2021, Vol. 41
2. 中国医学科学院北京协和医学院放射医学研究所 天津市放射医学与分子核医学重点实验室, 天津 300192;
3. 吉林农业大学中药材学院, 长春 130118;
4. 民航东北地区管理局民用航空医学中心, 沈阳 110066
2. Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine, Institute of Radiation Medicine, Tianjin 300192, China;
3. College of Chinese Medicine Materials, Jilin Agricultural University, Changchun 130118, China;
4. Civil Aviation Medical Center of CAAC Northeast Regional Administration, Shenyang 110066, China
目前放射性皮肤损伤的无创评估方式，主要是通过肉眼观察，采用急性放射损伤分级标准评级，但这些方法主观性大，对表皮和真皮病理状态缺乏客观表征。双光子激发荧光(two-photon excitation fluorescence，TPEF)成像技术由于组织穿透性强、能量低、灵敏度高，可以对活体组织中内源性荧光基团[1-2]直接成像，克服传统免疫组织化学和免疫荧光染色技术切片、染色和标记抗体的缺点，在皮肤疾病诊断和药效评估方面越来越受到关注和重视。在皮肤组织中含有大量内源性荧光基团，如尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸(磷酸)[nicotinamide adenine dinucleotide, NAD(P)H]、胶原纤维等[3-4]，因此，皮肤组织不需要任何处理，TPEF成像技术就可以直接原位对内源性荧光基团的物质成像。
本实验通过TPEF成像技术无创、活体检测不同剂量X射线照射皮肤后大鼠表皮颗粒层、棘层和基底层细胞NAD(P)H信号损伤和修复的病理变化，并进一步研究乳头层和网状层胶原纤维信号的变化特点，同时观察不同剂量X射线在不同时间皮肤损伤程度，为放射性皮肤损伤预防和药物开发提供依据。
材料与方法1. 实验动物、材料及仪器：24只雄性SD大鼠，体重230~250 g，由北京华阜康生物科技股份有限公司提供，合格证号：SCXK(京)2019-0010。饲养于12 h光照/12 h黑暗的环境中，自由摄食和饮水。异氟烷(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；双光子显微镜(日本Olympus公司)；X射线辐射仪(美国Rad source科技有限公司)。
2. 动物分组及实验模型制备：将SD大鼠采用随机数表法分为4组，即健康对照组、25 Gy照射组(25 Gy组)、35 Gy照射组(35 Gy组)、45 Gy照射组(45 Gy组)，每组6只。实验前1天SD大鼠臀部剃毛面积约为2 cm×2 cm。第2天麻醉后应用X射线辐射仪按照25、35和45 Gy X射线剂量进行照射，吸收剂量率为4 Gy/min，健康对照组仅作剃毛处理。TPEP成像扫描参数，步进2.5 μm，图像采集像素1 024×1 024，采集速度4 μm/像素。
3. TPEP成像技术检测表皮细胞NAD(P)H荧光信号：分别在X射线照射5、10、15、20、25、30和35 d，各组大鼠经异氟烷麻醉后固定于双光子显微镜载物台上，采用激发波长为750 nm，数值孔径为1.05的25倍水浸显微物镜对皮损中心部位NAD(P)H荧光信号进行扫描，观察表皮颗粒层、棘层和基底层细胞荧光信号的病理变化。
4. TPEP成像技术检测真皮胶原纤维荧光信号：分别在X射线照射后不同时间，各组大鼠麻醉后固定于双光子显微镜载物台上，采用激发波长850 nm，数值孔径为1.05的25倍水浸显微物镜对皮损中心部位胶原纤维进行z轴扫描，观察乳头层和网状层胶原纤维荧光信号的变化。
