2020, Vol. 40
近年来，随着核与辐射技术的快速发展，核与辐射事故时有发生。应用有效的生物分析技术估算大人群的受照剂量，是制定应对措施及指导人员临床治疗的关键。经典的细胞遗传学方法在估算生物剂量时，存在实验周期长、分析较为复杂等局限性，难以应对大人群生物剂量估算的要求[1]。因此，探索新的快速、高通量的辐射损伤生物标志物极为重要。
脂质组学(lipidomics)的概念是由Han等[2]在2003年首次提出的，可通过对生物体、组织或细胞中脂质代谢物及与其相互作用分子进行全面分析与鉴定，了解脂质结构和功能，揭示脂质代谢与细胞、器官及机体的生理病理过程之间的关系[3]。目前，脂质组学检测多采用色谱-质谱联用技术，分析方法主要包括非靶向分析和靶向分析两类。非靶向脂质组学方法能够无偏向的对生物样品中所有脂质进行分析，最大程度地反映样品中脂质的变化规律，从而找出差异标志物，为疾病诊断和机制研究提供依据。本研究采用基于液相色谱质谱串联平台(LC-MS)的非靶向脂质组学方法，研究受到60Co γ射线全身照射的大鼠血浆中脂质代谢物的变化，筛选辐射敏感脂质代谢物，探索其剂量-效应关系并分析代谢通路，为快速、高通量的辐射损伤生物标志物研究提供科学依据。
材料与方法1.动物分组与照射条件：雄性SD大鼠20只(SPF级)，6~8周龄，体重200~250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，生产许可证号为SYXK(京)2016-0006。用单纯随机抽样方法将大鼠分为健康对照组和3个照射组，每组5只。在北京市辐射中心用60Co γ射线对大鼠进行全身照射，照射剂量分别为0、1、3、5 Gy，剂量率为1 Gy/min，源强130 TBq，源靶距84 cm，平均照射野50 cm×50 cm。本研究所有动物实验已通过中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所实验动物伦理福利委员会审查。
2.血浆样本制备：大鼠照射后放回屏障系统继续饲养7 d，通过眼眶内眦静脉采血1~2 ml，采集的血液存放于EDTA抗凝管中，4℃ 3 000 r/min(离心半径15 cm)，离心10 min，取上清，血浆分装后置于-80℃冰箱冻存。
3.样品预处理：血浆样本在4℃解冻，取100 μl加入1.5 ml EP管，加入300 ml甲醇及1 ml甲基叔丁基醚，充分振荡15 s，进行蛋白沉淀。4℃ 12 000 r/min(离心半径5 cm)，离心10 min，取上层溶液400 ml用氮气吹干，用100 ml甲醇复溶后置于200 ml内衬管中，待测。质量控制样本是由所有样本移取10 μl混合均匀后得到，前处理方法与实测样本相同。
4.色谱条件：采用超快速液相色谱对血浆样本进行分离(美国ThermoFisher公司)，色谱柱为UPLC HSS T3(2.1 mm×100 mm，1.8 μm；美国Waters公司)。流动相A为乙腈:水=6:4，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵；流动相B为异丙醇:乙腈=9:1，0.1%甲酸，10 mmol/L乙酸铵。柱温50℃，流速0.3 ml/min，进样量1.0 μl[4]。洗脱程序见表 1。
5.质谱条件：采用热电喷雾离子源的四极杆轨道离子阱质谱(美国ThermoFisher公司)，对样品进行超高分辨率一级全扫描。采用电喷雾正、负(ESI+、ESI-)两种电离模式，电压分别为3.7和3.5 kV。质荷比扫描范围为50~1 500。数据采集应用Xcalibur 2.2 SP1.48软件[5]。
|
表 1 反相色谱洗脱程序 Table 1 The gradient conditions for reversed phase C18 |
6.数据处理和统计分析：应用Progenesis QI软件进行数据处理，包括导入原始数据、峰提取、峰对齐、归一化，形成质荷比、保留时间和峰面积的表格。应用SIMCA-P 14.1软件进行主成分分析(PCA)及正交偏最小二乘法判别分析(OPLS-DA)。差异脂质代谢物的筛选标准为5 Gy组和0 Gy组脂质代谢物相对含量差异具有统计学意义，且变量权重值(variable importance for the projection, VIP)>1。脂质代谢物鉴定方法为搜索人类代谢组数据库(HMDB)及脂质数据库(Lipidmaps)，并比对本地数据库。应用MetaboAnalyst 4.0及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库进行代谢通路分析。用SPSS 19.0软件进行统计学分析，多组间脂质代谢物相对含量符合正态分布，经检验符合方差齐性，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。P小于0.05为差异具有统计学意义。
