2021, Vol. 41
2. 海军军医大学长海医院呼吸与危重症医学科, 上海 200433
2. Department of Respiratory and Critical Care Medicine, Changhai Hospital, Naval Medical University, Shanghai 200433, China
放射性肺损伤是胸部恶性肿瘤放疗、重症核事故损伤的常见并发症，其是以肺泡为主要损伤部位的渐进动态过程，受损的肺泡上皮细胞和血管内皮细胞会分泌大量炎性因子和趋化因子，形成放射性肺炎，进一步通过凋亡诱发成纤维细胞活化和增殖等一系列级联反应，形成放射性肺纤维化[1-2]。研究发现，间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)可以有效减轻放射性肺损伤，具有来源广泛、分离和培养方便、免疫原性低、再生和多重分化能力强等优点[2]。MSCs也可作为基因治疗载体，经基因修饰后移植到体内，合成特异性蛋白分子，通过向功能细胞分化、调节细胞因子产生、减少肺泡细胞凋亡从而促进肺组织损伤的修复[3-5]。基因修饰的MSCs不仅具有MSCs主要特性，而且能够加强其在放射性肺损伤中的疗效，为放射性肺损伤治疗开拓了新思路，本文就基因修饰的MSCs在治疗放射性肺损伤中的实验研究进展及存在的问题做一综述。
一、间充质干细胞概述MSCs是来源于发育早期中胚层的一类具有高度自我更新、多向分化潜能的多能干细胞，最初由Friedenstein[6]率先从兔骨髓中成功分离，从骨髓单核细胞(BM-MNCs)中鉴定为呈成纤维细胞样，并可形成集落形成单位(CFU-Fs)，且具有多向分化潜能，随后研究发现在各种组织中可以分离出来，例如骨髓(BM)[7]、脂肪(Ad)[8]、脐带(UC)[9]等。目前，对鉴定MSCs来源的单一表面分子尚未达成一致的看法。2006年国际细胞治疗学会(ISCT)发布了MSCs的鉴定标准[10]，主要包括：在标准培养条件下贴壁生长；CD105、CD73和CD90阳性表达，CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a或CD19和人类白细胞抗原Ⅱ类(HLA-DR)阴性表达；在体外能分化为成骨细胞、脂肪细胞、成软骨细胞。MSCs通常表达的其他表面抗原包括CD13、CD29、CD44和CD10[11]。骨髓作为MSCs的主要来源，大多数MSCs标记物被鉴定为骨髓间充质干细胞(BMSCs)，这些标记是否可以应用于其他来源的间充质干细胞尚不清楚。为BMSCs提出的标记主要分为两类：单一标记和“干细胞”标记。单一标记可替代贴壁这一特性作为筛选工具，足以从体内环境中识别或纯化BMSCs样细胞[10]；“干细胞”标记能够识别具有高CFU-Fs和三线性潜能BMSCs的子集，甚至能够识别胚胎干细胞样群，这种干细胞标记有助于选择和展示出优越的CFU-Fs以及多能性亚群的富集。许多分子被认为是MSCs标记，其中，基质细胞抗原(Stro-1)、CD271、阶段特异性胚胎抗原-4 (SSEA-4)和CD146是研究中最受关注的BMSCs分类标记。
MSCs治疗放射性肺损伤的优势主要有以下几点：
1、间充质干细胞能归巢至损伤部位，通过分化来修复损伤组织间充质干细胞具有高迁徙性及向损伤组织归巢的特性，生长因子、细胞因子和粘附分子是归巢效应的信号，归巢也是主动防御和修复的一部分[12]，MSCs通过损伤部位分泌的一系列趋化因子到达肺损伤部位。研究发现，在肺损伤模型中，经尾静脉注射MSCs，其归巢到肺损伤部位，并分化为肺泡上皮细胞来修复损伤组织，从而减轻炎症和纤维化[13]。
