2′-去甲酰尿苷(BrdU)购自北京中杉金桥公司，肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白介素6(IL-6)、趋化因子5(Cxcl-5)购自北京宝日医公司，磷酸盐缓冲液(PBS)购自北京博士德公司；Tunel细胞凋亡试剂盒购自北京碧云天公司，Ki-67抗体购自美国Cell Signaling公司，倒置显微镜(XDS-1B)购自日本Olympus公司。
3. 实验分组及受照条件：采用随机数表法将65只SPF级C57BL/6J雄性小鼠分为对照组、照射组和照射给药组，每组15只；存活实验分为照射组和照射给药组，每组10只。给药7 d后，将全部小鼠分3批置于小鼠照射盒内(30 cm×20 cm，为照射源配套装置)，60Co γ射线照射，源皮距3 m，吸收剂量12 Gy，吸收剂量率60.06 cGy/min，全身照射小鼠制备放射性肠道损伤动物模型，照射设备由军事医学研究院辐射医学研究所提供，为HFY-YC型60Co γ照射源。
4. 给药方法：照射前7 d和照射后3 d给予对照组、照射组生理盐水0.4 ml灌胃，照射给药组给予530 mg/kg巴特日-7，0.4 ml生理盐水溶解灌胃。每天根据小鼠体重换算给药量，每日1次，连续给药11 d。
5. HE染色和免疫组织化学检测：照射后6 h、24 h、3.5 d，采用颈椎脱臼法处死小鼠，剖腹取出小肠段，用4℃ PBS冲洗至无粪便残留，剪切约为0.5 cm小段数段，置于10%甲醛中固定24 h，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、组织切片，常规HE染色；同时进行Tunel、BrdU、Ki67免疫组织化学检测。
6. 外周血FITC-dextran含量测定：12 Gy照射后3.5 d，照射组和照射给药组各取5只小鼠，提前8 h禁食禁水，FITC-dextran灌胃给药，给药4.5h后，心脏取血，离心后将血浆与PBS 1∶1混合待测，取FITC-dextran试剂倍比稀释，在平板读取器上进行检测(激发波长485 nm，发射波长535 nm)，制作FITC-dextran浓度和吸光度( A )标准曲线(y=5.57x+86.82，R2=0.999 9)，同条件下检测待测血样读取 A 值，代入公式计算样本FITC-dextran浓度。
7. 实时荧光定量PCR(qPCR)法检测炎性因子表达：将小肠组织进行匀浆处理，qPCR法测定小肠组织中炎性因子IL-6、TNF-α和Cxcl-5的表达水平。PCR反应条件为95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 1 min，72℃ 30 s，共40个循环。运行结束后使用Bio-rad软件分析各基因相对表达量。
8. 统计学处理：采用SPSS 26.0软件进行统计学分析，Graphpad prism 8软件进行作图，数据以x±s表示，组间均数比较采用独立样本t检验。小鼠存活采用Kaplan-Meier生存分析，生存数据的比较采用Log-rank法检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1. 巴特日-7对受照后小鼠存活时间的影响：照射组和照射给药组小鼠在照射后均能正常饮水、摄食，照射后第2天，两组小鼠一般状态出现变化，表现为不同程度的体重减轻，反应迟钝；照射后第3天，照射组小鼠开始出现肠道症状，表现为稀便，其精神状态较照射前萎靡，行动迟缓；照射后第4天，两组小鼠均出现死亡现象；照射后第7天，照射组小鼠全部死亡；照射后第10天，照射给药组小鼠全部死亡。照射给药组小鼠存活率与照射组相比，差异具有统计学意义(χ2 = 5.84，P < 0.05)；照射后两组间小鼠体质量变化差异无统计学意义(P> 0.05)，见图 1。
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A.存活率；B.照射后体质量变化 图 1 巴特日-7对12 Gy γ射线照射后小鼠存活率和体质量的影响 A. Time response of mice survival; B. Body weight alterations after irradiation Figure 1 Effect of Bateri-7 on the survival and body weight of mice after 12 Gy irradiation |
