在核技术的应用中，放射源丢失和违规操作等原因导致的放射事故造成相关人员受到大剂量辐射照射从而导致严重的后果。2014年5月7日，江苏省南京市某园区发生一起由于工作人员违规操作导致的¹⁹²Ir放射源丢失事故，拾源者王某受到较大剂量的非均匀性意外照射，根据生物剂量估算结果和临床表现，诊断为外照射急性骨髓型放射病合并右大腿严重局部放射损伤，经积极救治保住了肢体^[1-2]。当前，对研究核事故人员基因变异的最常用技术仍是人外周血淋巴细胞染色体畸变分析、微核率分析^[3]，缺乏单碱基分辨率的基因变异分析。随着高通量测序技术快速发展，测序成本的进一步降低，以及组装方法的不断完善，全基因组测序由于可提供非常全面的遗传标记信息，被广泛应用于临床实践，包括肿瘤分析、遗传病分析和传染病分析、无创产前检测、胚胎植入前遗传学诊断/筛查等^[4-5]。为了明确电离辐射引起的基因突变及基因水平的变异情况，本研究收集患者王某受照射后第2 047天的背部正常皮肤组织、受照射范围内的骨及软组织、外周血进行全基因组测序，从基因变异的数量、类型、定位等多方面解析电离辐射对患者王某的基因变异情况，为明确电离辐射的远后效应提供参考。

1. 研究对象：患者“王”，男，1957年出生，于2014年5月7日拾得南京某公司遗失的¹⁹²Ir源，将其随身携带于上衣口袋内(站立时放射源处于右侧大腿外侧)总时长3.5 h，事发时¹⁹²Ir源活度为26.1 Ci(1 Ci=3.7×10¹⁰ Bq)，右下肢股外侧的估算受照剂量为4 100 Gy，全身生物剂量约为1.51 Gy^[1-2]。在受照射后第5天入住苏州大学附属第二医院进行刺激骨髓造血细胞、增强免疫力、抗感染、补充维生素、皮瓣移植术和注射间充质干细胞等临床救治，2015年5月25日出院^[1-2]。2019年12月14日(受照射后第2 047天)，患者因受照部位骨折再次入院，收集患者背部正常皮肤组织、受照射范围内的骨及软组织、外周血3种不同类型的样本。该研究为此患者救治研究的后续随访内容之一，已通过伦理审查及备案，获取标本地点为苏州大学附属第二医院。

2. DNA的提取：采用基因组DNA提取试剂盒(DP304，北京天根生化科技有限公司)同批次提取王某背部正常皮肤组织(远离受照射范围，皮肤形态正常，无辐射损伤表现)、受照射范围内的骨及软组织(穿刺夹取右大腿外侧辐照最严重部位的骨及附近残留软组织标本3个混合，标本外观有纤维化表现)、外周血的基因组DNA(常规肝素钠抗凝管采静脉血10 ml备用，并4℃冷藏保存)，采用琼脂糖凝胶电泳对所提DNA的完整性、纯度、片段大小进行检测，采用NanoDrop 2000分光光度仪进行DNA浓度测定，确保DNA质量达到建库测序要求。

3. 全基因组测序：质检合格的DNA样本委托上海欧易生物医学科技有限公司进行建库测序。DNA样品经Covaris随机打断成350~500 bp的片段，采用TruSeq DNA LT Sample Prep kit试剂盒(FC-121-2001，美国Illumina公司)进行建库，DNA片段经过末端修复、加ployA尾、加测序接头、纯化、PCR扩增等步骤完成文库构建。文库检验合格后利用Illumina NovaSeq 6000测序仪进行PE150双末端测序。对获得的原始测序数据进行低质量过滤处理，得到Clean Reads(干净的测序数据)，进行碱基含量和质量分布分析。利用BWA(Burrows-Wheeler Alignment Tool)软件将Clean Reads比对到参考基因组(human _ glk _ v37)上，比对结果经过SAMtools转换格式后，利用Picard软件去除PCR重复片段，并用Qualimap软件对比对结果进行分析。