结果1.质量控制：QC样本在正、负离子模式下PCA得分图如图 1A、1B所示，QC样本的投影位置聚集在一起，表明LC-MS系统稳定，获得的实验数据可靠，能够满足脂质组学分析要求。大鼠血浆经LC-MS分析后，正、负离子模式分别检测到5 204个和4 301个特征离子峰，发现的代谢物主要包括鞘脂、甘油磷脂、游离脂肪酸等几类脂质代谢物。
|
图 1 主成分分析得分图A、B分别为质量控制样本与实测样本正离子模式、负离子模式；C、D分别为0、1、3、5 Gy组大鼠血浆样本正离子模式、负离子模式 Figure 1 Score of principal component analysis A-B. Quality control and on-test samples (ESI+ and ESI-); C-D. The clusters of rat plasma samples after 0, 1, 3 and 5 Gy irradiation (ESI+ and ESI-) |
2.主成分分析：为观察大鼠血浆脂质整体变化情况，将各组大鼠血浆样本进行PCA(图 1C、1D)。在PCA得分图上的每个点代表一个独立的样本，各组投影点的距离越远，表示组间差异越大。结果显示，大鼠受到60Co γ射线照射后，血浆脂质代谢物发生显著变化，5 Gy组与0 Gy组能够明显区分，而1及3 Gy组与0 Gy组有重叠的部分。正离子模式的模型解释率(R2X)为0.794，模型预测率(Q2)为0.406；负离子模式的模型解释率为0.618，模型预测率为0.394。
3.正交偏最小二乘法判别分析：为获得导致显著差异的脂质代谢物信息，进一步将5 Gy与0 Gy组采用监督性的多维统计方法即OPLS-DA。OPLS-DA是对偏最小二乘法判别分析进行修正的一种方法，可以排除与分类信息无关的信息，从而提高模型的解析力和有效性。本研究中，OPLS-DA可将5 Gy与0 Gy组样本明显分离(图 2)。正离子模式的模型解释率(R2Y)为0.968，模型预测率(Q2)为0.877；负离子模式的模型解释率为0.996，模型预测率为0.924，表明该模型具有较好的解释能力及预测能力。
|
图 2 5 Gy组与0 Gy组大鼠血浆样本正交偏最小二乘法判别分析A.正离子模式；B.负离子模式 Figure 2 Orthogonal partial least squares discriminant analysis score and permutation test between 5 Gy and 0 Gy group A.Electron spray ionization poitive; B.Electron spray ionization negative |
|
|
表 2 60Co γ射线照射后的大鼠血浆差异脂质代谢物 Table 2 Differential lipids in rat plasma after exposed to 60Co γ-rays |
为验证OPLS-DA模型的可靠性，对该模型重复进行200次置换验证，正离子模式的参数R2为0.832，Q2为-0.649；负离子模式的参数R2为0.820，Q2为-0.602。随机实验数值均低于原始值，表明该模型未出现过拟合，具有良好的预测性和稳定性。
4.辐射敏感脂质代谢物的筛选：本研究采用OPLS-DA模型的VIP值大于1，并结合LSD-t检验P＜0.05来寻找差异脂质代谢物。5 Gy与0 Gy组相比，共筛选出20个潜在的差异脂质代谢物，包括鞘脂、甘油磷脂及游离脂肪酸等脂质代谢物(表 2)。其中正离子模式筛选出17个差异脂质代谢物，包括3个神经酰胺(ceramide，Cer)、2个葡糖神经酰胺(glucosylceramide)、1个鞘磷脂(sphingomyelin，SM)、5个磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine，PC)、5个溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine，LysoPC)及1个磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)；负离子模式筛选出3个游离脂肪酸。根据差异代谢物的相对含量进行热图分析，用颜色的深浅代表含量的高低，其中红色表示含量高，蓝色表示含量低(图 3)。其中13个相对含量明显上调，7个相对含量明显下调。
|
图 3 大鼠受照后血浆差异脂质代谢物热图分析 Figure 3 Heatmap of radiation sensitive lipids in rat plasma |
5.辐射敏感脂质代谢物的剂量-效应关系：0~5 Gy 60Co γ射线照射后大鼠血浆差异脂质代谢物的峰面积见表 3。各脂质代谢物不同剂量组间差异有统计学意义(F=3.29~27.56，P＜0.05), 两两比较显示，1、3、5 Gy组与0 Gy组相比，Cer(d18:1/23:0)、SM(d18:1/23:0)及LysoPC(18:1)在1、3、5 Gy组均显著上调(P＜0.05)；PE(20:4/18:0)及二十碳二烯酸在1、3、5 Gy组均显著下调(P＜0.05)。
|
|
