放射治疗(radiotherapy, RT)可以重塑患者免疫和肿瘤微环境，以多种潜在方式激活患者的抗肿瘤免疫反应。研究表明，RT与免疫治疗相结合可以产生协同作用^[1]，从而增强抗肿瘤免疫反应。吲哚胺2，3-双加氧酶(indoleamine 2,3-dioxygenase，IDO)是色氨酸(tryptophan, Trp)转化为犬尿氨酸(kynurenine, Kyn)的关键酶。由于Kyn是Trp代谢的主要代谢产物，所以血浆Kyn及Kyn ∶Trp用于监测IDO活性^[2]。据报道,IDO高表达有助于肿瘤细胞逃避免疫监视^[3-4]，与化疗耐药性以及非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC) 生存期降低有关^[5\|6]。然而，目前尚不清楚早期NSCLC体部立体定向放射治疗(stereotactic body radiotherapy, SBRT)是否改变IDO介导的免疫活性，以及这些变化是否对患者的生存产生影响。本研究为回顾性研究，假设SBRT可以改变IDO活性，并最终影响NSCLC患者的生存。通过定量SBRT前后与IDO检查点相关的分子，来评估IDO介导的免疫活性。

1. 临床资料：收集2014年12月至2017年7月间在中国科学院大学附属肿瘤医院接受SBRT治疗的早期NSCLC患者。入组标准：病理或细胞学诊断为NSCLC；所有患者均PET/CT扫描分期为T₁N₀M₀(国际抗癌联盟UICC第7版)；既往未接受过抗肿瘤治疗；美国东部肿瘤协作组(ECOG)PS评分0～2分；年龄18岁以上；确诊后同意行SBRT治疗；拒绝手术治疗或者有手术禁忌证无法行手术治疗。共30例患者入组，其中男性26例，女性4例。中位年龄为68岁(52～86岁)。患者的临床资料见表1。

表 1(Table 1)

表 1 30例早期非小细胞肺癌患者的临床特征 Table 1 The clinical characteristics of 30 patients with early stage non-small cell lung cancer 因素 例数 构成比(%) 性别 男 26 86.7 女 4 13.3 年龄(岁) ＜65 8 26.7 ≥65 22 73.3 吸烟史(包/年) ≤30 13 43.3 ＞30 17 56.7 合并症 无 12 40.0 有 18 60.0 肿瘤分期 IA 22 73.3 IB 8 26.7 肿瘤类型 鳞癌 10 33.3 腺癌 14 46.7 非小细胞肺癌 6 20.0 肿瘤位置 中央型 3 10.0 周围型 27 90.0

表 1 30例早期非小细胞肺癌患者的临床特征 Table 1 The clinical characteristics of 30 patients with early stage non-small cell lung cancer

2. 血清样本收集：经本院伦理委员会审批，所有NSCLC患者分别于SBRT治疗前和治疗后1周抽取空腹外周静脉血5 ml，置于促凝管中，常温下分离血清，离心半径15 cm,3 000 r/min离心15 min，将血清置于-80℃低温保存备用。

3. IDO活性检测及分析：IDO是Trp转化为Kyn的关键酶，所以利用血浆Kyn及Kyn ∶Trp比值评估IDO活性。用高效液相色谱法测定血清样本中Trp和Kyn的浓度，采用DIONEX UltiMate 3000高效液相色谱仪(美国DIONEX公司)。色谱条件：①色谱柱Thermo Hypersil GOLD 100×2.1 mm, 1.9 μm(美国赛默飞公司)。②流动相为15 mmol/L醋酸钠缓冲液(pH 4.0)和乙腈(体积比为95∶5)。③流速为0.2 ml/min。④进样量为20 μl。⑤柱温保持在25 ℃ 。⑥紫外线检测波长：Trp(278 nm)，Kyn(360 nm)。样本处理及检测：从-80℃冰箱取出备用血清，置于室温待其融化后，取其中0.5 ml血清样本至EP管中，加入5%高氯酸溶液0.5 ml，盖好后在振荡器上振荡混匀2 min，室温下放置15 min，以充分沉淀血清蛋白质，然后以离心半径10 cm，10 000 r/min离心10 min，取上清液20 μl进样分析。实验重复3次，并记录这些样品的平均浓度。根据放疗后Kyn与放疗前Kyn浓度比值的中位数为截断值(1.10)，将高于中位数的患者分为Kyn高水平组，而低于中位数的患者为Kyn低水平组。同理，根据放疗后Kyn ∶Trp比值的中位数为截断值，将患者分为Kyn ∶Trp高水平组和Kyn ∶Trp低水平组。