4. 基因变异分析：以背部正常皮肤组织为对照，进行受照射范围内的骨及软组织、外周血的基因变异检测分析。采用GATK4(Genome Analysis Toolkit)软件的Haplotypecaller模块进行碱基置换(碱基转换、碱基颠换)、插入缺失(小片段插入和小片段缺失)检测。采用CNVkit(Copy number variation kit)软件进行拷贝数变异(拷贝数增加、拷贝数减少)检测。采用Lumpy软件进行结构变异(大片段缺失、大片段重复、倒位、染色体内易位以及染色体间易位)检测。

1. 基因组数据概况：基于Illumina NovaSeq 6000测序平台，患者王某背部正常皮肤组织、受照射范围内的骨及软组织、外周血的原始数据分别为139.66、133.11、143.82 Gb，在低质量过滤处理后，分别获得137.62、130.92、141.42 Gb的有效数据，Q20值分别为97.00%、96.84%、96.92%，Q30值分别为91.69%、91.37%、91.54%，测序质量较好，可用于进一步生物信息学分析。

2. 基因变异的类型及数量分布：测序研究发现，与背部正常皮肤组织相比，受照射范围内的骨及软组织的基因组和外周血基因组出现碱基转换或颠换，小片段插入或缺失，拷贝数增加或减少，大片段缺失或重复，倒位，染色体内或染色体间易位的基因变异(图 1)。

注：以背部正常皮肤基因组为参考序列 图 1 患者基因变异类型及数量分布 Figure 1 Type and quantity of the patient′s genetic variations

3. 基因变异的定位分布：根据基因变异在基因组上的定位，分析外显子、内含子、3'UTR、5'UTR、剪切位点附近、转录起始位点上游5 kb区域以内、转录终止位点下游5 kb区域以内、非编码RNA以及基因间隔区域分别出现基因变异的类型及数量。如表 1所示，受照射范围内的骨及软组织、外周血的基因组上所有区域都出现基因变异，其中基因间隔区域、内含子、非编码RNA以及外显子区域的基因变异数量较大。

表 1(Table 1)

表 1 患者基因变异的定位分布 Table 1 Locations and distribution of gene variations in the patients 定位 碱基置换 插入缺失 拷贝数变异 结构变异 S2 V S1 S3 V S1 S2 V S1 S3 V S1 S2 V S1 S3 V S1 S2 V S1 S3 V S1 外显子 37 36 4 1 28 32 370 390 内含子 499 522 491 452 1 0 1 597 1 685 3'UTR区 28 37 16 17 0 0 39 32 5'UTR区 1 1 0 0 1 1 12 13 剪切位点附近 1 0 0 0 0 0 40 42 转录起始位点上游5 kb以内 22 17 9 8 0 0 41 52 转录终止位点下游5 kb以内 17 21 11 18 0 0 45 48 非编码RNA 161 128 71 68 9 12 449 467 基因间隔区 1 405 1 592 667 757 19 30 5 100 5 418 合计 2 171 2 353 1 269 1 321 58 75 7 168 7 484 注：S1.背部正常皮肤组织；S2.受照射范围内的骨及软组织；S3.外周血；S2 V S1.以背部正常皮肤基因组为参考序列，受照射范围内的骨及软组织的不同类型基因变异的数量绝对值；S3 V S1.以背部正常皮肤基因组为参考序列，外周血的不同类型基因变异的数量绝对值；结构变异包括大片段缺失、大片段重复、倒位、染色体内易位以及染色体间易位

表 1 患者基因变异的定位分布 Table 1 Locations and distribution of gene variations in the patients

4. 基因变异在染色体上的分布：根据基因变异在染色体上的定位，分析22条常染色体和2条性染色体分别出现基因变异的类型及数量。如表 2所示，受照射范围内的骨及软组织、外周血的所有染色体上都出现了基因变异，其中1、2、4、10、16号染色体的基因变异数量较大。