表 3 0~5 Gy 60Co γ射线照射后大鼠血浆差异脂质代谢物的峰面积(×106，x±s) Table 3 Peak area of rat plasma metabolites after 0-5 Gy of 60Co γ-ray irradiation(×106, x±s) |
12个脂质代谢物具有良好的剂量-效应关系(R2>0.80)，其中，Glucosylceramide (d18:1/24:0)、LysoPC(16:1)、LysoPC(18:1)、LysoPC(18:3)、LysoPC(20:5)随照射剂量的上升而上升、PC(16:0/14:0)、PC(16:0/16:0)、PC(O-16:0/18:0)、PC(18:0/18:1)、PE(20:4/18:0)、二十二碳五烯酸、二十碳二烯酸随照射剂量的上升而下降，符合线性方程模型(表 4)。
|
|
表 4 大鼠血浆辐射敏感差异脂质代谢物的剂量-效应曲线 Table 4 Dose-response curves of radiation sensitive lipids in rat plasma |
6.通路分析：为研究大鼠辐射损伤脂质代谢物所涉及的代谢途径和代谢物之间的关联性，对20个差异脂质代谢物进行通路富集分析。将所有差异脂质代谢物进行整合，寻找其关联性并筛选出和辐射损伤最相关的代谢途径(图 4)。图中横坐标Pathway impact表示代谢通路的重要性，纵坐标-ln(P)表示代谢通路富集分析的显著性水平，代谢通路越靠近右上方则表示通路可信性越高。结果显示，大鼠受到γ射线全身照射后，损伤主要涉及鞘脂代谢、甘油磷脂代谢、糖基磷脂酰肌醇代谢等代谢通路。
|
注：A.鞘脂代谢；B.甘油磷脂代谢；C.糖基磷脂酰肌醇代谢；D.亚油酸代谢；E.α-亚麻酸代谢；F.花生四烯酸代谢 图 4 大鼠受照射后脂质代谢通路 Figure 4 Lipid metabolic pathway analysis of rat plasma after irradiation |
讨论
脂质是一类自然界存在的疏水或两性的有机物小分子，其结构复杂多样，化学性质独特，参与大量生命活动，在细胞内能量贮存及信号通路等方面发挥重要作用。根据脂质结构差异，可分为脂肪酸、甘油酯、甘油磷脂、鞘脂、固醇脂、孕烯醇酮脂、糖脂及聚酮等8大类[6-7]。稳定的脂质代谢是人体健康的基础，而脂质缺乏或聚集则是各种重大疾病的诱因之一，如冠心病、高血压、肥胖等[8-10]。本研究利用基于LC-MS的非靶向脂质组学方法，分析了受到60Co γ射线全身照射的大鼠血浆中脂质代谢物的变化，筛选出的辐射敏感脂质代谢物包括脂肪酸、甘油磷脂及鞘脂等。
近年来脂质组学研究方向多集中于发现脂质生物标志物，进而从病理生理学角度探索疾病发生的机制，以及脂质代谢和信号传导过程中底物与产物之间关系的研究。电离辐射可直接或间接对机体组织及细胞造成损伤，进而引发一系列氧化应激反应并导致机体代谢功能紊乱，过往已有利用脂质组学技术筛选辐射敏感生物标志物的报道，然而在受到电离辐射后，脂质代谢物在不同物种、不同类型样本间的变化差异较大[11-13]。良好的剂量依赖性是辐射生物剂量计的基础条件，本研究结果表明，大鼠受到60Co γ射线照射后血浆中20个脂质代谢物发生了显著变化，其中12个脂质在0~5 Gy范围内具有良好的剂量-效应关系，尤其是LysoPC(18:1)相对含量随照射剂量的上升而显著上升，R2值达到0.993，其峰强度较大，容易被检测到。此外，LysoPC(18:3)及LysoPC(20:5)的R2值均大于0.95。脂质组学方法的样本容易获得，并具有高通量等特点[14]，这些是上述脂质代谢物作为辐射生物剂量计的优势基础条件。
本研究将辐射敏感脂质代谢物进行代谢通路分析，发现与辐射损伤最相关的代谢通路为鞘脂代谢及甘油磷脂代谢。鞘脂是一类以鞘氨醇为骨架的化合物，是细胞膜的重要组成成分，参与调控细胞代谢、细胞分裂、细胞死亡等多种生物学功能，对维持细胞稳态具有重要作用。甘油磷脂是生物体内含量最多的一类磷脂，除了构成生物膜外，也是胆汁及膜表面活性物质的重要成分，在细胞膜对蛋白质识别和信号传导等方面具有重要作用[15-16]。本研究结果表明，60Co γ射线可导致大鼠血浆中PC、LysoPC显著改变，提示大鼠受照后胆固醇及脂肪酸代谢受到损伤。过往研究已有报道应用脂质组学方法，发现大鼠或肿瘤患者在受到电离辐射或紫外线照射后，血液中的PC、LysoPC、PE均会发生显著变化[17-18]。体内游离脂肪酸在细胞脂肪变性过程中具有关键作用，辐射可导致游离脂肪酸与甘油三酯的平衡被打破，导致细胞内甘油三酯蓄积，进而引起细胞脂肪变性[19]。本研究筛选出的血浆中二十碳二烯酸在大鼠受到60Co γ射线照射后显著降低，Moison和Henegouwen[20]已报道其在受到紫外线照射后的动物皮肤模型中也会出现显著变化。