2、间充质干细胞具有旁分泌作用间充质干细胞除了归巢，还可通过旁分泌来促进组织修复。由于外源性MSCs迁徙至病灶处数量少、分化成受损肺组织的数量更少，因此有研究认为MSCs的旁分泌功能可能在组织修复中具有一定的作用[14]。在体外实验中，MSCs可通过分泌纤连蛋白、光蛋白聚糖(Lumican)、胰岛素样生长因子结合蛋白-7(IGFBP-7)等，来影响肺泡上皮细胞和气管上皮细胞的迁徙和刺激受伤组织的修复[15]。
3、间充质干细胞具有免疫调节作用间充质干细胞还具有免疫调节作用，包括抑制T细胞、B细胞和自然杀伤细胞的增殖及其功能。研究发现，MSCs可以减少促炎因子肿瘤坏死因子α(TNF-α)和干扰素γ(IFN-γ)的释放，增加抗炎因子白细胞介素(IL-10、IL-4)的分泌，将它们从促炎表型转换为抗炎表型，导致免疫效应细胞抑制和免疫抑制细胞激活。MSCs可通过抑制肺脏TNF-α和IL-1产生和减少淋巴细胞和中性粒细胞进入肺内来抑制肺部炎症和纤维化[16]。
二、基因修饰的间充质干细胞实验方法MSCs作为基因转染的靶细胞携带目的基因参与组织损伤，其对多种疾病的治疗作用引起了人们的广泛关注，在临床应用中的研究已有开展，在肺损伤的研究中也有报道。基因修饰主要是指利用生物化学方法修改DNA序列，达到改变宿主细胞基因型或者使得原有基因型得到加强的效果。
1、基因修饰的转染方法将目的基因导入细胞主要有两种方式：病毒载体和非病毒载体。非病毒载体相比之下具有合成简便、免疫原性低、安全性高等优点。但是其转染效率低，基因表达时间短，因此作用比较局限[17]。目前常用的病毒载体有慢病毒载体、腺病毒载体、反转录病毒载体和腺相关病毒载体等。反转录病毒载体感染效率高、毒性较低，被感染的细胞不会产生病变。但是，其只能感染分裂细胞，可能会激活致癌基因从而导致癌变。此外，反转录病毒包装的外源基因小于8 kb，仅适用于体外实验[18]。腺病毒可感染分裂和不分裂的多种人类细胞，同时载体不具有包膜，不容易被补体灭活，也相对安全。但其缺点是在分裂旺盛的细胞中，目的基因不能长期稳定表达，需要多次重复感染，导致机体免疫应答增多，从而影响治疗效果[18]。腺相关病毒具有生物安全级别高、宿主范围广、表达时间长和免疫原性低等优点，但是外源基因容量(＜4.7 kb) 限制了其应用[18]。与其他几种载体相比，慢病毒载体具有容量大(最多可容纳8.5 kb的外源基因)、转染效率高、能将目的基因整合到宿主细胞基因组，并长期稳定表达等优势[19]，但这种半随机整合的特性有引发突变的潜在隐患[18]。
2、基因修饰的MSCs体外扩增方法基因修饰的MSCs治疗应用的关键限制是所有组织中的MSCs数量少，分离的数量不足以用于临床，因此，找到有效大规模地体外扩增方法至关重要。基因修饰的MSCs扩增方法与MSCs相同，目前主要有4种生物加工策略，即生物反应器、转瓶、滚瓶和多层瓶。生物反应器有多种类型，包括中空纤维生物反应器、搅拌式生物反应器、立式转轮生物反应器和多板式生物反应器。目前大多数研究使用1.3~50 L的生物反应器，可以提供极高的表面积与体积比，增加产量。转瓶是将细胞接种在旋转的圆筒形转瓶中，培养过程中转瓶在轴承上不断旋转，使细胞交替接触培养液和空气，利于细胞吸收营养和代谢，但所需劳动强度大，单位体积提供的表面积有限，因此一般用于从小量培养到大规模培养的过渡阶段[20]。滚筒瓶是圆柱形容器，需要一个滚筒轨道使其旋转。Tozetti等[21]将4.25×106个MSCs接种在含有200 ml培养基的2 125 cm2滚瓶中6 d，产生2.98×107细胞，扩增率达到7.01倍。多层培养瓶由多层细胞培养表面组成，为细胞生长提供更大表面积。与T-175培养瓶相比，相同体积内具有相当于10倍的表面积，节省了培养箱空间，大大提高了培养效率。