2. 小肠HE染色分析肠道绒毛高度和隐窝深度：如图 2所示，12 Gy照射后3.5 d，小肠组织HE染色显示，照射组小肠绒毛全部脱落或缺如，隐窝排列不齐；照射给药组小肠绒毛组织结构良好，排列整齐，形态完整，少量绒毛发生断裂。用ImageJ软件测量两组小肠绒毛长度和隐窝深度，照射给药组与照射组相比，小肠绒毛长度差异具有统计学意义(t = 20.24，P < 0.05)，两组隐窝深度比较差异无统计学意义(P> 0.05，表 1)；FITC-dextran渗透性实验显示，照射给药组FITC-dextran的外周血浓度显著低于照射组，差异有统计学意义[(2 025±679)mg/ml vs. (22 730±6 652)mg/ml，t= 6.92，P < 0.05]，表明巴特日-7能很好地保护小肠绒毛结构和肠道屏障功能。
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图 2 12 Gy照射后3.5 d各组小鼠的小肠绒毛结构 HE染色×20 A.对照组；B.照射组；C.照射给药组 Figure 2 Villus structure of small intestine at 3.5dafter 12 Gy irradiation in each group HE staining ×20 A. Control group; B. Irradiation group; C. Irradiation plus drug administration group |
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表 1 12 Gy照射后3.5 d各组小鼠小肠绒毛高度和隐窝深度的变化(μm，x±s) Table 1 Villi height and crypt depth of small intestine 3.5 d after 12 Gy irradiation in each group(μm, x±s) |
3. 巴特日-7对受照小鼠小肠隐窝细胞的增殖作用的影响：照射组BrdU和Ki67阳性细胞隐窝数量明显低于照射给药组(图 3)，差异均具有统计学意义(t= 3.91、-2.57，P < 0.05，表 2)，表明蒙药巴特日-7能够促进照射后小鼠小肠隐窝细胞再生。
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注：红色箭头所指为BrdU、Ki67阳性隐窝 图 3 巴特日-7对12 Gy照射后小肠隐窝细胞增殖的影响免疫组织化学染色×20 Figure 3 Effect of Bateri-7 on the proliferation of small intestinal crypt cells after 12 Gy irradiation Immunohistochemical staining ×20 |
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表 2 12 Gy照射后BrdU+、Ki67+小肠隐窝数量(x±s) Table 2 The number of BrdU+and Ki67+intestinal crypt after 12 Gy irradiation(x±s) |
4. 巴特日-7对受照小鼠小肠隐窝细胞凋亡的影响：由于在照射早期小肠隐窝细胞即会发生凋亡，故选择照射后6和24 h观察隐窝细胞凋亡情况。结果显示，照后6和24 h，照射给药组与照射组相比小鼠小肠隐窝Tunel阳性细胞数量明显减少(图 4)，差异有统计学意义(t= 3.52、2.90，P < 0.05)，见表 3。表明巴特日-7具有明显抑制照射后小鼠隐窝细胞凋亡的作用。
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注：红色箭头所指为Tunel阳性细胞 图 4 巴特日-7对12 Gy照射后不同时间点小肠隐窝细胞凋亡的影响免疫组织化学染色×20 Figure 4 Effect of Batri-7 on apoptosis of small intestinal crypt cells at different time points after 12 Gy irradiation Immunohistochemical staining ×20 |