与0 Gy组相比，各照射组中Cer(d18:1/23:0)、SM(d18:1/23:0)、LysoPC(18:1)、PE(20:4/18:0)、二十碳二烯酸相对含量均发生显著变化，提示上述脂质代谢物对电离辐射十分敏感，应对其作为辐射损伤生物标志物进行深入研究，有可能应用于辐射损伤快速分类。综上所述，本研究采用非靶向脂质组学的方法，以受到全身照射的大鼠作为损伤模型，发现60Co γ射线照射后7 d，血浆中脂质代谢物发生显著性变化，初步筛选出20个差异脂质代谢物可作为潜在的辐射敏感标志物，其中12个具有良好的剂量-效应关系，损伤主要涉及鞘脂类代谢、甘油磷脂代谢、糖基磷脂酰肌醇代谢等代谢通路。对核辐射事故受照人员的生物剂量估算一般不晚于7 d，尽早得到准确地生物剂量是指导临床救治的关键。研究组下一步还将选取多个时间点，对已筛选辐射敏感代谢物随时间的变化规律进行深入分析。此外，还将应用辐射敏感代谢物建立的剂量-效应曲线对盲法照射样本进行生物剂量估算，从而验证其作为辐射生物损伤标志物的可行性，为快速、高通量的辐射损伤生物标志物研究提供科学依据。
利益冲突 无
作者贡献声明 赵骅负责实验操作、数据分析、论文撰写；田雪蕾、习聪、高玲负责协助实验操作、数据分析；田梅、刘青杰负责指导课题设计、论文修改
| [1] |
International Atomic Energy Agency. Cytogenetic dosimetry:Applications in preparedness for and response to radiation emergencies[J]. Vienna:IAEA, 2011. |
| [2] |
Han X, Gross RW. Global analyses of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples by ESI mass spectrometry:a bridge to lipidomics[J]. J Lipid Res, 2003, 44(6): 1071-1079. DOI:10.1194/jlr.R300004-JLR200 |
| [3] |
Zhang Y, He C, Qiu L, et al. Serum unsaturated free fatty acids:A potential biomarker panel for early-stage detection of colorectal cancer[J]. J Cancer, 2016, 7(4): 477-483. DOI:10.7150/jca.13870 |
| [4] |
Want EJ, Wilson ID, Gika H, et al. Global metabolic profiling procedures for urine using UPLC-MS[J]. Nat Protoc, 2010, 5(6): 1005-1018. DOI:10.1038/nprot.2010.50 |
| [5] |
Bird SS, Marur VR, Sniatynski MJ, et al. Serum lipidomics profiling using LC-MS and high-energy collisional dissociation fragmentation:focus on triglyceride detection and characterization[J]. Anal Chem, 2011, 83(17): 6648-6657. DOI:10.1021/ac201195d |
| [6] |
Nicholson JK, Wilson ID. Understanding 'global' systems biology:metabonomics and the continuum of metabolism[J]. Nat Rev Drug Discov, 2003, 2(8): 668-676. DOI:10.1038/nrd1157 |
| [7] |
Fahy E, Subramaniam S, Brown H, et al. A comprehensive classification system for lipids[J]. J Lipid Res, 2005, 46(5): 839-861. DOI:10.1201/b11923-31 |
| [8] |
Libby P, Theroux P. Pathophysiology of coronary artery disease[J]. Circulation, 2005, 111(25): 3481-3488. DOI:10.1161/CIRCULATIONAHA.105.537878 |
| [9] |
Yetukuri L, Katajamaa M, Medina-Gomez G, et al. Bioinformatics strategies for lipidomics analysis:characterization of obesity related hepatic steatosis[J]. BMC Syst Biol, 2007, 1: 12. DOI:10.1186/1752-0509-1-12 |
| [10] |
