氡(²²²Rn)是非吸烟者导致肺癌的第一大致病因素^[1]。长期在高氡浓度的矿井下工作的矿工，因为氡及其子体的慢性照射可引起肺癌^[2]；microRNAs (miRNAs)是一种小的非编码RNA，通过抑制信使RNA (mRNA)的翻译或促进mRNA的降解，在转录后水平上调节基因表达^[3]。miR-16在肺癌细胞系A549和Calu3中，通过抑制靶基因HDGF的表达，从而抑制肺癌细胞的增殖^[4]。在非小细胞肺癌中，miR-106b-5p过表达下调BTG3的表达，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡^[5]。肺癌细胞高表达的miR-34a下调靶基因CDK4/6的表达，使细胞周期阻滞于G₁期^[6]。HMGB1是miR-449a的直接靶基因，上调HMGB1可以逆转miR-449a对NSCLC细胞生长、迁移和侵袭的抑制作用^[7]。let-7家族包含13个成员，let-7g及其家族成员在序列和功能上跨物种高度保守。let-7g的表达通过下调HOXB1来抑制肺癌细胞的凋亡和促进其增殖^[8]。miR-21转录后下调抑癌基因PTEN的表达，促进非小细胞肺癌的生长^[9]。肺癌组织和细胞系中，miR-221-3p过表达降低了p27的表达，促进了细胞周期从G₁期进入S期^[10]。本研究以某矿井作业人员为研究对象，选取miR-16、miR-106b、miR-449a、let-7g、miR-21、miR-221、miR-34a，进一步探索长期氡暴露对人外周血血浆中miRNAs表达的改变，为寻找氡致机体辐射损伤早期标志物提供实验依据。

1. 研究对象：选取某锡矿84人作为研究对象。其中矿井上作业人员38人作为对照组，矿井下作业人员46人作为井下组，纳入标准为男性，工作10年以上，无急性感染性疾病、恶性肿瘤，无严重家族遗传病史。本研究通过了中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所医学伦理委员会的审查(审批号：LLSC2020-012)，全部研究对象均签署了知情同意书。

2. 问卷调查：采用自行设计的调查问卷由当地调查员对矿工进行调查，内容主要有姓名、年龄、身高、体重、文化程度等基本情况，生活习惯有吸烟、饮酒、饮茶、健康状况。体质量指数(body mass index, BMI)为体重(kg)除以身高(m)的平方得出。按照中国人BMI分级标准将矿工分为3组：4人BMI偏低(≤18.5 kg/m²)、42人BMI正常(18.5~24 kg/m²)、38人BMI偏高(≥24 kg/m²)。

3. 研究地区背景及个人剂量估算：本课题组前期测量的矿井下、地上工作场所空气平均氡浓度分别为(7 473±3 105)和(332±238)Bq/m^3[11]。根据问卷中每名矿工的每天工作时长，年工作日，以及按照2017年国际放射防护委员会(ICRP) 137号报告推荐剂量(mSv)转换参数，分别计算出每位矿工可能产生的累积剂量。ICRP 137号报告中推荐的剂量转换系数1WLM=(6.37×10⁵/F)Bq·h/m³，1WLM=10 mSv。式中，F为氡子体平衡因子，矿区井下F=0.2，其余采用F=0.4^[12]。

4. 血浆RNA提取：乙二胺四乙酸二钠(EDTA-Na₂)抗凝真空采血管收集肘静脉血，采集的样本颠倒混匀5次，2 000 r/min，离心半径147 mm，离心10 min，收集血浆于离心管中，做好标记，置于-80℃冰箱中保存。用TRIzol LS试剂和miRNeasy试剂盒(德国Qiagen公司)提取所有样品血浆中RNA(液相分离前加入10 fmol的cel-miRNA-39作外源性内参)。

5. 引物与探针：miRNAs引物及探针由美国ABI公司TaqMan miRNA assays试剂盒提供，序列见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 miRNAs引物及探针序列 Table 1 miRNAs primers and probe sequences miRNAs 序列(5′→3′) cel-miR-39 UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG hsa-miR-16 UAGCAGCACGUAAAUAUUGGCG hsa-miR-106b UAAAGUGCUGACAGUGCAGAU hsa-miR-449a UGGCAGUGUAUUGUUAGCUGGU hsa-let-7g UGAGGUAGUAGUUUGUACAGUU hsa-miR-34a UGGCAGUGUCUUAGCUGGUUGU hsa-miR-21 UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA hsa-miR-221 AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC

表 1 miRNAs引物及探针序列 Table 1 miRNAs primers and probe sequences

6. cDNA合成：用TaqMan miRNA反转录试剂盒(美国ABI公司)，以3 μl总RNA为模板合成cDNA，反应体系为：100 mmol/l dNTPs，0.2 μl；反转录酶，1 μl；10×反转录液，1.5 μl；RNA酶抑制剂，0.2 μl；反转录引物1 μl，加无核酸酶的水补足15 μl。反应条件：16℃ 30 min，42℃ 30 min，85℃ 5 min。

7. 实时荧光定量PCR：使用实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)检测miRNAs的表达水平。每个RT-PCR反应体系为20 μl包含：1.33 μl反转录产物；10 μl TaqMan Universal PCR Master MixⅡ；1 μl探针；7.67 μl无核酸酶水；所有样品一式3份。反应条件为：95℃ 10 min预变性；95℃，15 s变性；60℃，1 min退火延伸；40个循环进行扩增。采用2^-△Ct法，将每个miRNA的C_t值标准化为每个样品中cel-miR-39的C_t值，以消除RNA分离和定量过程中产生的差异^[13]。两组miRNAs中位数倍数变化(fold change, Fc)=井下组/对照组。

8. 统计学处理：采用SPSS 22.0软件进行分析，对两组工人的年龄、累积剂量采用中位数M(Q₁、Q₃)进行描述；分别对两组工人的年龄、BMI、累积剂量、血浆miRNAs进行正态性检验，若服从正态分布采用独立样本t检验；若不服从正态分布采用Mann-Whitney U检验。采用多重线性回归分析方法，分析miRNAs的差异表达与年龄、吸烟指数、累积剂量等因素的关系。P < 0.05为差异有统计学意义。

1. 两组工人基本情况：由表 2可知，井下组和对照组的累积剂量中位数分别为1 064.74(596.80~1 491.99)mSv和133.02 (102.12~141.11) mSv。井下组和对照组的中位年龄分别为45岁(35~51岁)和54岁(47~57岁)。两组之间在年龄、累积剂量、吸烟情况差异有统计学意义(Z=-3.89、-7.86，P < 0.01；χ²=7.65，P < 0.01)。

表 2(Table 2)

表 2 调查对象基本情况表 Table 2 The basic information of the respondents 组别 例数 年龄(岁) BMI(kg/m2) 吸烟 累积剂量(mSv) 偏低 正常 偏高 是 否 井下组 46 45 2 19 25 26 20 1064.74 对照组 38 54 2 23 13 32 6 133.02 χ2值 -3.89a 3.53 7.65 -7.86a P值 < 0.01 0.17 < 0.01 < 0.01 注：BMI. 体质量指数；a采用Mann-Whitney U检验，为Z值

表 2 调查对象基本情况表 Table 2 The basic information of the respondents

2. miRNAs在井下组和对照组血浆中的差异表达：井下组外周血血浆miR-106b、miR-21、miR-221表达显著上调(Z=-2.32、-2.47、-2.79，P < 0.05)。miR16、miR-449a、let-7g、miR-34a在两组间表达水平的差异无统计学意义(P > 0.05)。以上各miRNAs两组中位数Fc分别为1.61、1.75、1.30、1.74、2.09、1.81和1.15(表 3)。

表 3(Table 3)

