核与辐射技术已经广泛应用于国防、医疗等领域，在造福人类的同时也给当今世界带来潜在的核与辐射危险，因此，研究电离辐射损伤机制，探寻电离辐射损伤防治新靶点具有十分重要的意义^[1-2]。在辐射损伤防治领域，继Burdelya等^[3]报道TLR5激动剂CBLB502具有极强的辐射防护效果之后，TLRs家族其他成员的辐射防护作用也相继被发现^[4-5]。但由于TLRs功能十分广泛，使得其激动剂辐射防护作用与副作用同时存在，这限制了TLRs激动剂在辐射损伤防治中的应用转化。

课题组前期通过基因敲除小鼠证明TLR2是辐射损伤防护的关键靶点^[6]，microRNA(miRNA)是一类长度约22个核苷酸的单链非编码RNA分子，近几年国内外已经报道多条miRNA与辐射损伤防护、放射敏感性等相关。本研究从TLR2辐射防护作用入手，以TLR2 KO小鼠为研究对象，希望通过转录组测序找出TLR2下游与辐射防护调控相关的关键miRNA，为解决电离辐射损伤难题提供潜在靶点。

1.主要试剂及仪器：胎牛血清购自美国GIBCO公司，培养基、EDTA-胰酶、磷酸盐缓冲液(PBS)购自美国Hyclone公司，红细胞裂解液购自上海博光生物公司，电转试剂(Amaxa cell line nucleofector kit)购自德国Amaxa公司，CCK-8(cell counting kit-8)试剂购自日本同仁化学研究所，Annexin V-FITC/PI-PE凋亡试剂盒购自北京Transgen公司，TRIzol试剂购自美国InvitroGen公司，Pam3CSK4(PAM3)购自法国InvivoGen公司，miR-NC、miR-21、miR-NC ASO、miR-21 ASO为上海吉玛公司产品。小动物血液三分类计数仪为深圳Mindary公司产品，荧光定量PCR仪为美国Thermofisher公司产品，流式细胞仪为美国Backman公司产品。

2.动物与细胞培养：7周龄TLR2 KO、MyD88 KO雄性小鼠购自南京大学模式动物研究所；7周龄C57BL/6雄性野生型(WT)小鼠购自海军军医大学实验动物中心，动物合格证号：20180006014971。生存期实验每组小鼠7~10只，其他实验每组3只，体重(18±2) g，养于日夜交替采光、24℃恒温动物房中。小鼠胚胎成纤维细胞NIH/3T3和小鼠淋巴瘤细胞EL4购自美国模式培养物集存库(American Type Culture Collection, ATCC)，培养条件为DMEM+10%胎牛血清+1%双抗，5%CO₂，37℃恒温恒湿培养箱。

3.小鼠生存期实验：照射源采用⁶⁰Co γ射线，7周龄WT与TLR2 KO雄性小鼠分别标记为WT组、TLR2 KO组，采用不同剂量单次全身照射，照射剂量分别为6.0、7.0、9.0 Gy，剂量率为1.0 Gy/min。照后每隔24 h记录小鼠生存情况并绘制生存曲线。在TLR2配体PAM3防治小鼠急性辐射损伤的实验中，实验分组为PAM3组(腹腔注射给药50 mg/kg)和PBS组(腹腔注射100 μl)。

4.骨髓细胞(BMCs)及外周血白细胞(WBCs)计数：在7.0 Gy照射后第1、5、14、20、28天取WT组和TLR2 KO组小鼠单侧股骨，用PBS将BMCs冲出，使用红细胞裂解液处理后，采用流式细胞仪进行BMCs相对计数。在7 Gy照射后第1、5、14、20、28天取小鼠外周血约20 μl，充分抗凝后使用小动物血液三分类计数仪进行WBCs计数。

