近年来，恶性肿瘤整体发病率和死亡率不断上升，2016年全球疾病负担研究显示，全球每年因恶性肿瘤死亡近9 000万人，从2006年到2016年间，肿瘤死亡人数增加了17.8%^[1]。肿瘤已经成为仅次于心脑血管疾病的第2大死因。目前，放射治疗是肿瘤治疗中的重要手段之一。约70%的肿瘤患者在治疗过程中需要采用放射治疗，并且有40%的肿瘤可以经过放射治疗或者联合使用化疗、免疫治疗、手术等手段达到有效的治疗目的^[2]。但是，肿瘤细胞具有快速适应变化的微环境的能力，由此产生的放疗抵抗不仅严重限制了肿瘤放射治疗的效果，导致患者预后不良，最终可能造成患者出现肿瘤转移复发等状况。因此，针对肿瘤放射抵抗的机制进行研究，揭示放射抵抗所涉及的信号通路、作用靶点等机制环节，对于临床上采取有效策略降低放疗抵抗，提高肿瘤患者放射治疗效果有重要的科学意义和应用价值。

circRNA是指在基因“反向剪接(back-splice)”过程中形成的缺乏5′ 3′polyA尾的连续共价闭环。circRNA对于基因的表达起到重要的调控作用，目前的研究发现，与微小RNA和长链非编码RNA特性相比，circRNA不仅种类多、丰度高、序列高度保守，而且稳定性高、半衰期长、特殊的共价闭环结构保护其免受RNase水解^[3]。此外，在肿瘤治疗中，circRNA与肿瘤细胞放射抵抗密切相关。肿瘤细胞在放射性作用下，circRNA表达水平获得性地发生变化，circRNA以竞争性内源机制(ceRNA)竞争性结合微小RNA或者直接与蛋白结合，调控下游放射抵抗相关基因的表达，从而使得肿瘤细胞的DNA损伤修复通路、EMT(上皮间质转化)过程、Wnt通路、肿瘤干细胞等多个环节出现变化，最终导致放射抵抗能力出现增强或者降低。就此，本文从上述肿瘤放射抵抗相关circRNA的表达变化、调控机制入手，分析circRNA在肿瘤放射抵抗通路中发挥的作用，并总结和展望circRNA相关的放射生物学意义及其存在的挑战。

一、circRNA在肿瘤放射抵抗中的作用机制

1.放射暴露引起肿瘤细胞上circRNA表达发生显著变化：circRNA在体液中含量丰富，并且具有高度稳定性，因此，在临床上，已经有circRNA被用作肿瘤诊断和预后的标志物^[4]。circRNA在肿瘤的发生发展中的作用主要有2种，一是抑制肿瘤生长增殖，二是促进肿瘤生长。比如，circRHOT1在肝癌中表达升高，而circRNA _ 101505表达在顺铂抵抗的肝癌细胞中的表达水平降低，这2个circRNA影响肝癌患者的生存率^[5]。除了在肿瘤发生发展中发挥作用，肿瘤细胞上的circRNA的表达在放射暴露后也能出现显著性差异变化。Zhang等^[6]使用X射线照射骨髓干细胞，发现当照射剂量低于6 Gy时，细胞上的circRNA _ 016901的表达显著升高，而且存在剂量依赖关系。另有研究也发现，circRNA-RSF1在放射暴露后的肝癌细胞上表达升高^[7]。Liu等^[8]对食管鳞状癌细胞照射后，发现circRNA _ 100367表达出现显著升高。Yu等^[9]对宫颈癌细胞进行放射处理后，采用高通量测序和生物信息学分析对比分析未照射和照射后的宫颈癌细胞上circRNA变化情况，发现超过15 000条circRNA表达在照射后发生上调或者下调的变化。其中差异有统计学意义的circRNA参与到生物过程、细胞组成、分子功能以及MAPK信号通路、内吞作用，轴突引导，神经营养素等多条信号通路，说明circRNA在肿瘤细胞放射响应过程中发挥了作用，circRNA可能参与调控放射这些所致抵抗的发生发展过程，而这个调控作用可能通过circRNA参与多个信号通路调控得以实现。

2.circRNA参与DNA损伤响应信号通路调控从而影响放射抵抗：DNA损伤应答是肿瘤细胞放射暴露后的基本生理机制之一，目的是保护自身的基因组的完整性。DNA损伤应答修复过程复杂，包含损伤感知、周期调控、传感器分子激活、修复等多个方面，涉及到多种DNA修复途径：双链断裂途径、碱基切除修复途径、核苷酸切除修复途径和错配修复途径等^[10]。circRNA主要通过3种方式参与调控放射后肿瘤细胞的DNA损伤应答修复通路：一是circRNA在转录水平调控DNA损伤应答修复通路中关键感应子、传导子的表达；二是circRNA影响细胞周期调控；三是通过ceRNA机制竞争性与miRNA结合，从而影响miRNA下游与DNA损伤应答修复通路相关基因的表达^[11-12]。