表 3 miRNAs(2-△Ct)在井下组和对照组血浆中的表达 Table 3 miRNAs(2-△Ct) expressions in the plasma of miner workers of underground and control groups 组别 miRNAs 例数 M Q1 Q3 井下组 miR-16 46 1.78 0.59 2.28 miR-106b (×10-2)a 46 5.11 2.11 9.13 miR-449a (×10-4) 45 1.65 0.71 2.50 Let-7g (×10-2) 46 5.35 1.92 7.72 miR-21 (×10-1)a 46 2.59 1.04 5.11 miR-221 (×10-1)a 46 2.96 1.29 5.52 miR-34a (×10-4) 46 2.79 1.90 4.11 对照组 miR16 38 1.11 0.59 1.61 miR-106b (×10-2) 38 2.92 1.45 4.86 miR-449a (×10-4) 38 1.27 0.59 2.04 let-7g (×10-2) 37 3.07 2.06 5.29 miR-21 (×10-1) 38 1.24 0.90 2.91 miR-221 (×10-1) 38 1.64 1.10 2.29 miR-34a (×10-4) 38 2.43 1.12 3.61 注：M.中位数；Q1.下四分位数；Q3.上四分位数；a与相同miRNAs对照组比较，Z=-2.32、-2.47、-2.79，P < 0.05

表 3 miRNAs(2-△Ct)在井下组和对照组血浆中的表达 Table 3 miRNAs(2-△Ct) expressions in the plasma of miner workers of underground and control groups

3. miRNAs表达的多重线性回归分析：选择年龄、BMI、吸烟情况、累积剂量等变量，采用进入法拟合多重线性回归。表 4结果显示，miR-16、miR-106b、let-7g、miR-21和miR-221的差异性表达和氡暴露累积剂量呈正相关(t=2.50、3.31、2.60、2.95、3.25，P < 0.05)，而miR-449a和miR-34a的表达改变与氡暴露累积剂量无显著相关(P > 0.05)。

表 4(Table 4)

表 4 矿工血浆中miRNAs表达相关因素的多重线性回归分析 Table 4 Multiple linear regression analysis of influencing factors on miRNA expressions in the plasma of miners 变量 b Sb β t值 P值 miR-16     常数项 2.372 0.741 — 3.20 0.002     年龄 -0.017 0.012 -0.157 -1.43 0.156     BMI正常 -0.470 0.518 0.237 0.91 0.367     BMI偏高 0.089 0.523 0.045 0.17 0.865     吸烟情况 -0.474 0.247 -0.218 -1.92 0.059     累积剂量 0.000 0.000 0.283 2.50 0.015 miR-106b(×10-2)     常数项 5.058 2.458 — 2.06 0.043     年龄 -0.043 0.040 -0.115 -1.08 0.284     BMI正常 2.925 1.719 0.432 1.70 0.093     BMI偏高 1.550 1.735 0.228 0.89 0.374     吸烟情况 -1.532 0.820 -0.207 -1.87 0.065     累积剂量 0.002 0.001 0.365 3.31 0.001 let-7g(×10-2)     常数项 7.470 2.656 — 2.81 0.006     年龄 -0.044 0.043 -0.114 -1.29 0.201     BMI正常 1.667 1.860 0.234 0.90 0.373     BMI偏高 1.087 1.874 0.152 0.58 0.564     吸烟情况 -2.290 0.886 -0.295 -2.59 0.012     累计剂量 0.002 0.001 0.295 2.60 0.011 miR-21(×10-1)     常数项 2.640 1.588 — 1.66 0.100     年龄 -0.029 0.026 -0.124 -1.15 0.255     BMI正常 1.995 1.110 0.464 1.80 0.076     BMI偏高 1.344 1.120 0.311 1.20 0.234     吸烟情况 -0.767 0.529 -0.163 -1.45 0.151     累积剂量 0.001 0.000 0.331 2.95 0.004 miR-221(×10-1)     常数项 3.624 1.500 — 2.42 0.018     年龄 -0.035 0.024 -0.155 -1.45 0.152     BMI正常 1.512 1.049 0.368 1.44 0.154     BMI偏高 0.704 1.059 0.171 0.67 0.508     吸烟情况 -0.810 0.500 -0.181 -1.62 0.109     累积剂量 0.001 0.000 0.360 3.25 0.002 注：BMI.体质量指数，按照分类变量进行回归，参考为BMI偏低；b.回归系数；Sb.标准误；β.标准化偏回归系数；“—”为无数据

表 4 矿工血浆中miRNAs表达相关因素的多重线性回归分析 Table 4 Multiple linear regression analysis of influencing factors on miRNA expressions in the plasma of miners