5.细胞活力与凋亡检测：细胞采用8.0 Gy γ射线照射，剂量率为1.0 Gy/min。照射后细胞活力采用CCK-8试剂进行检测，相对细胞活力(%)=(A_处理-A_空白)/(A_对照-A_空白)×100%。细胞凋亡采用流式细胞术进行检测，WT和TLR2 KO小鼠分别予7 Gy照射(3只)和不照射(3只)，照后24 h取小鼠BMCs后进行Annexin V-FITC/PI-PE双染色，室温孵育20 min后进行流式细胞术分析，凋亡率(%)=100%-左下象限%(FITC^-/PE^-)。

6.骨髓移植(bone marrow transplantation, BMT)实验：无菌条件下取WT和TLR2 KO小鼠骨髓细胞，使用红细胞裂解液处理后制备细胞悬液，调整细胞浓度至1×10⁷/ml后，通过尾静脉将细胞悬液注入7.0 Gy“清髓”后的C57BL/6受体小鼠(照射后24 h内)，0.2 ml/只。分别标记为：WT BMC组、TLR2 KO BMC组，以及空白组NO BMC组。

7.转录组测序：7 Gy照射后24 h取小鼠BMCs，红细胞裂解液处理后，采用TRIzol法提取BMCs内总RNA。转录组测序委托广州锐博生物有限公司进行。

8.定量PCR(QT-PCR)：采用上海吉玛公司的Hairpin-itTM miRNA反转录及定量PCR试剂盒。以GAPDH为内参，计算miRNA的相对表达水平。

9. miRNA过表达/敲低细胞模构建：选取BMCs、NIH/3T3、EL4为研究对象，使用miR-21 mimics及ASO对miR-21分别进行过表达和敲低，分别标记为对照组(miR-21NC)、过表达组(miR-21mimics)和敲低组(miR-21ASO)。使用QT-PCR检测miR-21过表达及敲低情况。

10.统计学处理：采用SPSS 19.0统计软件进行分析，符合正态分布的数据以x±s表示。两组之间差异的比较采用两独立样本t检验。单因素方差分析(ANOVA)用于符合正态分布且方差齐的3组及3组以上之间差异的比较。转录组数据采用DEGseq R语言包，基于泊松分布分析Q值，Q < 0.05时，表示基因表达差异非常显著。使用GraphPad Prism软件，采用Kaplan-Meier方法分析两组间生存率的差异。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.生存期实验评价TLR2 KO小鼠的辐射敏感性：结果如图 1所示，在不同照射剂量条件下，TLR2 KO小鼠的生存率明显低于WT小鼠(χ²=4.490、13.100、7.928，P < 0.05)。

图 1 不同剂量γ射线照射后WT小鼠与TLR2 KO小鼠的存活曲线  A.6.0 Gy；B.7.0 Gy；C.9.0 Gy Figure 1 Survival curves of WT mice and TLR2 KO mice exposed to different doses of γ-rays  A. 6.0 Gy; B. 7.0 Gy; C. 9.0 Gy

2. TLR2 KO小鼠辐射敏感性增加与BMCs损伤相关：在7.0 Gy照射后不同时间点，TLR2 KO小鼠的WBCs和BMCs数目均小于WT小鼠(表 1，2)。

表 1(Table 1)

表 1 7.0 Gy γ射线照射后不同时间两组小鼠白细胞数目变化(x±s) Table 1 Number of WBCs after TBI of 7.0 Gy γ-rays(x±s) 组别 只数 第0天 第1天 第5天 第14天 第20天 第28天 WT组 3 12.50±0.75 9.43±0.43 5.87±0.20 2.40±0.26 4.30±0.29 9.40±0.46 TLR2 KO组 3 13.67±0.60 6.40±0.29 2.23±0.18 0.80±0.06 1.30±0.15 3.30±0.21 t值 1.213 5.826 13.520 5.908 9.186 12.040 P值 >0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05

表 1 7.0 Gy γ射线照射后不同时间两组小鼠白细胞数目变化(x±s) Table 1 Number of WBCs after TBI of 7.0 Gy γ-rays(x±s)

表 2(Table 2)