Meer G. Cellular lipidomics[J]. EMBO J, 2005, 24(18): 3159-3165. DOI:10.1038/sj.emboj.7600798 |
| [11] |
Cheema A, Mehta KY, Fatanmi OO, et al. A metabolomic and lipidomic serum signature from nonhuman primates administered with a promising radiation countermeasure, gamma-tocotrienol[J]. Int J Mol Sci, 2018, 19(1): 79. DOI:10.3390/ijms19010079 |
| [12] |
Goudarzi M, Weber WM, Mak TD, et al. Metabolomic and lipidomic analysis of serum from mice exposed to an internal emitter, cesium-137, using a shotgun LC-MSE approach[J]. J Proteome Res, 2014, 14(1): 374-384. DOI:10.1021/pr500913n |
| [13] |
Laiakis EC, Canadell MP, Grilj V, et al. Serum lipidomic analysis from mixed neutron/X-ray radiation fields reveals a hyperlipidemic and pro-inflammatory phenotype[J]. Sci Rep, 2019, 9(1): 4539-4547. DOI:10.1038/s41598-019-41083-7 |
| [14] |
Patti GJ, Yanes O, Siuzdak G. Innovation:Metabolomics:the apogee of the omics trilogy[J]. Nat Rev Mol Cell Biol, 2012, 13(4): 263-269. DOI:10.1038/nrm3314 |
| [15] |
Schink KO, Tan KW, Stenmark H. Phosphoinositides in control of membrane dynamics[J]. Annu Rev Cell Dev Biol, 2016, 32(1): 143-171. DOI:10.1146/annurev-cellbio-111315-125349 |
| [16] |
Paolo GD, Camilli PD. Phosphoinositides in cell regulation and membrane dynamics[J]. Nature, 2006, 443(7112): 651-657. DOI:10.1038/nature05185 |
| [17] |
Park HM, Shin JH, Kim JK, et al. MS-based metabolite profiling reveals time-dependent skin biomarkers in UVB-irradiated mice[J]. Metabolomics, 2014, 10(4): 663-676. DOI:10.1007/s11306-013-0594-x |
| [18] |
Jelonek K, Ros M, Pietrowska M, et al. Radiation-induced changes in serum lipidome of head and neck cancer patients[J]. Int J Mol Sci, 2014, 15(4): 6609-6624. DOI:10.3390/ijms15046609 |
| [19] |
Donnelly KL, Smith CI, Schwarzenberg SJ, et al. Sources of fatty acids stored in liver and secreted via lipoproteins in patients with nonalcoholic fatty liver disease[J]. J Clin Invest, 2005, 115(5): 1343-1351. DOI:10.1172/JCI23621 |
| [20] |
Moison RM, Henegouwen GM. Topical antioxidant vitamins C and E prevent UVB-radiation-induced peroxidation of eicosapentaenoic acid in pig skin[J]. Radiat Res, 2002, 157(4): 402-409. DOI:10.1667/0033-7587(2002)157[0402:TAVCAE]2.0.CO |