肿瘤细胞在放射暴露后，DNA损伤的感应子最先感受到变化，并及时出现在损伤部位，并启动细胞信号传导通路，募集相关蛋白形成蛋白复合物，对肿瘤细胞快速进行修复。P53、γ-H2AX、Nbs1/hMre11/hRad50 complex、Ku70/Ku80 heterodimer、BRCA1、BRCA2、MDC1、53BP1等即是发挥重要作用的感应子蛋白^[12-13]。circRNA通过调控这些感应子表达进而调控DNA损伤修复中的细胞周期途径。Chaudhary等^[14]研究发现，在结肠癌细胞上敲除p53表达后，来自于MDM2基因剪接的circRNA-MDM2表达升高，抑制细胞周期G₁/S期转换，说明该条circRNA能抑制肿瘤细胞p53的表达和参与DNA损伤应答中的周期调控环节。Bao等^[15]敲低卵巢癌细胞上VPS13C-has-circ-001567的表达后，发现细胞周期出现G₁/S期阻滞，肿瘤细胞的致癌性显著降低，说明该circRNA可能通过调控肿瘤细胞周期变化影响细胞对放射的敏感性。此外，有报道发现，circRNACDC66的表达与肿瘤化疗治疗药物奥沙利铂之间存在时间和剂量依赖关系，升高的circRNACDC66通过促进DHX9转移到PI3KKs的双磷酸化位点后导致结肠癌细胞对奥沙利铂产生化疗抵抗^[16]。Xiao等^[17]发现，沉默circRNA _ 103762表达后，非小细胞肺癌上DNA损伤的转导子CHOP表达增高，细胞的多药耐药抵抗得到抑制。目前，关于circRNA与肿瘤细胞放射后调控DNA损伤修复途径相关的感应子、转导子蛋白的研究尚处于起步阶段，这两个报道虽然是关于药物耐药抵抗的研究，但是，基于此，有理由推测，circRNA可能也能通过类似的机制诱导癌细胞对放射暴露产生抵抗。

相比上面的机制研究，ceRNA机制是目前针对circRNA研究较多的调控模式。ceRNA机制的核心是circRNA通过竞争性得与miRNA结合后，影响miRNA下游与DNA损伤应答修复通路相关基因的表达水平，从而改变肿瘤细胞对放射的敏感性。Zhu等^[18]对比分析了放射性处理和放射联合放射增敏剂处理的鼻咽癌细胞上转录组谱，发现circRNA _ 102115在放射联合放射增敏剂处理后的细胞上表达升高，竞争性地结合miRNA-335-3p，引起下游MAPK1表达变化，从而使得肿瘤细胞对放射敏感性增高。circRNA-MTDH.4则能竞争性与miRNA-630结合，引起下游AEG-1基因表达增高，从未使得非小细胞肺癌细胞的侵袭迁移能力降低，细胞对放射和化疗药物的抵抗性降低^[19]。Xiong等^[20]对经过5-氟尿嘧啶和放射处理过后的结肠癌细胞同样进行了高通量基因芯片测序，结果发现多条circRNA表达出现显著变化，生信分析进一步显示这些circRNA能与355条miRNA竞争性进行结合，进而调控下游多个与放射抵抗相关基因的活性。同样，在具有放射抵抗的食管癌细胞系KYSE-150R上，也发现57条circRNA出现上调改变，17条circRNA出现下调改变，这些circRNA能与多条下游miRNA分子竞争性结合，参与到调控DNA损伤修复等多个信号通路中^[21]。但是，作者仅针对放射抵抗细胞系进行了circRNA表达测序和生信分析，至于这些circRNA具体是如何调控各种信号通路的机制，并没有述及，因此，目前关于已经报道的与放射抵抗相关的circRNA测序结果，还需要进一步在多个细胞系和动物实验中得到验证，才能为将来在临床上用于增加放射敏感性或者降低放射抵抗、提高肿瘤治愈率提供可靠的科学依据。