5. 统计学处理：采用SPSS 22.0软件进行统计分析。正态分布数据采用x±s表示。方差齐性时采用单因素方差分析及LSD-t检验，方差不齐时采用Dunnett-t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1. 皮肤损伤变化：X射线照射第5天，各组皮肤外观基本没有变化。第10天，各剂量组大鼠均出现红斑和脱皮。第15天，25 Gy组皮肤出现红斑，35和45 Gy组出现明显红斑和渗出，45 Gy组兼有溃疡。25 Gy组第20天出现红斑、水肿和渗出，第25天开始愈合。第20~30天，35和45 Gy组照射后均出现渗出、水肿和溃疡。第35天，25 Gy组皮肤局部有淡红斑，35 Gy组损伤周围皮肤愈合，45 Gy组中间仍有渗出和溃疡，见图 1。
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图 1 不同剂量X射线引起大鼠皮肤损伤的成像图 Figure 1 Images of rat skin damage caused by different doses of X-rays |
2. TPEF成像技术检测不同剂量X射线引起大鼠表皮细胞NAD(P)H荧光信号的变化：X射线照射第5天，表皮颗粒层细胞NAD(P)H荧光信号较强，各组之间没有明显变化。第10天，25 Gy组颗粒层细胞NAD(P)H明显降低，棘层和基底层部分细胞有NAD(P)H荧光信号，35和45 Gy组没有发现荧光信号。第15~25天，各剂量组颗粒层、棘层和基底层细胞均没有NAD(P)H荧光信号。第30天，25 Gy组颗粒层出现微弱的信号，棘层和基底层细胞出现较强NAD(P)H荧光信号，35和45 Gy组没有发现荧光信号。这些结果说明X射线照射后10 d颗粒层、棘层和基底层细胞NAD(P)H信号减少，第30~35天，25 Gy组颗粒层、棘层和基底层细胞NAD(P)H信号逐渐出现，见图 2。
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图 2 不同剂量X射线后不同时间大鼠表皮颗粒层、棘层和基底层细胞NAD(P)H荧光信号的表达 Figure 2 Expression of NAD (P) H fluorescence signals in rat epidermal granular layer, spinous layer and basal layer at different times after different doses of X-rays |
3. TPEP成像技术检测不同剂量X射线引起大鼠真皮胶原纤维荧光信号的变化
(1) 真皮乳头层胶原纤维荧光信号的变化：乳头层胶原纤维荧光信号见表 1。第5天，乳头层胶原纤维荧光信号较强，各组之间变化差异无统计学意义(P>0.05)。第10天，25、35和45 Gy组荧光信号均降低，与健康对照组比较，差异有统计学意义(t=24.145、28.303、26.989，P < 0.05)。第15~30天，3个剂量组荧光信号持续降低，与健康对照组比较，荧光信号均显著降低(t=40.701~176.352，P < 0.05)。第35天，25 Gy组乳头层胶原纤维荧光信号逐渐增多，35和45 Gy组荧光信号仍较弱，与健康对照组比较，荧光信号均明显降低(t=31.760、76.385、97.207，P < 0.05)。这些结果提示X射线照射第10天真皮乳头层胶原纤维信号减少，第35天，低剂量25 Gy组乳头层胶原纤维信号开始恢复。
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表 1 不同剂量X射线照射后不同时间大鼠真皮乳头层胶原纤维荧光信号值的变化(x±s) Table 1 Changes of fluorescence signal values of collagen fibers in dermal papillary layer of rats at different time after different doses of X-ray irradiation(x±s) |
(2) 真皮网状层胶原纤维荧光信号的变化：第5天，网状层胶原纤维荧光信号较强，各剂量组之间差异无统计学意义(P>0.05)。第10天，随着照射剂量的增加，辐射组胶原纤维荧光信号呈递进性减少。第10~25天，与健康对照组比较，3组荧光信号降低差异均有统计学意义(t=5.968~ 62.631，P < 0.05)。第30~35天，25 Gy组网状层胶原纤维荧光信号逐渐增加，但3组荧光信号仍明显低于健康对照组(t=17.431~108.171，P < 0.05)，见表 2。这提示X射线照射第10天真皮网状层胶原纤维荧光信号开始减少，第35天，低剂量组网状层胶原纤维信号开始恢复。