4. SBRT治疗：患者仰卧位，双手交叉置于头顶，真空垫固定，利用4DCT采集不同时相CT图像。大体肿瘤体积(GTV)为图像上可见的大体肿瘤范围。内靶区(ITV)由不同呼吸时相下勾画的GTV合并而来。计划靶区(PTV)在ITV前、后和左、右方向外放0.5 cm且上、下方向外放1.0 cm的基础上形成。根据美国国家综合癌症网络(NCCN)指南以及肿瘤部位决定处方剂量，肿瘤临近中央的患者每次分割剂量减小。给予处方剂量48～60 Gy(中位处方剂量50 Gy)，每次5～12.5 Gy，4～10次照射，中位生物有效剂量(BED)为100 Gy。剂量分布要求至少95%的PTV、99%的ITV和100%的GTV达到处方剂量，至少99%的PTV达到90%的处方剂量。患者中位数GTV和PTV分别为10.0和31.5 cm³;中位平均肺剂量为3.6 Gy；中位V₅、V₁₀和V₂₀分别为16.4%、10.4%和4.7%。

5. 随访及疗效评价：SBRT治疗期间每周对患者进行评估，并于放疗后3、6、12、18和24个月进行随访，随后每年随访1次，内容包括病史、体格检查、锁骨上淋巴结超声、胸部及上腹部CT扫描、肺肿瘤生物标志物检查。根据实体瘤的疗效评价标准(RECIST)1.1版本评价和记录肿瘤反应及复发情况。总生存(overall survival,OS)定义为从RT的第1天至死亡或末次随访日期。无进展生存(progression-free survival, PFS)定义为从RT的第1天到疾病进展、死亡或末次随访日期。

6. 统计学处理：使用SPSS 22.0统计软件进行数据分析。计量资料符合正态分布用x±s表示。使用配对t检验比较不同时间点IDO相关分子的水平。采用Kaplan\|Meier进行生存分析。Cox回归模型法评估预后因素。根据单因素分析的统计学意义将变量纳入最终的多因素分析(临界值，P<0.10)。P<0.05为差异有统计学意义。

1. NSCLC患者生存情况：30例患者中位随访期为37.4个月。中位PFS为37.5个月(95％CI=31.0～44.0)，中位OS未达到。1、2、3、4年的PFS分别为83.3%、72.9%、57.2%和44.6%，OS分别为93.3%、83.1%、70.8%和58.1%。

2．NSCLC患者放疗前后IDO相关分子活性的动态变化：放疗前Kyn浓度(77.15±15.81)ng/ml，放疗后Kyn浓度(91.14±29.51)ng/ml，两者比较差异有统计学意义(t=-3.42, P<0.05)；放疗前Kyn ∶Trp比值为(0.033 3±0.008 9)，放疗后Kyn ∶Trp比值为(0.037 8±0.013 9)，两者比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表 2(Table 2)

表 2 30例NSCLC患者放疗前后IDO相关分子活性的变化($\bar x$±s) Table 2 Dynamic changes of IDO-associated molecular activity in 30 NSCLC patients ($\bar x$±s) IDO相关参数 放疗前 放疗后 t值 P Kyn(ng/ml) 77.15±15.81 91.14±29.51 -3.42 0.002 Kyn∶Trp 3.33±0.89 3.78±1.39 -1.87 0.072 注：NSCLC.非小细胞肺癌；IDO.吲哚胺2，3-双加氧酶；Kyn.犬尿氨酸; Trp.色氨酸