3. circRNA参与上皮细胞间充质转化(EMT)调控从而影响放射抵抗：EMT是上皮细胞通过特定程序转化为具有间充质表型细胞的生物学过程，也是肿瘤细胞放射抵抗的一个重要因素。肿瘤细胞在照射后，细胞形态发生改变，由具有极性和胞间连接紧密的圆形变成能多方向分化的长条形，肿瘤细胞的侵袭、迁移和致癌性得到增强，细胞对抗凋亡的能力也不断增加。当前对circRNA在EMT调控中发挥的作用主要是在miRNA竞争性结合机制层面开展。circRNA-S-7通过竞争性结合miRNA-641，引起EMT的关键基因ZEB1和MDM2表达升高，从而使得EMT过程得到增强^[22]。circRNA-circFGD4通过调控miRNA-532-3p/APC/β-catenin信号通路抑制胃癌细胞的增殖^[23]。circ _ 100367通过miR-217/Wnt3途径抑制放疗抵抗食管鳞状细胞癌细胞的增殖和转移，并且与EMT过程相关^[8]，这将为减少食管鳞状细胞癌患者的放射治疗失败提供潜在的目标。另有研究表明，circCACTIN在胃癌的进程中发挥了特定的调节作用，可能是胃癌患者的新型生物标志物和治疗靶标。circRNA-CACTIN能促进胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭及EMT过程，主要的机制是circRNA-CACTIN通过与miRNA-331-3p竞争性结合后，调控EMT关键转录因子TGFBR1的表达活性^[24]。此外，通过在食管癌鳞状癌细胞中过表达circVRK1发现circVRK1通过调控miRNA-624-3p/PTEN/PI3K/AKT信号通路抑制食管癌鳞状癌细胞的增殖、迁移和EMT过程，并且逆转放射抵抗，促进肿瘤细胞的放射敏感性^[25]。以上研究为放射治疗癌症提供了新的证据，可能有助于在临床实践中开发出有效的治疗策略。目前关于circRNA参与EMT调控从而影响放射抵抗的基础研究还较少，将来需要进一步在更多的肿瘤细胞系中进行EMT的机制研究。

4. circRNA参与Wnt/β-catenin信号通路调控从而影响放射抵抗：Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与恶性肿瘤的发生发展密切相关，不仅如此，研究表明，该通路与肿瘤放射抵抗形成也存在紧密的关系。Wnt/β-连环蛋白信号通路通过影响肿瘤细胞的细胞周期、细胞增殖、DNA损伤修复、细胞凋亡、侵袭等参与了肿瘤放射抗性形成。既往有研究指出，circRNA在肿瘤细胞上经过放射处理后出现的表达水平变化有助于启动或者促进多种肿瘤的发生发展进展，而这种作用主要经Wnt/β-catenin信号通路激活形成^[26]。circRNA-ITCH通过竞争性与miRNA-7、miRNA-17以及miRNA-214等多个miRNA结合，使得ITCH表达升高，促进Dvld的泛素化和磷酸化的降解，进而抑制Wnt/β-catenin信号通路，最终导致食管鳞状细胞癌的增殖受到抑制^[27]，说明细胞中circRNA，miRNA和蛋白质之间的基本相互作用，这种精细调控的改变可能有助于癌症的发生和发展。在肝癌细胞中进行缺氧诱导后，肝癌细胞中的circRNA ZNF292表达水平显著升高，circRNA ZNF292通过降低SOX9活性，激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进肝癌细胞对放射的抵抗性^[28]，该研究验证了敲除circRNA ZNF292对缺氧性SMMC7721细胞放射增敏作用的分子机制，为circRNAs作为癌症放射疗法的放射增敏剂的应用奠定了理论和实验基础。虽然目前关于circRNA参与调控放射抵抗相关Wnt/β-catenin信号通路的研究较少，但是，从目前报道来看，不同的circRNA行使不同的调控作用，有的抑制Wnt/β-catenin信号通路而有的则是激活Wnt/β-catenin信号通路，说明多个circRNA都参与到了该通路的调控，今后，需要进一步明确是否还有更多circRNA涉及到这个通路的调控，以及是否存在一种circRNA在不同的肿瘤类型中对Wnt/β-catenin信号通路的调控作用存在差异。

5. CircRNA、肿瘤干细胞以及放射抵抗：肿瘤干细胞与多种肿瘤放疗抵抗相关。与正常干细胞相比，作为肿瘤细胞中具有干细胞特征(自我更新能力、分化潜能、不对称分裂)的异质性细胞，肿瘤干细胞失去了分化成正常体细胞的能力，虽然其数量只占肿瘤组织的1%，但是其对肿瘤的侵袭、迁移和复发起到重要调节作用。放疗后的肿瘤细胞，在肿瘤干细胞的带领下，通过DNA损伤修复、改变肿瘤微环境等多个途径来躲避和逃逸放射带来的损伤，从而引起放疗抵抗，甚至造成肿瘤复发。研究显示，鼻咽癌中的肿瘤干细胞能被circRNA _ 102115-miRNA-335-3p-MAPK1调节，使得肿瘤细胞的放射抵抗性增强^[18]。一项对小鼠骨髓间质干细胞进行照射的研究中，circRNA _ 011235和circRNA _ 016901的表达升高，而circRNA _ 008488, circRNA _ 000551和circRNA _ 005365表达下降，生信分析发现均与放射抵抗有关^[29]。这些研究提示，circRNA、肿瘤干细胞以及放疗抵抗之间存在密切关系，有可能成为潜在的新靶标和打击放疗抵抗的新思路。但是目前相关研究报道尚较少，今后需要深入研究进一步揭示circRNA在调控肿瘤干细胞上的作用及机制。