3、MSCs治疗放射性肺损伤的模型制备及治疗方案由于具有自我增殖、多分化、趋化性、抗炎性和免疫调节等多种功能，该细胞群已成为许多研究的关注点，而且基于MSCs的疗法已成功应用于多种组织和器官。目前，MSCs在放射性肺损伤中的实验研究也很广泛，放射性肺损伤模型制备及施治方案如下：①Zhang等[22]用直线加速器对雄性C57BL/6小鼠进行单次胸部照射(13 Gy，6 MV，3.68 Gy/min，窗宽20 cm × 2.5 cm)，照射后1 d，尾静脉注射生理盐水(200 μl)、UC-MSCs(5×105/200 μl)或过表达CXCR4的UC-MSCs (5×105/200 μl)，治疗后第7、30或60天取肺组织。②Hao等[23]在比格犬右下肺局部15 Gy X射线照射，照射后180 d，麻醉比格犬，分为两组，通过支气管镜进行UC-MSCs移植(1×106/kg)和生理盐水灌洗，手术在靠近右下肺的地方进行，移植后180 d取肺组织。③Klein等[24]将C57BL/6小鼠在单剂量60Co照射源(0.5 Gy/min)中接受15 Gy的全胸廓照射，然后将BM-MSCs的单细胞悬液(0.5×106细胞)在照射后24 h或14 d通过尾静脉注射到小鼠。④Jiang等[25]使大鼠右胸接受15 Gy的X射线照射(1.25 Gy/min，RS-2000)，其余部分用铅条遮挡。胸部照射后，大鼠接受0.5 ml盐水注射(照射+PBS)、5×106个Ad-MSCs加入0.5 ml生理盐水注射组(照射+Ad-MSCs)，照射后2 h内通过尾静脉注射动物。在第1、3、7、14和28天从大鼠收集外周血和肺组织用于分析。⑤Kursova等[26]将年龄为3个月、体重为19~21 g的雄性C57BL/6小鼠，使用Luch装置(12 Gy，剂量率45.4 Gy/min)对其胸部进行局部γ射线照射。照射后1天，治疗组将小鼠MSCs悬液(0.2 ml) 注入尾静脉，剂量为每只小鼠106个细胞，对照组受照射动物接受生理盐水(0.2 ml静脉注射)。
三、基因修饰的MSCs及其衍生物在治疗放射性肺损伤中的作用机制放射性肺损伤的发病机制尚不清楚，目前主要有以下学说：氧化应激导致内皮损伤、炎症因子的爆发、促纤维化因子与胶原沉积等。MSCs作为成体干细胞，具有向损伤部位包括放射损伤区域聚集的归巢效应和多向分化潜能，并在肺组织微环境中转化为Ⅰ、Ⅱ型肺泡上皮细胞。利用经基因修饰的MSCs不仅可以有高效补充肺内的干细胞池，产生肺组织的分化细胞并修复组织损伤，还可以通过影响旁分泌和免疫调节作用促进放射性肺损伤的修复。
1、干预氧化应激环节电离辐射可以通过间接作用产生大量的活性氧自由基，最终导致细胞损伤或死亡，也可以破坏机体的氧化系统，加重氧化应激。因此可以利用经基因修饰的MSCs干预，维持细胞的氧化还原平衡达到肺损伤的治疗效果。Chen等[5]发现锰超氧化物歧化酶基因修饰的间充质干细胞(MnSOD-MSCs)改善了接受照射的小鼠的存活率和肺组织病理学损伤，减轻肺泡壁增厚和肺间质水肿并恢复肺部结构和完整性。Min等[27]发现血管紧张素转化酶2修饰的间充质干细胞明显改变氧化指数，丙二醛(MDA)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)水平明显降低，SOD和谷胱甘肽(GSH)水平升高，此外，还降低羟脯氨酸(HYP)的表达并减少胶原蛋白的沉积。以上研究证实通过一些氧化应激相关基因修饰的MSCs可以有效地缓解放射性肺损伤。
2、干预炎症环节电离辐射会使受损的肺泡上皮细胞和血管内皮细胞分泌大量细胞因子、生长因子和趋化因子，使单核巨噬细胞和中性粒细胞大量聚集和增殖，形成放射性肺炎。因此，如何通过基因修饰的MSCs抑制炎性因子、阻止炎性细胞浸润，成为治疗放射性肺损伤的新思路。