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表 2 不同剂量X射线照射后不同时间大鼠真皮网状层胶原纤维荧光信号值的变化(x±s) Table 2 Changes of collagen fiber fluorescence signal value in rat dermal reticular layer at different time after different doses of X-ray irradiation(x±s) |
讨论
急性放射性皮肤损伤的造模方式常使用X、γ及β射线等，剂量多为单次大剂量的照射方式，剂量为10~60 Gy不等，目前暂无统一规范[5]。其中X射线波长范围大致从0.01到10 nm[6]，是临床恶性肿瘤患者治疗最常使用的射线类型，所以本实验选择X射线照射SD大鼠，同时本实验选择大鼠臀部作为造模部位，目的是尽可能减少射线对动物内脏的影响。
研究发现射线引起皮肤的急性损伤，一般在放疗治疗几天后出现症状，表现为不同程度的原发性短暂性红斑、全身性红斑、皮肤干燥、脱发、色素沉着、干性脱皮、皮肤结垢和剥落、湿性脱皮[7]。不同剂量X射线造成的皮肤损伤严重程度不同，其中红斑、干性脱皮和湿性脱皮是皮肤损伤严重程度的重要指标。当辐射剂量达20 Gy时，皮肤出现皮肤瘙痒和剥落的干性脱皮[8]；当辐射剂量超过30和40 Gy时，皮肤出现发红，伴有浆液性渗出物、出血性结痂的湿性脱皮[9]。关于干性脱皮，有研究认为皮肤受到较高辐射剂量时，皮肤试图通过增加基底细胞有丝分裂率来补偿角质形成细胞，但由于新细胞周转速度比旧细胞脱落快，因此导致皮肤变厚，干性脱皮[10]。但Trueman和Taylor[11]认为干性脱皮是由于基底层替代表层细胞能力下降造成表皮脱落，而且汗液和皮脂腺受损导致皮肤润滑减少等综合因素造成。湿性脱皮是皮肤在更高辐射剂量下，基底层细胞无法恢复和进行分裂，同时分泌液被释放而形成。本实验选择25、35和45 Gy作为照射剂量，观察在不同照射剂量下，大鼠皮肤损伤出现的症状。结果发现在25 Gy剂量下，皮肤损伤以红斑、水肿和脱皮为主，兼有少量渗出，35 Gy剂量下出现红斑、水肿和渗出，45 Gy剂量组除出现红斑和渗出外，还出现溃疡。同时本实验发现25 Gy照射剂量可引起放射性皮肤损伤的典型特点，且不会引起大鼠死亡，适合作为放射引起非溃疡性皮肤损伤的造模剂量。
放射性皮肤损伤和修复时间不同于切割伤和烧烫伤，本实验发现放射性皮肤损伤一般在第10天皮肤开始出现红斑和脱皮，10~20 d皮肤损伤症状逐渐加重，出现不同程度地渗出、水肿和溃疡，低剂量25 Gy组皮肤在25~30 d开始修复，而高剂量45 Gy组皮肤在第35天仍有溃疡，皮肤没有修复。同时，本实验发现在照射第10天，肉眼可见辐射组皮肤仅有红斑和脱皮，但采用TPEF成像技术发现其表皮细胞NAD(P)H荧光信号，真皮乳头层和网状层胶原纤维已经出现不同程度地病理变化，而在疾病愈合阶段，如第35天，35 Gy组皮肤肉眼发现已开始愈合，但表皮细胞NAD(P)H荧光信号，真皮乳头层和网状层胶原纤维仍然没有修复。这表明无创、活体的TPEF成像技术在评估X射线引起大鼠皮肤放射性损伤发展、修复过程和预后方面具有传统方法无法比拟的优势。
虽然目前对放射引起皮肤损伤的研究逐渐深入[12]，但关于放射性皮肤损伤的预防和控制尚无金标准，究其原因可能仍缺乏对放射性皮肤损伤的认识。本实验通过TPEF成像技术观察辐射后表皮细胞和真皮胶原纤维发展和修复过程，建立在体、无创的评估方法，丰富前瞻性数据，为放射性皮肤损伤标准的建立以及药物的开发提供方法。
利益冲突 所有研究者声明不存在利益冲突
志谢 感谢中国中医科学院医学实验中心基本科研业务费(zz2018018)、中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目(2016-I2M-3-022)、中央高校基本科研业务费专项资金(3332020057)对本研究的资助
作者贡献声明 贺改英负责实验操作和论文撰写；勾文峰负责实验操作；王毅负责实验设计；侯文彬指导研究设计；唐靖惠负责数据采集；马淑骅、孙娅楠、杨伟峰和方蔷负责分析数据和统计数据；李祎亮负责实验设计及论文修改
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