6. CircRNA参与凋亡通路从而影响肿瘤细胞的放射抵抗：放射诱导肿瘤细胞凋亡是杀伤肿瘤的重要机制之一，凋亡相关基因在放射性作用下发生异常变化，不仅与肿瘤细胞的侵袭、迁移、复发及预后有关，在放射抵抗中也扮演着重要的角色。有研究发现，circRNA-DENND4C在肝癌细胞上高表达，通过与miRNA-195-5p竞争性结合后，激活Wnt/β-catenin信号通路，进而介导肝癌细胞的凋亡，促进放射敏感性^[30]。在另一项研究中，circRNA-CCDC66在顺铂抵抗的胃癌细胞上出现高表达，是顺铂抗性的重要调节剂。体内外实验表明，circCCDC66通过与miR-618竞争性结合后，释放B-cell lymphoma-2的表达，进而抑制细胞凋亡，使得肿瘤细胞出现顺铂抵抗^[31]。有报道表明，沉默circRNA _ 0073237表达后，胶质瘤细胞在照射后，增长、迁移、侵袭等过程受到抑制，而凋亡变得加速，尽管尚未完全阐明circRNA对神经胶质瘤放射敏感性的影响，但此研究表明敲除circRNA _ 0073237能够显着阻止放射后神经胶质瘤细胞的进展，为治疗神经胶质瘤提供新的临床适用策略^[32]。在放射暴露后，circRNA-ATRNL1表达显著降低，通过抑制口腔癌细胞凋亡和细胞周期阻滞，导致肿瘤细胞对放射产生抵抗，说明升高该circRNA的表达能提高口腔癌细胞对放射敏感性^[33]，circANTRL1可能是提高口腔癌放射治疗效率的重要靶点。一项研究揭示，circRNA _ 0078767能显著抑制非小细胞肺癌的增殖、细胞周期进程和促进细胞凋亡，以此而影响肿瘤细胞对放射治疗的敏感性^[34]，该研究结果提示circRNA _ 0078767能够作为潜在生物标志物，参与调节抑制体内肿瘤的生长。circRNA通过凋亡途径影响肿瘤细胞对放射治疗的敏感程度，对寻找放射治疗增敏的作用靶点，逆转放疗抵抗具有重要意义。

7. circRNA通过参与其他信号途径影响肿瘤细胞的放射抵抗效应：近年，自噬、缺氧微环境、肿瘤血管形成均发现与肿瘤细胞的放射抗性有关。自噬相关蛋白如BECN1、LC3II在多种肿瘤细胞中表达下调，引起自噬活性下降，使得放射后的肿瘤细胞无法通过自噬途径降解细胞内受损的细胞器和遗传蛋白，促进肿瘤细胞的放射抗性。缺氧微环境为肿瘤细胞提供了产生放射抵抗的环境，此外，肿瘤血管形成业余肿瘤细胞的放疗抵抗有关。有研究发现，circRNA-cZNF292在肝癌细胞中被缺氧微环境诱导表达升高，通过抑制SOX9的核转位，继而激活Wnt/β-catenin信号通路，最终促进肝癌细胞对放射的抗性增强^[28]。目前针对circRNA在自噬、血管生成与肿瘤放射抗性之间的研究尚少，今后在这些方面需要加大研究力度，从多个信号通路的角度揭示circRNA在放射治疗抵抗中的作用机制。

二、挑战与展望

得益于高通量筛选技术的进步和生信分析方法的不断完善，越来越多的circRNA被发现具有重要的生物功能。然而，关于circRNAs在肿瘤放疗抵抗中作用的研究尚处于起步阶段，大多数circRNAs的作用机制研究还停留在高通量测序后的对比表达谱构建层面。尽管使用了生信分析方法对大量发现的circRNA进行了生物学功能预测和信号通路预测，但在多个信号通路层面的机制研究还缺少深入的研究，特别是在临床应用方面，还需要进一步发现和鉴定新的作用靶点和分子生物标志物，以期达到更进一步地改善肿瘤放射治疗效果, 增强肿瘤放疗敏感性的目的。可以预见不远的将来，circRNA在肿瘤放疗抵抗发生机制的探索和防治中代表一个新的方向，具有重要的意义。

利益冲突  无

志谢 感谢中南大学研究生科研创新项目(2019zzts1011)对本研究的资助

作者贡献声明  向婧负责论文撰写和修改；黄瑞雪负责选题，指导论文写作和修改