(1) 抑制炎性因子：通过对MSCs基因修饰来抑制促炎因子如TNF-α、IFN-γ的释放或过表达抗炎基因可以有效缓解放射性肺损伤。Zhang等[28]发现用IL-35修饰的脂肪来源间充质干细胞(ADSCs)预处理可显著降低肺干/湿重比和病理损伤，并且抑制IL-6的释放，提高支气管肺泡灌洗液(BALF)中的IL-35水平，同时降低TNF-α和Toll样受体4(TLR4)的表达。Martínez-González等[29]发现白介素33(IL-33)/(ST2)轴在肺部免疫炎症反应的发展中具有关键作用。局部可溶性IL-1受体样-1(sST2)过量产生可抑制IL-33、TLR-4、IL-1β和IFN-γ，增加IL-10的表达，这种协同作用使肺部炎症和血管渗漏明显减少。Zhang等[30]发现过表达核因子E2相关因子2(Nrf2)的MSCs会使肺水肿和促炎细胞因子水平的显著降低，增加血浆中抗炎细胞因子IL-10的水平。同样，Huang等[31]发现Ang1过表达进一步降低损伤肺中促炎细胞因子TNF-α、TGF-β1和IL-6的水平，增加抗炎细胞因子IL-10的表达。
(2) 改善内皮功能：胸部受到大剂量电离辐射后，会引起肺微血管内皮细胞肿胀凋亡，释放大量炎症因子，形成微血栓，进而导致肺组织的缺血缺氧，加重损伤。因此，可利用基因修饰的间充质干细胞改善内皮细胞功能，达到放射性损伤的防治。He等[32]发现ACE2(血管紧张素转化酶2)修饰的MSCs降低肺血管通透性，改善内皮屏障的完整性。Dong和Li[33]发现体外大分子肿瘤抑制激酶2(Lats2)表达不足的BMSCs改善肺水肿和肺上皮细胞通透性。Xu等[34]发现AT2R(血管紧张素2型受体)过表达的MSCs降低急性肺损伤(ALI)小鼠肺脏损伤组织中血管的通透性，增强ALI小鼠机体对肺组织炎症的抑制作用。Chen等[35]发现角质形成细胞生长因子(KGF)是肺上皮细胞修复的关键因子，MSC介导的KGF给药不仅改善肺微血管通透性，而且还介导促炎反应的下调(降低IL-1β和TNF-α)和抗炎反应的上调(增加了细胞因子IL-10)。Li等[36]发现下调Hippo信号的MSCs改善急性呼吸窘迫综合征(ARDS)患者的肺水肿和肺上皮通透性，并且通过降低促炎因子水平和增加抗炎因子水平改善了ARDS肺组织的炎症。以上研究证明，改善肺微血管内皮功能对于防治放射性肺损伤有一定的作用。
(3) 抑制炎性细胞趋化：肺部受到照射后，产生大量炎性细胞，这些细胞在趋化因子的作用下到达损伤部位引起炎症，而利用基因修饰的间充质干细胞可有效抑制这一过程。Zhao等[37]发现发育中的内皮基因1(Del-1)是通过抑制主要白细胞粘附受体LFA-1的功能而阻止细胞迁移和浸润的关键因素。携带Del-1的MSC(MSCs-Del1)明显减轻了小鼠的肺损伤，BALF中的中性粒细胞数量以及血清TNF-α和IL-6含量明显降低。Liu等[38]发现核心蛋白聚糖(Decorin)修饰的间充质干细胞可减轻γ射线照射引起的组织病理学损伤，MSCs治疗可降低血清中单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)、单核细胞趋化蛋白-3(MCP-3)、巨噬细胞炎症蛋白-2(MIP-2)和嗜酸性粒细胞趋化因子(Eotaxin)的水平，抑制IL-12和TNF-α的上调并恢复肺中IL-10的水平。以上研究证明抑制炎性细胞的趋化也是治疗放射性肺损伤的重要手段。
3、干预纤维化环节辐射引起局部肺泡上皮细胞、肺泡巨噬细胞、肺间质成纤维细胞、血管内皮细胞及淋巴细胞激活，产生和分泌大量细胞因子，介导间质细胞炎症反应，启动成纤维细胞分裂增殖，导致胶原蛋白的大量合成，最终形成肺间质的胶原沉积，进而发生肺组织的纤维化。因此，利用经基因修饰的间充质干细胞有效干预纤维化这一环节也成为研究的重要方向。