表 2(Table 2)

表 2 患者基因变异在染色体上的分布 Table 2 Distribution of patients' gene variations on chromosomes 染色体 碱基置换 插入缺失 拷贝数变异 结构变异 S2 V S1 S3 V S1 S2 V S1 S3 V S1 S2 V S1 S3 V S1 S2 V S1 S3 V S1 1 186 202 113 110 2 3 582 613 2 165 193 106 114 4 4 490 506 3 117 114 82 77 1 2 277 294 4 128 110 90 88 1 3 482 523 5 98 102 68 88 3 3 265 273 6 92 91 71 58 3 3 385 392 7 146 146 66 87 2 5 351 360 8 71 82 54 62 3 5 244 259 9 133 146 51 62 2 2 230 235 10 85 105 49 59 3 1 662 730 11 88 77 64 48 6 6 283 300 12 68 67 62 66 1 3 316 333 13 42 52 41 40 2 0 193 200 14 54 75 36 50 3 2 176 186 15 70 71 28 48 2 5 178 183 16 85 84 53 35 8 7 403 423 17 67 60 39 34 1 0 182 206 18 43 43 25 20 1 2 213 213 19 38 73 38 42 2 6 182 197 20 47 67 26 26 3 4 174 176 21 66 49 11 15 0 0 220 236 22 31 55 25 28 1 0 83 87 X 84 80 39 32 2 6 118 126 Y 78 104 17 11 2 3 115 122 注：S1.背部正常皮肤组织；S2.受照射范围内的骨及软组织；S3.外周血；S2 V S1.以背部正常皮肤基因组为参考序列，受照射范围内的骨及软组织的不同类型基因变异的数量绝对值；S3 V S1.以背部正常皮肤基因组为参考序列，外周血的不同类型基因变异的数量绝对值；结构变异包括大片段缺失、大片段重复、倒位、染色体内易位以及染色体间易位

表 2 患者基因变异在染色体上的分布 Table 2 Distribution of patients' gene variations on chromosomes

5. 基因变异对应的基因数量：根据基因变异在编码基因和非编码基因上的定位，分析受照射范围内的骨及软组织、外周血的碱基置换、插入缺失、拷贝数变异以及结构变异分别对应的基因数量，以及两者共有改变的基因数量。如图 2所示，受照射范围内的骨及软组织和外周血两者共有改变的碱基置换、插入缺失、拷贝数变异和结构变异分别为726、444、109和10 238个基因。

注：以背部正常皮肤基因组为参考序列；S2、S3分别为受照射范围内的骨及软组织和外周血 图 2 患者基因变异对应的基因数量 Figure 2 The number of abnormal genes corresponding to the patient′s gene variations

本研究从基因变异的角度出发，对南京“5.7”¹⁹²Ir源事故患者照后第2 047天的背部正常皮肤组织、受照射范围内的骨及软组织、外周血进行全基因组测序，由于没有更好的组织作为阴性对照，故以背部正常皮肤组织作为“正常”对照组织，对受照射范围内的骨及软组织、外周血基因组进行相对变异分析，包括碱基置换、插入缺失、拷贝数变异和结构变异分析，探讨电离辐射对其造成的DNA损伤的远后遗传效应。