表 2 30例NSCLC患者放疗前后IDO相关分子活性的变化($\bar x$±s) Table 2 Dynamic changes of IDO-associated molecular activity in 30 NSCLC patients ($\bar x$±s)

3．IDO生物标志物和患者生存的相关性：放疗后Kyn与放疗前Kyn比值较高组与比值较低组比较，比值较低组可获得更长的PFS(中位PFS: 未达到 vs. 26.8个月，HR=0.31，95％CI=0.11～0.90, P=0.032；图1A)。与放疗后Kyn ∶Trp高水平组相比，低水平组获得更长的OS(中位OS：未达到 vs. 36.5个月，HR=0.27，95％CI=0.08～0.95, P=0.042；图1B)。此外，放疗前基线Kyn或Kyn ∶Trp比值均未能预测OS或PFS的变化(P>0.05)。

注：Kyn.犬尿氨酸；Kyn ∶Tyn.犬尿氨酸与色氨酸比值；HR. 风险比；CI. 置信区间 图 1 IDO生物标志物与患者生存的关系 A.放疗后Kyn与放疗前Kyn不同比值组无进展生存曲线；B.放疗后Kyn∶Trp不同比值组总生存曲线 Figure 1 The relationship between IDO biomarkers and patient survival A.The progression-free survival curves of different ratio groups of Kyn after radiotherapy to Kyn before radiotherapy; B. The over all survivalcurves of different Kyn ∶Trp ratio groups after radiotherapy

单因素分析显示，多种临床病理特征与PFS和OS显著相关(表3)。吸烟<30包/年(HR=0.23, 95% CI=0.06～0.81, P=0.023)、高生物等效剂量(BED)(HR=0.28, 95% CI=0.10～0.80, P=0.017)、放疗后Kyn与放疗前Kyn比值较低(HR=0.30, 95% CI=0.09～0.96, P=0.043)与较长的PFS相关。高BED(HR=0.11, 95% CI=0.03～0.45, P=0.002)、放疗后Kyn ∶Trp较低(HR=0.23, 95% CI=0.05～1.08,P=0.062)与较长OS相关。在多因素分析中，吸烟<30包/年(HR=0.16, 95% CI=0.03～0.84, P=0.030)、高BED(HR=0.08, 95% CI=0.02～0.33, P<0.001)、放疗后Kyn与放疗前Kyn比值较低(HR=0.23, 95% CI=0.06～0.96, P=0.043)与较长的PFS显著相关, 放疗后Kyn ∶Trp较低(HR=0.19, 95% CI=0.04～0.93, P=0.040)、高BED(HR=0.09, 95%CI=0.02～0.40, P<0.001)与较长OS显著相关(表4)。

表 3(Table 3)

表 3 30例非小细胞肺癌患者无进展生存率和总生存率Cox法单因素预后分析 Table 3 Univariate analysis of PFS and OS in 30 NSCLC patients using Cox estimates 因素 PFS OS HR 95% CI P值 HR 95% CI P值 性别 男 1.00 1.00 女 0.04 0.01～18.26 0.298 0.31 0.01～93.23 0.414 年龄 ＜65 1.00 1.00 ≥65 1.70 0.38～7.63 0.487 0.99 0.21～4.68 0.986 吸烟(包/年) ≥30 0.23 0.06～0.08 0.023 0.45 0.12～1.75 0.252 ＜30 1.00 1.00 PS 0 1.00 1.00 1 1.74 0.53～5.71 0.361 3.12 0.64～15.07 0.158 肿瘤位置 中央型 1.00 1.00 外周型 0.67 0.40～1.13 0.129 0.63 0.08～5.18 0.670 病理 鳞癌 1.00 1.00 腺癌 1.82 0.32～3.71 0.900 1.40 0.27～7.23 0.689 非小细胞 1.05 0.23～4.59 0.979 2.00 0.33～12.04 0.451 分期 IA 1.00 1.00 IB 1.37 0.43～4.39 0.599 2.39 0.67～8.57 0.182 合并症 无 1.00 1.00 有 0.82 0.28～2.39 0.715 1.49 0.38～5.81 0.567 BED(Gy) ＜100 1.00 1.00 ≥100 0.28 0.10～0.80 0.017 0.11 0.03～0.45 0.002 放疗后Kyn∶放疗前Kyn ＞1.10 0.30 0.09～0.96 0.043 0.37 0.10～1.45 0.156 ≤1.10 1.00 1.00 放疗后Kyn∶Trp ＞0.0342 0.78 0.27～2.22 0.639 0.23 0.05～1.08 0.062 ≤0.0342 1.00 1.00 注：PFS. 无进展生存；OS. 总生存；NSCLC.非小细胞肺癌；HR. 风险比；CI. 置信区间；PS.体力状况评分；BED.生物有效剂量；Kyn.犬尿氨酸；Tyn.色氨酸