(1) 抑制纤维化因子：在白介素、肿瘤坏死因子以及各种生长因子的作用下，巨噬细胞和成纤维细胞大量激活，从而启动成纤维细胞增殖进而发生肺纤维化。多种促纤维化因子(IL-4、TNF-α)和生长因子(如PDGF)等与晚期的肺纤维化都有一定的关系。Liu等[38]报道MSCs-DCN诱导IFN-γ表达，抑制肺组织Ⅲ型胶原α1(Col3α1)表达，并降低Treg的比例抑制和延迟纤维化的进展。Zhang等[39]发现过表达CXCR4的人脐带间充质干细胞(HUMSCs)降低辐射诱导的α-平滑肌收缩蛋白(α-SMA)和I型胶原蛋白的表达，并抑制E-钙粘着蛋白表达的降低。综上，抑制纤维化因子对放射性肺纤维化具有一定的缓解作用。
(2) 减少胶原沉积：促纤维化细胞因子能够促进成纤维细胞增殖、分化以及纤维细胞聚集，抑制基质降解酶、蛋白水解酶，刺激多种细胞外基质合成和沉积，从而发展为不可逆的肺纤维化。Xue等[3]发现Ad-sTβR转导的MSCs降低辐射诱导的胶原蛋白沉积和羟脯氨酸，明显抑制结缔组织生长因子(CTGF)和α-SMA。Zhang等[40]发现过表达p130或E2F4的mMSC抑制肺纤维化，减少胶原蛋白沉积。因此抑制细胞外基质的产生，减少胶原沉积对肺纤维化也有至关重要的作用。
4、基因修饰的MSCs衍生物在放射性肺损伤中的防治作用MSCs可以分泌细胞外囊泡(EVs)，其主要有3种类型：外泌体、微泡和凋亡小体[41]。外泌体是直径20~200 nm的膜囊泡，在体内介导细胞之间或组织之间的通信，作为运输小泡参与体内多种生理过程和疾病发生。Lei等[42]发现MSC-EVs的miR-214-3p通过下调ATM/P53/P21信号来降低辐射诱导的DNA损伤水平，从而减轻辐射引起的肺血管损伤、炎症和纤维化。Xu等[43]认为MSCs衍生的外泌体逆转了呼吸功能改变，从而使潮气量(TV)和峰值呼气流量(PEF)等升高，呼气末停顿(EEP)和肺阻力(RI)等降低。因此，外泌体对改善放射性肺损伤也有重要作用，但外泌体中参与放射性肺损伤及肺纤维化的关键成分仍需进一步探讨。
四、展望尽管基因修饰的MSCs在动物实验研究中表现出显著疗效，但机制仍然不清楚，如何在临床上利用基因修饰的MSCs治疗疾病，还存在着许多问题需要深入研究。第一，MSCs对放射性损伤这种难治性疾病显示了其优越性，但机制不清，依然存在观察时间短、缺少临床病例、远期疗效不确定以及MSCs的致瘤性等问题，且如何选择对应适宜的基因进行修饰、应用修饰的MSCs治疗疾病的最佳时间、疗效最佳的植入剂量等问题都需要进一步研究。第二，基因修饰的MSC治疗放射性肺损伤因子较多，仍需要研发新的靶点和因子。第三，临床转化前景大，但也面临着一定的困难。MSCs应用于肺脏的研究甚少，关于MSCs修复肺损伤的研究多数集中在基础性实验阶段，且肺损伤模型主要集中在博莱霉素、脂多糖、内毒素及射线等诱导的动物模型，对于放射性肺损伤的研究还较少。MSCs具有强大的增殖能力、多向分化潜能及免疫调节功能的生物学特性，能够修复不能再生或修复缓慢的组织或器官，进而治疗许多目前无法根治的疾病，在临床应用上有巨大的潜能，因此研究基因修饰的MSCs对放射性肺损伤的防治作用具有良好的科研前景，有可能是治疗肺损伤及肺纤维化的一种新方法。总之，基因修饰的MSCs为治疗放射性肺损伤提供了新思路，具有较大应用潜力。
利益冲突 无
志谢 感谢海军军医大学未来战争医学防护专项课题(WL-WS-02)对本研究的资助
作者贡献声明 万志杰和赵松韵负责整理资料和撰写论文；杨彦勇和高福指导论文修改
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