2021, Vol. 41
2. 河北燕达医院检验科, 廊坊 065201
2. Laboratory Department of Yanda Hospital, Langfang 065201, China
癌症是导致人类死亡的主要疾病之一，据估计，到2030年，可能有超过2 100万人患上癌症[1]。目前，尽管科研人员开发出了包括分子靶向治疗、基因疗法、免疫疗法在内的多种新型疗法，放疗仍是癌症的主要治疗手段之一。然而，肿瘤细胞乏氧导致辐射耐受以及辐射剂量过高造成不良反应等问题，在一定程度上限制了放疗的进一步应用。因此，开发有效的放疗增敏剂以提高肿瘤细胞对辐射的敏感性，对于提高放射治疗效果至关重要。癌症的发生、发展与DNA甲基化和翻译后组蛋白乙酰化等修饰导致的表观遗传学变化密切相关[2-3]，因此，随着分子放射生物学的快速发展，近年来提高肿瘤辐射敏感性的策略主要集中在调节参与细胞放射应答的分子和过程上[4]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors，HDACIs)是一种通过调控染色体结构和基因表达来调节细胞辐射反应的放疗增敏剂，本文就HDACIs增强肿瘤细胞对放疗敏感性的不同分子机制以及对正常细胞和肿瘤细胞的选择性杀伤作用进行综述。
一、HDACIs组蛋白与DNA及非组蛋白组成了染色质的基本单位—核小体[5-7]。组蛋白转录后修饰包括甲基化、糖基化、ADP-核糖基化、泛素化、磷酸化以及乙酰化等。其中，组蛋白乙酰化已成为癌症治疗的新靶点之一[2]。N-ε-乙酰化反应的平衡由两种相反作用的酶—组蛋白乙酰转移酶(histone acetyl transferase，HAT)和组蛋白脱乙酰酶(histone deacetylase，HDACs)控制，它们分别介导组蛋白赖氨酸的ε-氨基上乙酰基的加入和移除[5-7]。其中，HDACs去除组蛋白的乙酰基后，使组蛋白与带负电荷的DNA的相互作用加强，导致染色质更紧密，从而抑制转录。HDACs表达水平过高则会导致控制细胞基本功能的关键基因(细胞增殖、细胞周期调节和细胞凋亡)不能正常转录，从而导致肿瘤形成[7]。例如，当HDACs与PML-RARa等融合癌基因共同招募到启动子上时，会抑制抑癌基因表达，促进肿瘤形成[8]。因此，HDACIs通过抑制HDACs的活性降低组蛋白去乙酰化，已经成为一类新型的癌症治疗药物。到目前为止，美国食品药品监督管理局(FDA)已经批准4种HDACIs药物，包括伏立诺它(Vorinostat，SAHA)、罗米地辛(Romiepsin)、贝利司他(Belinostat)和帕比司他(Panobinostat)，用于治疗顽固性皮肤瘤、外周T细胞淋巴瘤以及多发性骨髓瘤[7]。除此之外，还有更多的HDACIs作为单一疗法或与其他抗癌药物联合治疗，处于不同临床研究阶段。
二、HDACIs用于放疗增敏的分子机制细胞对电离辐射(ionizing radiation，IR)的反应是十分复杂的过程，可能涉及激活应激反应、细胞周期调控，DNA损伤与修复、凋亡调控等多种信号转导途径[8]。HDACIs通过调节一个或同时调节多个上述途径来提高肿瘤细胞对辐射的敏感性，以达到放疗增敏效果。
1. 影响DNA的损伤与修复：IR会诱导多种类型的DNA损伤，包括碱基和糖基的修饰、链间交联、单链断裂(SSBs)和双链断裂(DSBs)等，而其主要通过诱导DSBs实现对肿瘤细胞的杀伤作用[9-10]。当DNA损伤发生时，会激活DNA损伤响应的级联信号转导网络来修复DNA损伤[5]，以保证遗传信息的完整。该网络由多条信号通路交织而成，每个信号通路包括感受器、传导器及下游效应器等信号分子。信号通路中任何部分发生功能障碍，都将造成DNA损伤障碍。