肺癌是全世界发病率及致死率最高的恶性肿瘤，患者生存期短，复发率高。氡及其子体被人体吸入后附着在支气管上皮细胞上，产生局部高剂量照射，从而诱导细胞DNA双链断裂，导致肺癌的发生。大量流行病学研究发现，氡是继吸烟之后诱发肺癌的第二大致病因素^[14-15]。随着研究的不断深入，外周血miRNAs作为新的生物标志物受到了广泛的青睐。Acharya等^[16]通过对2、6.5和8 Gy全身照射的小鼠外周血血清miRNAs的研究发现，miRNAs可以作为辐射剂量计，高效评估辐射诱导的早期造血损伤。Rogers等^[17]研究发现，小鼠血浆中miR-34a-5p、miR-100-5p、miR-150-5p用于特异性识别晚期肺部的辐射损伤。

本研究发现，血浆中miR-16、miR-106b、miR-449a、let-7g、miR-34a在井下组的表达均高于对照组，与刘春旭等^[18]对氡温泉暴露人员调查结果一致，分别是对照组的1.61、1.75、1.30、1.74、1.15倍。但张品华等^[19]对高本底地区居民外周血miRNAs的研究发现，miR-16、miR-106b和let-7g在高本底组的表达下降。其原因可能是高本底地区主要是γ辐射，并且是低传能线密度(LET)辐射，以致辐射类型不同导致不同的生物应激途径。另外，考虑到两组间年龄、吸烟情况存在差异，将累积剂量、年龄、BMI、吸烟情况等因素进行多因素回归分析发现，miR-16、miR-106b、let-7g、miR-21和miR-221的表达改变与累积剂量显著相关，而与年龄、吸烟情况、BMI等无关，但是对于miR-449a、miR-34a，还不能认为其表达改变与氡暴露相关。

目前，对于电离辐射所致miRNAs的表达变化，多数集中在细胞和动物的研究。而对于氡致矿工外周血血浆miRNAs的研究甚少。Wu等^[20]和Chen等^[21]将人支气管上皮细胞和大鼠肺组织暴露于氡时发现miR-34a的表达上调，let-7a-2-3p、let-7b-3p表达下调，K-ras表达上调，并以时间依赖的方式促进人支气管上皮细胞的凋亡。除了照射时间的依赖性变化外，miRNAs的表达改变还与剂量、剂量率的变化有关。Wagner-Ecker等^[22]和Chaudhry等^[23]用2 Gy X射线和不同剂量率下的γ射线分别照射人真皮微血管内皮细胞和人皮肤成纤维细胞发现，let-7g、miR-16和miR-21均有不同程度的表达上调；miR-16在较高剂量率(3 cGy/min)照射后3 h表达水平有所下降，但在8 h后上调，可能具有一定的时间依赖性。此外，miR-106b、miR-221作为细胞周期调节因子，分别通过不同的靶点来促进或抑制细胞周期的进程。其中，miR-106b以p21为靶点促进细胞周期的进程^[24]；miR-221通过抑制p27来控制细胞周期进程并促进癌细胞增殖^[25]。另外，miR-449a、miR-34a都是miR-34家族成员，并且具有相同的种子序列。以往的研究表明，miR-34a和miR-449a外源表达引起的G₁期细胞周期阻滞与p53和p21基因的激活有关^[26-27]。上述研究多数属于高剂量下的低LET辐射，但氡及其子体的照射属于高LET照射。Templin等^[28]比较了暴露于γ射线和⁵⁶Fe重离子的小鼠外周血中miRNA的表达特征，发现miRNA的表达特征具有辐射类型特异性、剂量和时间依赖性。Chauhan等^[29]通过用α粒子照射人细胞系发现高LET照射可能引发与低LET照射不同的生物应激途径。本研究发现，miR-449a、miR-34a相对表达水平高于对照组，但差异无统计学意义。

综上所述，miR-106b、miR-21、miR-221在井下组矿工血浆中表达水平显著上调，或可作为氡致辐射损伤的早期生物标志物。

利益冲突  无

作者贡献声明  王东方负责实验、数据分析和撰写论文；齐雪松、吴丽娜负责课题思路、论文修改的探讨；高刚、阮健磊、朴春南、刘建香指导课题设计、论文写作和修改