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表 3 12 Gy照射后不同时间点Tunel阳性细胞数量(x±s) Table 3 Number of Tunel positive cells at different time points after 12 Gy irradiation(x±s) |
5. 各组小鼠肠道组织IL-6、TNF-α、Cxcl-5表达水平的比较：在照射后3.5 d，照射给药组小鼠小肠组织炎性因子IL-6、TNF-α和Cxcl-5的表达水平均低于照射组，两组相比较均具有统计学意义(t= 7.01、7.18、13.16，P < 0.05)(表 4)。结果显示，巴特日-7能够抑制放射性肠损伤小鼠小肠炎性因子的表达。
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表 4 12 Gy照射后各组小鼠小肠炎性因子的表达(x±s) Table 4 Expression of enteritis factors after 12 Gy irradiation in each group(x±s) |
讨论
蒙药作为蒙古族特有的一种药物，具有低毒、高效、疗效独特等显著优势[8]。巴特日-7是蒙医临床治疗肠炎的首选药物[9]，具有抗病毒、抗菌、抗炎、镇痛、增强免疫等作用。在现代药理研究中，其成分草乌叶具有抗炎、镇痛之效；诃子对平滑肌有解痉效果，能抑菌、抗氧化；麝香则能在抗炎的同时对血管通透性进行抑制；茜草具有抗血小板聚集、解痉、抑制病菌之效[10]。经长期临床实践证明，巴特日-7对于某些真菌以及大肠杆菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌等具有显著的抑制作用，临床抗炎疗效显著[11]。
本研究建立小鼠放射性肠损伤模型，探讨蒙药巴特日-7对小鼠放射性肠损伤的作用。结果显示，在照射后3.5 d，照射给药组小肠绒毛组织结构良好，排列整齐，形态完整；照射组小肠绒毛全部脱落或缺如，隐窝排列不齐。照射给药组小肠绒毛长度明显大于照射组。证明巴特日-7能有效保护受照小鼠小肠绒毛结构。小肠绒毛是肠道机械屏障的重要组成部分，既然巴特日-7对小肠绒毛结构有显著保护作用，由此推测巴特日-7也能保护放射性肠损伤肠道屏障功能。文献报道荧光标记物异硫氰酸荧光素-葡聚糖(FITC-dextran)渗透实验，是用于评价炎性肠病中肠道通透性的经典技术手段[12]。在肠黏膜严重受损时，经口服FITC-dextran分子可以从肠腔进入全身血液循环，测量小鼠外周血中FITC-dextran含量来反映肠黏膜的受损程度。结果显示，照射给药组小鼠外周血中FITC-dextran的含量显著低于照射组，该结果表明巴特日-7能有效保护受照小鼠小肠屏障功能。
在照后3.5 d，照射组小肠组织IL-6、TNF-α、Cxcl-5的表达水平显著升高，而经巴特日-7干预的小鼠小肠组织中IL-6、TNF-α、Cxcl-5的表达均处于较低水平，两组相比较差异具有统计学意义, 与李淑艳等[13]研究巴特日-7可有效降低炎性因子表达的结果一致, 表明巴特日-7能够显著降低辐射后炎性因子表达水平。肠干细胞在放射诱导损伤后黏膜再生中起着至关重要的作用，而放射诱导的细胞凋亡可能是引发胃肠道综合征的主要因素[14-15]。通过巴特日-7干预的小鼠照射后小肠隐窝Tunel阳性的数量明显减少，BrdU、ki67阳性隐窝数增多，说明巴特日-7能够促进照射后小鼠隐窝细胞增殖和抑制因照射引起的细胞凋亡。存活实验证明巴特日-7能够有效延长小鼠的存活时间，可能与该药能够促进小肠隐窝增殖，保护黏膜屏障，降低炎性因子表达和延缓细胞凋亡有关。本研究由于采用12 Gy全身照射小鼠的方式造模，可能会伴随造血功能抑制，影响其存活，该药物对造血功能的具体影响将在后续实验中进行探讨。由于该药物为复合制剂，短期内无法得到单一的有效成分进行机制研究，相关作用机制也将在后续实验中进行。
综上所述，蒙药巴特日-7能够有效改善放射引起的肠道损伤，对放射性肠炎具有较好的防治作用，为巴特日-7应用于放射性肠炎的治疗提供了实验依据。
利益冲突 无
作者贡献声明 刘国利负责实验操作、数据采集、统计分析；宋秀军、申星指导论文修改；王叶梅协助实验操作；金花、时磊参与论文修改；余祖胤、王欣茹负责指导课题设计
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