表 2 7.0 Gy γ射线照射后不同时间两组小鼠骨髓细胞数目变化(x±s) Table 2 Number of BMCs after TBI of 7.0 Gy γ-rays(x±s) 组别 只数 第0天 第1天 第5天 第14天 第20天 第28天 WT组 3 3 615±171 1 700±101 1 104±100 803±55 1 198±93 2 562±167 TLR2 KO组 3 3 912±157 911±61 712±48 395±30 537±50 1 204±102 t值 1.281 6.704 3.533 6.554 6.244 6.930 P值 >0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05

表 2 7.0 Gy γ射线照射后不同时间两组小鼠骨髓细胞数目变化(x±s) Table 2 Number of BMCs after TBI of 7.0 Gy γ-rays(x±s)

在7.0 Gy照后24 h检测凋亡发现TLR2 KO小鼠BMCs凋亡率大于WT小鼠(37.77±1.951，21.19±0.462，t=8.274，P < 0.05)，未照射小鼠BMCs凋亡率未见差异(5.207±0.613，6.663±0.254，P>0.05)(图 2)。BMT实验发现TLR2 KO小鼠来源的BMCs不能挽救清髓小鼠的存活(χ²=4.291，P < 0.05)，证明TLR2 KO小鼠辐射敏感性增加与BMCs损伤相关(图 3)。

图 2 7.0 Gy γ射线照射后24 h WT组和TLR2 KO组小鼠与未照射小鼠BMCs凋亡情况  A. WT小鼠BMCs未照射组；B. WT小鼠BMCs照射组；C. TLR2 KO小鼠BMCs未照射组；D. TLR2 KO小鼠BMCs照射组 Figure 2 The apoptosis rates of BMCs were analyzed by flow cytometry at 24 h after 7.0 Gy γ-rays irradiation  A. BMCs in TLR2 WT mice without irradiation; B. BMCs in TLR2 KO mice without irradiation; C. BMCs in TLR2 WT mice with irradiation; D. BMCs in TLR2 KO mice with irradiation

图 3 WT与TLR2 KO小鼠BMCs移植后清髓小鼠的存活曲线 Figure 3 Survival curves of irradiated mice after BMCs transplantation

3.转录组测序筛选到TLR2通路下游关键调控分子miR-21：结果见图 3。通过转录组测序对7.0 Gy照后WT组和TLR2 KO组小鼠BMCs进行差异基因筛选，发现差异基因55个([log2 Fold Change]>0.95，Q < 0.05)，其中上调基因28个，下调基因27个，对下调差异最大的前10个差异分子进行文献调研与论证，发现miR-21在生长发育、免疫反应等多个生物学进程中均发挥关键作用，在放射生物医学领域也已有研究报道miR-21可以参与辐射致癌进程，但miR-21参与TLR2辐射防护中的作用仍未见报道，因此锁定miR-21进行后续研究(表 3)。同时对差异基因进行KEGG通路富集分析，发现NF-kappaB(mmu04064)、TNF(mmu04668)和Toll样受体(mmu04620)3个信号通路显著富集(P < 0.05)。

表 3(Table 3)

表 3 下调差异最大的前10个差异基因列表 Table 3 The top 10 down-regulated differential genes 基因名称 WT表达量 TLR2 KO表达量 差异倍数 Q值 Mir1901 24.425 1.781 -3.778 < 0.05 Mir21 49.780 3.836 -3.698 < 0.05 Erdr1 65.426 12.471 -2.391 < 0.05 Mir1198 91.003 21.270 -2.097 < 0.05 Dusp2 42.554 10.767 -1.983 < 0.05 Cd14 643.517 166.695 -1.949 < 0.05 Nfkbia 328.190 86.502 -1.924 < 0.05 Nfkbie 45.792 13.734 -1.737 < 0.05 Irg1 422.470 144.086 -1.552 < 0.05 Cyth1 100.758 35.020 -1.525 < 0.05   注：差异倍数为log2 Fold Change