感受器是识别DNA损伤和DNA复制应激诱导的DNA结构变化的蛋白，传导器是一些激酶，包括毛细血管扩张性共济失调突变蛋白(mutated in ataxia-telangiectasia，ATM)和共济失调毛细血管扩张症与Rad3相关蛋白(ATM and Rad3-related，ATR)以及它们下游的激酶[11]。当IR引起DNA损伤后，p53结合蛋白1(53BP1), γ-H2AX, Nbs1, BRCA1/2, Ku等传感器可以在几秒钟或几分钟之内定位到DSBs，修饰或者招募DDR蛋白，激活关键传导器-ATM和ATR，磷酸化下游底物，使效应分子表达和活化，从而将DNA损伤信号传递并放大[12-13]。多项研究证明53BP1和HDAC 4共同定位在DNA损伤所致的细胞核灶中，敲除HDAC 4会增强细胞对辐射敏感性[14-17]。Kim等[6]发现曲古抑菌素(Trichostatin A，TSA)对多种细胞系(结肠癌HCT116细胞、肺癌A549细胞、头颈部鳞状细胞癌HN-3细胞)有明显的放疗增敏作用，且介导的放疗增敏效果与细胞系的ATM状态密切相关，与ATM突变的共济失调毛细血管扩张(ataxia telangiectasia)细胞相比，TSA对ATM正常状态的LM细胞表现出明显的放疗增敏作用[6, 15]。说明HDACIs可通过抑制ATM相关的HDAC活性增强细胞的辐射敏感性[15, 17]。
效应器则是上述激酶的底物[11]。ATM和ATR磷酸化CHK1、CHK2、乳腺癌1型易感蛋白(BRCA 1)和NBS 1等，以激活这些蛋白，这些蛋白又会磷酸化或者招募更下游的效应蛋白，以促进DNA损伤修复[16]。HDACIs抑制RAD 51、BRCA 1和乳腺癌2型易感蛋白(BCRA2)等DNA修复蛋白的基因表达，下调Ku70和Ku86等修复蛋白的水平，影响DNA损伤修复，发挥放疗增敏作用[18]。
DSBs主要通过同源重组(homologous recombination，HR)和非同源端连接(nonhomologous end-joining，NHEJ)两种独立途径修复[2, 9-10]。研究表明，在HR通路中，帕比司他可以使同源重组蛋白RAD 51下调，HDAC 1或HDAC 2蛋白水平的短暂下调导致DNA损伤信号蛋白MRE11、NBS1水平的下调，而对低氧性膀胱癌细胞有明显的辐射增敏作用[18]。在NHEJ通路中，有研究表明，经SAHA预处理后的人前列腺癌细胞系，辐射诱导的RAD51和DNA-pkcs表达的增加量明显减少[10]；另外，丁酸钠能够降低黑色素瘤细胞系中关键DNA修复蛋白ku70、ku80和DNA-pkcs的表达，抑制DNA修复而实现放疗增敏[14]。
2. 阻滞细胞周期：HDACIs通过上调细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)抑制剂(p15、p21、p27)或下调细胞周期蛋白和CDKs来诱导细胞发生G1/S期或G2/M期阻滞，导致细胞分化或凋亡，从而增加放疗敏感性[10]。HDACIs可以解除HDACs对p21启动子的抑制，促进p21的转录，以调控细胞周期[19]。研究表明，HDAC 3沉默可诱导结肠癌细胞p21表达和G2/M期细胞周期阻滞；SAHA促进细胞G1/S和G2/M期阻滞进而增强白血病K562、HL 60和THP 1细胞的凋亡[2]。
3. 诱导细胞凋亡：HDACIs介导的肿瘤细胞死亡主要是通过内源性线粒体或外源性死亡受体途径诱导细胞凋亡，两者都通过激活半胱氨酸蛋白酶家族(Caspase)活化诱导细胞凋亡。
内源性凋亡途径也称为应激性凋亡途径或线粒体途径，由化疗、电离辐射、生长因子的去除以及活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生等破坏线粒体膜的细胞应激反应而激活。HDACIs可通过上调Bcl-2家族促凋亡蛋白Bid、Bim、Bmf和下调Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等降低肿瘤细胞的凋亡阈值，导致肿瘤细胞死亡[2]。Moertl等[13]研究发现，SAHA可以抑制PARP-1抗凋亡蛋白表达增加不同前列腺癌细胞系对辐射的敏感性，表明HDACIs可通过激活内源性凋亡途径发挥增敏作用。
外源性途径是通过配体(Fas、Fas ligand，Fas-L、Tumor necrosis factor，TNF)与肿瘤坏死因子受体、肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体受体(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptors，TRAILR)和死亡受体(death receptors，DR)的结合激活Caspase-8和Caspase-10而启动的。HDACIs可通过上调死亡受体途径的几个成员，比如TNF及其受体DR5和Fas-L诱导受体凋亡途径。值得注意的是，这些受体分子只存在于转化的肿瘤细胞中，而不存在于在正常细胞中，说明HDACIs对肿瘤细胞有选择性杀伤作用[2, 10]。在小鼠骨肉瘤模型的研究中发现，SAHA能有效地诱导CD95受体和CD95配体的表达，增强Caspase-8介导的ROS细胞凋亡，而通过加入NOK-1抗体中和与CD95受体结合的CD95 L可以逆转凋亡，证明SAHA治疗能通过配体受体途径提高体内骨肉瘤的辐射敏感性[20]。