表 3 30例非小细胞肺癌患者无进展生存率和总生存率Cox法单因素预后分析 Table 3 Univariate analysis of PFS and OS in 30 NSCLC patients using Cox estimates

表 4(Table 4)

表 4 30例非小细胞肺癌患者无进展生存率和总生存率 Cox法多因素预后分析 Table 4 Multivariate analysis of PFS and OS in 30 NSCLC patients using Cox estimates 临床特征 PFS OS HR 95% CI P值 HR 95% CI P值 吸烟(包/年) ≥30 0.16 0.03～0.84 0.030 ＜30 1.00 - - BED (Gy) ＜100 1.00 - - 1.00 - - ≥100 0.08 0.02～0.33 <0.001 0.09 0.02～0.40 <0.001 放疗后Kyn∶放疗前Kyn ＞1.10 0.23 0.06～0.96 0.043 ≤1.10 1.00 - - 放疗后Kyn∶Trp ＞0.034 2 0.19 0.04～0.93 0.040 ≤0.034 2 1.00 - - 注：“-”为无数据。PFS. 无进展生存；OS. 总生存；NSCLC.非小细胞肺癌；HR.风险比；CI. 置信区间；BED. 生物等效剂量；Kyn. 犬尿氨酸；Trp. 色氨酸。吸烟与放疗后Kyn ∶放疗前Kyn单因素分析P>0.10，故均未纳入OS多因素分析

表 4 30例非小细胞肺癌患者无进展生存率和总生存率 Cox法多因素预后分析 Table 4 Multivariate analysis of PFS and OS in 30 NSCLC patients using Cox estimates

本研究结果显示，放疗后Kyn显著增加，Kyn ∶Trp有增加趋势，但无统计学意义；放疗后Kyn ∶Trp的水平与OS显著相关；放疗后Kyn与放疗前Kyn的比值与PFS显著相关；基线IDO活性与PFS、OS无显著相关。这些结果支持目前的初步假设，即IDO介导的免疫活性可被SBRT改变。

本研究的结果表明,SBRT治疗后IDO的活性升高，其潜在机制仍不清楚。研究提示高放疗剂量可以提高肿瘤局部控制率及患者生存^[7-8]。但RT剂量过高可能会损害正常组织和免疫系统^[9]，引起放射损伤的急性免疫反应。因此，探讨不引起过度免疫耗竭的最佳RT剂量及剂量分割方式非常重要。本研究结果提示,放疗可以改变IDO介导的免疫活性水平，但放疗剂量分割对免疫的作用在临床上尚未进行充分研究。一些研究报道了RT和免疫疗法的协同作用，为了获得最佳协同作用，已经构建了数学模型，试图确定RT 和免疫疗法组合的最佳时机^[10]。例如，Chakwizira等^[11]基于拟合的动物模型，开发了一个数学模型来预测最大化RT和IDO抑制剂组合的协同效应所需的RT分割次数。监测IDO介导的免疫状态可能是一种可行且实用的方法，可用于识别不同患者抗肿瘤免疫状态，并使用最佳剂量分割方法获得个性化的RT治疗，以最大程度地控制肿瘤。