表 3 下调差异最大的前10个差异基因列表 Table 3 The top 10 down-regulated differential genes

4. miR-21表达量变化依赖于TLR2、MyD88：结果见图 4。定量PCR结果证实与WT组相比，TLR2 KO组(t=9.420，P < 0.05)与MyD88 KO组(t=10.700，P < 0.05)小鼠BMCs内miR-21表达量下调(图 4A )。使用TLR2配体PAM3刺激BMCs后可以上调WT组小鼠BMCs内miR-21表达(t=4.636，P < 0.05)，而TLR2 KO组与MyD88 KO组小鼠BMCs内miR-21表达量无显著变化(P>0.05)，表明miR-21的上调依赖TLR2与MyD88(图 4B)。与PBS组相比，PAM3可以促进7.0 Gy照后小鼠存活(χ²=4.038，P < 0.05)(图 4C)。定量PCR结果表明，PAM3刺激后WT小鼠BMCs内辐射防护因子IL-6(t=13.79，P < 0.05)和TNF-α(t=14.28，P < 0.05)表达量上调，而TLR2小鼠BMCs内IL-6和TNF-α的表达量差异无统计学意义(P>0.05)，表明IL-6和TNF-α的表达量上调同样依赖于TLR2(图 4D，4E)。

注：a与WT小鼠比较，t=9.420、10.700、4.636、13.790、14.280，P < 0.05 图 4 miR-21表达量的验证  A.不同小鼠BMCs内miR-21表达量检测；B. PAM3组与PBS组BMCs内miR-21的表达量变化；C. PAM3对WT小鼠生存率的影响；D. PAM3刺激后WT组、TLR2 KO组小鼠BMCs内IL-6表达量变化；E. PAM3刺激后WT组、TLR2 KO组小鼠BMCs内TNF-α表达量变化 Figure 4 The expression of miR-21  A. The expression of miR-21 in BMCs of TLR2 WT mice, TLR2 KO mice and MyD88 KO mice; B. The changes of miR-21 expression in BMCs after PAM3 stimulation; C. Effects of PAM3 on the survival rate of mice; D. The changes of IL-6 expression in BMCs after PAM3 stimulation; E. The changes of TNF-α expression in BMCs after PAM3 stimulation

5.构建miR-21过表达与敲低细胞模型：以BMCs、NIH/3T3、EL4为实验对象，验证miR-21本底表达量(0.041 7±0.004 0，0.012 0±0.001 7，0.140 7±0.009 0，F=133.7，P < 0.05)。转入miR-21mimics和miR-21 ASO构建miR-21过表达与敲低细胞模型，miR-21 NC作为对照，并采用QT-PCR验证，结果见表 4，5。miR-21 mimics电转可上调WT小鼠BMCs、TLR2 KO小鼠BMCs、NIH/3T3、EL4内miR-21水平数倍到数百倍。miR-21 ASO电转可下调NIH/3T3和EL4内miR-21表达水平约40%~50%，WT小鼠和TLR2 KO小鼠BMCs下调无显著差异。

表 4(Table 4)

表 4 miR-21过表达细胞模型的建立(x±s) Table 4 The establishment of the miR-21 overexpression cell model(x±s) 组别 样本数 WT BMCs TLR2 KO BMCs NIH/3T3 EL4 miR-21 NC 3 0.033 7±0.003 2 0.006 0±0.000 6 1.007 0± 0.167 5 1.033 0±0.116 7 miR-21 mimics 3 0.094 0±0.003 2 0.042 0±0.002 3 285.700 0±13.370 0 6.667 0±0.318 0 t值 13.34 15.12 21.29 16.63 P值 < 0.05 < 0.05 < 0.05 < 0.05

表 4 miR-21过表达细胞模型的建立(x±s) Table 4 The establishment of the miR-21 overexpression cell model(x±s)

表 5(Table 5)