目前，对受照射患者的外周血淋巴细胞染色体畸变分析仍是应用于核事故人员细胞基因变异检测的最常用指标^[3]。曾有学者从染色体畸变层面对本研究对象受照后第5、40和208天及第4年的双着丝粒+着丝粒环、微核、核质桥进行了对比分析，显示患者受照后的细胞基因变异指标随时间明显衰减，进行了电离辐射远后效应的随访^[6-8]。然而，通过全基因组测序技术精准、量化基因变异，从单碱基分辨率层面揭示核事故人员DNA损伤的远后效应鲜有报道，为此，本研究旨在通过全基因组测序技术对南京“5.7”¹⁹²Ir源事故患者照后第2 047天的基因组进行基因变异分析。在本研究中，以患者背部正常皮肤组织为对照，检测出患者受照射范围内的骨及软组织的10 666个基因变异、外周血的11 233个基因变异，涉及上万个基因的变化。在基因变异类型方面，碱基置换、小片段插入、小片段缺失、拷贝数增加、拷贝数减少、大片段缺失、大片段重复、倒位、染色体内易位以及染色体间易位都存在。在基因变异定位上，外显子、内含子、3'UTR、5'UTR、剪切位点附近、转录起始位点上游5 kb以内、转录终止位点下游5 kb以内、非编码RNA以及基因间隔区都存在。在染色体方面，所有染色体都存在基因变异。以上研究结果说明，尽管电离辐射对染色体畸变带来的影响随着时间推移而明显减少，但是从单碱基分辨率层面分析来看，患者照后第2 047天的基因组仍存在数量庞大的基因变异。

目前，“肿瘤源于基因突变的积累”的观点已被生物医学科学界广泛接受。例如2007年，美国丹娜法伯癌症研究院对1 000个肿瘤样本进行癌基因测序突变分析，不仅发现了约30%的肿瘤样本至少携带17个已知重要癌基因突变的1个，也鉴定了多个以前未知的癌基因突变^[9]。限制于当时的测序技术，该研究的分析仅局限于基因编码区，但大量研究也注意到非编码区变异通过调控染色体高级结构的形成以及基因表达在癌症发生中的重要性^[10-11]。例如LMO1转录调控区域的碱基置换、LMO2内含子的小片段重复、TAL1转录调控区域的小片段插入分别改变了癌基因LMO1、LMO2、TAL1的表达水平，从而介导了T细胞急性白血病的发生发展^[12-14]。随着对基因组认识的深入以及测序结果的积累，会有越来越多的DNA突变的功能得到解析。南京“5.7”¹⁹²Ir源事故患者基因组上无论是编码区还是非编码区都存在大量的DNA突变，其与癌基因由此被激活并发挥致癌效应的理论是相符的。目前，根据对患者受照后的医学随访观察，表明患者恢复较好，造血、免疫系统基本恢复，各项生理生化指标逐步恢复正常，未出现明显的放射性损伤症状^[15-16]。但辐射作为主要的物理性致癌因素，其致癌效应的出现具有较长的潜伏期。人体受到照射后，发生白血病的潜伏期为3~5年，甲状腺癌为10~15年，肺癌、乳腺癌等为15~20年，甚至更长^[17]。由此可见，患者的远期预后仍需要密切关注，且与直接受照射范围内组织相比，外周血发生基因变异的类型、数目和位置未减少，此现象从单碱基分辨率层面证实造血系统如淋巴组织、胸腺、骨髓组织对辐射高度敏感，易造成DNA损伤，提示不可因为局部照射而忽视辐射对造血系统的巨大伤害，而骨及软组织作为辐射不敏感性组织，在大剂量的辐射作用下仍会产生大量基因变异。

综上所述，通过南京“5.7”¹⁹²Ir源事故患者照后第2 047天的全基因组测序结果，本研究从单碱基分辨率层面完成了对核事故人员的基因变异分析，为明确电离辐射引起的远后效应提供了理论基础。然而本研究暂无法对发现的DNA突变后的功能及远后效应的生物学意义进行全面解析。本研究将对该事故患者进行长期随访，间断性对其基因变异进行高通量检测，为核事故医学应急提供资料和经验。

利益冲突  本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，未接受有关公司的任何赞助，不涉及各相关方的利益冲突

作者贡献声明  余道江、涂文玲负责实验操作、数据分析、论文撰写；江志强、王敏、史育红、刘玉龙、王优优负责指导课题设计以及论文修改；张舒羽负责设计实验以及计划制定