本研究发现,IDO是早期NSCLC行SBRT治疗潜在的有价值的生物标志物，与先前报道IDO的免疫活性可作为化疗或免疫治疗反应的潜在预测因素的研究一致^{[6, 12]}。Wang等^[13]发现,较高的放疗后Kyn与放疗前Kyn的比值是PFS的危险因素，基线IDO活性与早期NSCLC患者的预后无显著相关，均与本研究结果一致,此外，还发现随着临床分期的增加，Kyn浓度或Kyn与Trp比值降低。这表明IDO介导的免疫状态可能随NSCLC患者的疾病阶段而异。对于早期NSCLC接受RT替代手术治疗的患者，基线IDO免疫状态可能不是决定性的预后指标，需要进一步研究以探索IDO状态与NSCLC阶段之间关系的潜在机制。

越来越多的证据表明,SBRT联合免疫抑制剂治疗具有协调作用，且患者可以耐受。Theelen等^[14]研究发现接受过至少一线化疗进展的晚期NSCLC患者SBRT后免疫治疗相比单纯免疫治疗的客观缓解率(ORR)提高近2倍(18% vs. 36%, P=0.07)，但治疗相关的不良反应无增加。Chicas-Sett等^[15]对SBRT联合免疫检查点抑制剂治疗NSCLC的疗效和安全性进行了系统回顾，结果发现SBRT联合免疫检查点抑制剂安全性良好，与单独使用SBRT相比，局部控制率更高且更有可能出现远隔效应。由美国MD Anderson癌症中心张玉蛟教授主持的立体定向放射治疗联合Durvalumab治疗早期肺癌患者的Ⅱ期随机临床试验(NCT03148327)正在招募中，旨在观察患者生存以及疾病复发、转移情况，期待其研究结果。IDO作为免疫检查点，可能成为抗癌药物的重要靶点。Friberg等^[16]研究发现在小鼠Lewis 肺癌模型中 IDO抑制药能够延缓小鼠体内肿瘤的生长。一项针对Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者标准化疗后疾病稳定行IDO肽疫苗治疗的试验研究(NCT01219348)获得了较好的结果，无严重不良反应^[17]。多种IDO抑制剂正在进行多项临床试验^[18]。SBRT联合IDO抑制剂可能成为新的肿瘤治疗方向。

改善NSCLC患者预后的可能解决方案是多学科综合治疗。但是，RT和IDO抑制剂或其他免疫治疗药物联合使用的关键问题是RT方案的优化和确定使用IDO抑制剂的最佳时间。鉴于血液生物标记物的非侵入性，其有可以在治疗过程中提供实时评估的优势^[19]。血液生物标记物可用于预测癌症治疗的效果，提供可能复发的早期预警以及放疗关键危及器官的放疗耐受性^[20]。本研究涉及IDO活性的血液生物标志物，可能有助于临床上指导放疗的个体化实施。

本研究仍然存在一些局限性。首先，为小样本回顾性研究，结果仍待大样本的前瞻性随机对照研究论证。其次，本研究只检测了SBRT治疗前后IDO活性。可进一步检测患者SBRT治疗期间IDO活性，动态观察IDO的变化。此外，本研究为早期NSCLC患者，单个局限性病灶，无法排除单个病灶和多个病灶、不同分期患者接受SBRT治疗后血清IDO变化的差异性，仍需扩大样本量多方面、多层地选取临床病例进行研究。

综上所述，SBRT可改变IDO介导的抗肿瘤免疫活性。本研究表明，IDO是一种潜在的重要生物标志物，可用于监测早期NSCLC患者SRRT治疗后免疫状态，对预测患者生存有一定价值。

利益冲突  无

作者贡献声明  朱瑶瑶做实验、统计分析及撰写论文；胡敏、徐清华整理数据；孙晓江收集资料、协助部分实验的完成；叶影协助统计分析；刘宇负责论文修改；冯建国指导实验；许亚萍负责研究设计