表 5 miR-21敲低细胞模型的建立(x±s) Table 5 The establishment of the miR-21 knockdown cell model(x±s) 组别 样本数 WT BMCs TLR2 KO BMCs NIH/3T3 EL4 miR-21 NC 3 0.033 3±0.003 5 0.007 0±0.000 6 0.946 7±0.031 8 1.050 0±0.036 1 miR-21 ASO 3 0.028 7±0.002 0 0.006 8±0.001 1 0.353 3±0.037 6 0.516 7±0.043 3 t值 1.159 0.1388 12.06 9.461 P值 >0.05 >0.05 < 0.05 < 0.05

表 5 miR-21敲低细胞模型的建立(x±s) Table 5 The establishment of the miR-21 knockdown cell model(x±s)

6.过表达与敲低miR-21对细胞活力和凋亡的影响：通过CCK-8以及Annexin V/PI双染法分别检测8.0 Gy照射后细胞活力以及凋亡情况，发现miR-21过表达可以促进EL4和NIH/3T3辐射后细胞活力，敲低后降低EL4和NIH/3T3辐射后细胞活力(表 6，7)。miR-21过表达抑制WT(24.45±1.350，17.65±0.3920，t=4.842，P < 0.05)和TLR2 KO(39.90±1.194，23.14±1.056，t=10.520，P < 0.05)小鼠BMCs辐射后细胞凋亡(图 5)。

表 6(Table 6)

表 6 过表达miR-21对辐射后相对细胞活力的影响(x±s) Table 6 The effect of miR-21 over-expression on cell viability(x±s) 组别 样本数 NIH/3T3 EL4 miR-21 NC 3 76.33±1.764 46.00±2.082 miR-21 mimics 3 90.33±2.333 68.00±3.055 t值 4.786 5.951 P值 < 0.05 < 0.05

表 6 过表达miR-21对辐射后相对细胞活力的影响(x±s) Table 6 The effect of miR-21 over-expression on cell viability(x±s)

表 7(Table 7)

表 7 敲低miR-21对辐射后相对细胞活力的影响(x±s) Table 7 The effect of miR-21 knockdown on cell viability(x±s) 组别 样本数 NIH/3T3 EL4 miR-21 NC 3 78.00±2.082 46.67±2.333 miR-21 ASO 3 67.87±1.397 33.00±1.617 t值 4.042 4.815 P值 < 0.05 < 0.05

表 7 敲低miR-21对辐射后相对细胞活力的影响(x±s) Table 7 The effect of miR-21 knockdown on cell viability(x±s)

图 5 过表达miR-21对照射后BMCs凋亡的影响  A. WT小鼠BMCs miR-21 NC组；B. TLR2 KO小鼠BMCs miR-21 NC组；C. WT小鼠BMCs miR-21过表达组；D. TLR2 KO小鼠BMCs miR-21过表达组 Figure 5 The effect of miR-21 over-expression on BMCs apoptosis  A. TLR2 WT BMCs transfected with miR-21 NC; B. TLR2 KO BMCs transfected with miR-21 NC; C. TLR2 WT BMCs transfected with miR-21 mimics; D. TLR2 KO BMCs transfected with miR-21 mimics

电离辐射损伤防治是核能安全利用急需解决的关键问题，深入研究和探索辐射损伤防护机制，寻找潜在辐射防治新靶点具有重要意义^[7]。自2008年Science杂志报道激活TLR5具有明显的辐射防护作用后，TLRs及其TLRs相关配体在电离辐射研究领域得到了越来越多的关注^[3]。本课题组也通过基因敲除小鼠证实TLR2/4在辐射损伤防治中发挥关键作用^{[5-6, 8]}。