4. 增加氧自由基ROS：HDACIs还可通过增加ROS的产生引起DNA损伤进而选择性杀伤肿瘤细胞。硫氧还蛋白(Thioredoxin，Trx)是一种有效的抗氧化剂和ROS清除剂，其保护细胞免受各种伤害。HDACIs在转化细胞中通过下调活性氧清除剂Trx，上调Trx负调节因子硫氧还蛋白结合蛋白-2(TBP-2)来增加活性氧的产生，导致ROS累积，破坏线粒体，进而杀伤转化细胞，而对正常细胞没有影响，这也是HDACIs肿瘤选择性细胞毒性机制之一[7, 20-21]。Butler等[22]发现SAHA对转化细胞HDAC活性的抑制增加了TBP-2mRNA的水平，使TBP-2表达上调从而诱导细胞死亡。
5. 影响细胞自噬：自噬是细胞消化和回收本身细胞质的分解代谢过程，是一种极其重要的影响肿瘤存活和增殖的细胞机制。鉴于此，许多药物研究试图通过各种途径促进或抑制自噬，以改善肿瘤治疗的结果。HDACIs通过抑制mTOR通路，导致ROS积累、NF-κB乙酰化、p21上调或引入p53信号进而激活自噬[23]。电离辐射也通过影响mTOR通路和内质网应激激活自噬[24]。虽然已有证据表明TSA可通过抑制自噬提高结肠癌细胞对辐射的敏感性[25]，但到目前为止，HDACIs联合放疗对自噬的影响仍然不是十分清楚。
6. 其他途径：除了上述几种途径外，HDACIs还可以通过抑制血管生成、改善乏氧等多种方式产生，发挥放疗增敏作用。在缺氧条件下，TSA上调VHL和p53表达，下调HIF-1和VEGF的表达，从而有效抑制体内外血管生成[25]。帕比司他能够克服膀胱癌异种移植低氧区对放疗的抵抗力，还能降低乏氧细胞和SAHA辐射敏感性乏氧细胞对顺铂的耐药性[26]。
三、选择性杀伤作用由于正常细胞与肿瘤细胞组蛋白乙酰化模式的差异，HDACIs作为放疗增敏剂还可实现对肿瘤细胞的选择性杀伤[4]。很多体内外实验已经证实，正常细胞对HDACIs的抵抗力高达肿瘤细胞的10倍，表明在安全剂量下HDACIs能够选择性杀伤肿瘤细胞[9, 27]。研究表明，SAHA和甲氧氨酸(H6CAHA)通过抑制肿瘤细胞DSBs损伤修复发挥放疗增敏作用时，不影响甚至促进正常细胞DNA损伤修复；Kim等[14]发现，HDACI增强了肿瘤细胞对DNA损伤药物的体外敏感性，但它们对正常乳腺或肠道细胞的药物敏感性没有影响，证明了HDACIs的选择性杀伤作用。然而，Stoilov等[28]认为，NaB对正常人类淋巴细胞的治疗抑制了辐射诱导的DSBs修复。因此，即使临床相关的HDACIs在进行动物实验时，通常没有明显的不良反应，但在缺乏明确的机制信息的情况下，仍然有必要继续使用正常细胞的体外反应，来评估HDACIs对辐射诱导的正常组织损伤作用。
四、小结综上所述，HDACIs可以通过干扰DSBs损伤修复、阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、增加ROS累积、诱导自噬、选择性杀伤肿瘤细胞等途径，实现对肿瘤细胞放疗增敏及对正常细胞防护的作用。另外，它不仅可以靶向组蛋白，而且可以通过靶向非组蛋白(如p53)影响细胞周期、血管生成、免疫调节和凋亡等多种过程。由于存在半衰期短、缺乏目标特异性和生物标志物，以及存在毒物团羟基等问题，HDACIs的临床应用受到限制[27]。研究人员可通过对现有的HDACIs进行结构改造以增强其抗癌效果的同时减少或明确其不良作用，同时需要进行大规模临床试验，以便为与其他抗癌药或放疗的组合使用、精准应用提供更可靠的数据。
利益冲突 全体作者按以下贡献声明独立撰写，未接受有关公司的任何赞助, 不涉及各相关方的利益冲突
作者贡献声明 高洁负责文献收集和综述撰写；魏殿军、刘鉴峰指导综述撰写；任春华负责构思、指导修改
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