miRNA是一类由内源基因编码的长度约22核苷酸的非编码单链RNA分子，主要以碱基互补方式与靶基因mRNA的3′-非翻译区(3′-UTR)特异性结合发挥生物学作用^[9-10]。近几年国内外已经报道多条miRNA与辐射损伤防护、放射敏感性等相关^[11-13]。Abdelfattah等^[14]通过转录组测序筛选到miR-584-5p，发现其可增强成神经管细胞瘤对辐射和长春新碱的耐受。Chen等^[15]发现miR-450a-5p通过靶向双特异性磷酸酶10(DUSP10)抑制细胞自噬进程，提高食管鳞癌放射敏感性。课题组前期也发现，miR-143在辐射诱导的BALB/c小鼠胸腺淋巴瘤模型中表达下调，并通过靶向B7H1促进辐射诱导的胸腺淋巴瘤^[16]。这些研究充分说明miRNA在放射生物学中的关键作用，强烈提示在TLR2通路下游也可能存在某些与放射敏感性相关的重要调控miRNA。

本课题从研究TLR2辐射防护作用入手，希望通过转录组测序找出TLR2信号通路下游与辐射损伤防护作用调控相关的关键miRNA，为解决难治性电离辐射损伤难题提供潜在靶点。在本研究中通过生存期实验证明TLR2 KO小鼠放射敏感性显著增加，在照后不同时间点通过BMCs计数和WBCs计数发现，TLR2 KO小鼠的骨髓造血系统损伤较WT小鼠更加严重，进一步发现辐射后TLR2 KO小鼠的BMCs凋亡增加，BMT实验证明TLR2 KO小鼠放射敏感性的增加与BMCs有关。随后对7.0 Gy照后24 h的WT和TLR2 KO小鼠BMCs进行转录组测序，筛选到差异基因55个，其中上调基因28个，下调基因27个，并对差异基因进行KEGG通路富集分析，KEGG通路中Toll-like receptor signaling pathway、TNF signaling pathway和NF-kappaB signaling pathway显著富集。TNF和NF- kappaB信号通路在前期研究中已被证实与辐射防护有关，这也与KEGG结果相一致^[17-18]。通过对下调差异最大的前10个差异分子进行文献调研与论证，最终锁定miR-21进行后续研究。

miR-21在生长发育、免疫反应、癌症发生等生物学进程中均发挥关键作用^[19-20]。在放射生物学领域，Liu等^[21]证明miRNA-21通过下调PTEN参与电离辐射诱导的上皮细胞向间质转化。本课题组前期也报道miR-21以3′-UTR依赖的方式直接靶向肿瘤抑制基因Big-h3参与辐射致癌进程^[22]。但miR-21参与TLR2辐射防护中的作用仍未见报道。

通过定量PCR验证发现，miR-21在TLR2 KO与MyD88 KO小鼠BMCs内显著下调，而使用TLR2靶向配体PAM3CSK4刺激BMCs发现miR-21的上调依赖于TLR2与MyD88，通过生存期实验和定量PCR实验也再次明确PAM3CSK4靶向激活TLR2可以上调IL-6、TNF-α等细胞因子发挥辐射防护作用。随后选取BMCs，NIH/3T3和EL4作为实验对象过表达与敲低miR-21水平，在体外细胞层次探讨其对辐射敏感性中的调控作用。通过细胞活力和凋亡分析发现，miR-21过表达可以促进辐射后细胞活力，抑制辐射后细胞凋亡；miR-21敲低后降低照后细胞活力。

综上所述，本研究通过基因敲除小鼠、转录组测序等研究手段，筛选到TLR2信号通路下游与辐射损伤防护作用调控相关的关键miR-21，并对其功能进行探讨，证明miR-21在TLR2辐射防护进程中具有关键调控作用，其作用机制可能与上调IL-6与TNF-α有关。本研究丰富和加深了TLR2辐射防护的相关分子机制，为辐射损伤防治和肿瘤放疗增敏研究寻找到新靶点。下一步将继续研究miR-21调控IL-6、TNF-α等辐射防护细胞因子的具体机制，为阐明miR-21在TLR2介导辐射防护中的具体机制提供理论依据。

利益冲突  本研究全体作者无利益冲突

作者贡献声明  杜继聪负责实验和论文撰写；刘入菱、程赢负责细胞培养和动物实验；蔡建明、刘聪负责实验设计与指导；高福负责数据统计