2020, Vol. 40
部分脑肿瘤患者颅脑放疗后会发生不同程度的认知功能障碍[1-2]。射线导致的神经干细胞缺失及神经发生受损是放射性认知功能障碍的发生机制之一[3]。实施干细胞移植有望改善放射性认知功能障碍[4-5]。但向脑内移植的干细胞分化来的神经元能否整合入现有的神经环路尚不清楚。狂犬病病毒的编码糖蛋白(G蛋白)和囊膜蛋白的基因分别被GFP、mCherry等荧光蛋白和EnvA的基因所替代, 因此, 病毒会特异性感染TVA转染的神经元[6]。本研究在体外用慢病毒感染神经干细胞, 使之表达TVA、G蛋白和mCherry荧光蛋白, 然后, 用以狂犬病病毒为基础的逆向跨单突触神经示踪技术[7]观察移植的神经干细胞分化而来的神经元整合到神经环路的情况。
材料与方法1.主要试剂: DMEM/ F12培养基、B27、Accutase酶(美国GIBCO公司), 表皮生长因子(EGF, 20 ng / ml, 美国Sigma公司), 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF, 20 ng / ml, 美国R&D Systems公司), 青霉素/链霉素双抗(上海碧云天生物技术有限公司), 狂犬病病毒逆向跨单突触示踪相关病毒(武汉枢密脑科学技术有限公司), 小鼠抗Nestin、鸡抗GFP、兔抗mCherry、DAPI (英国Abcam公司), Alexa Fluor 488山羊抗鸡IgY、Alexa Fluor 568驴抗兔IgG、Alexa Fluor 405驴抗小鼠IgG (英国Abcam公司), 医科达Synergy医用直线加速器(瑞典医科达公司), 脑立体定位仪(深圳瑞沃德公司), 激光共聚焦扫描显微镜(德国Leica公司, TCS-SP2型)。
2.实验动物及分组: 10只1月龄健康雄性Sprague-Dawley (SD)大鼠, SPF级, 体重(100± 10) g, 购于苏州大学动物实验中心(合格证号: No. 201902390)。所有大鼠按标准实验条件饲养于苏州大学动物实验中心, 自由饮水饮食。所有大鼠适应性饲养3 d后, 按照随机数表法分为mCherry修饰的神经干细胞移植组(C +NSCs组)和照射后mCherry修饰的神经干细胞移植组(R+ NSCs组)。
3.照射条件:用3. 6%水合氯醛溶液(360 mg / kg)腹腔注射大鼠, 麻醉后将大鼠俯卧于照射区域内, 用4 MeV电子线单次20 Gy全脑照射。射野面积为2 cm × 2. 5 cm, 吸收剂量率为210 ~ 220 cGy / min, 源皮距为100 cm。照射野前界为双眼后眦连线, 后界为双耳后连线, 大鼠身体其他部位用铅块予以遮挡。C+NSCs组大鼠在相同照射环境下予以假照射。
4.原代神经干细胞分离培养及鉴定:取孕15 d左右的SD大鼠1只, 用3. 6%水合氯醛溶液深度麻醉后, 无菌条件下剖腹取出胎鼠, 浸泡在装有冰的磷酸盐缓冲液(PBS)无菌培养皿中, 置于冰上。剥离胎鼠脑膜和血管并取大脑皮质和皮质下组织。加入Accutase酶, 37℃消化10 min后, 轻轻反复吹打混匀。用一次性40 μmol / L细胞筛过滤, 收集单细胞悬液, 离心3 min, 离心半径为12 cm, 转速为1 000 r / min。弃上清, 用神经干细胞完全培养基重悬, 按1×106 / ml接种于无菌培养瓶中, 放在37℃、5%CO2培养箱中培养。实验动物操作均经苏州大学实验动物伦理委员会通过。对神经球作免疫荧光染色鉴定, 方法为:将神经干细胞球爬片在多聚赖氨酸包被的玻片上, 用PBS洗2遍, 4%多聚甲醛溶液固定30 min, 0. 5%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)破膜20 min, 10%胎牛血清室温封闭2 h, 一抗4℃孵育过夜(小鼠抗Nestin 1 : 200、鸡抗GFP 1 : 500), 第2天PBS洗3遍后, 二抗(Alexa Fluor 488山羊抗鸡1 : 500, Alexa Fluor 405驴抗小鼠1 : 500)置湿盒内室温避光孵育1 h后贴片。
5. mCherry-慢病毒感染神经干细胞:将第3代神经球消化为单细胞悬液, 按1×106 / ml接种到一次性培养瓶中培养2 h。观察细胞生长状态, 选取生长状态良好的细胞, 根据病毒滴度, 加入相应体积mCherry-慢病毒, 低速离心1 h, 离心半径为12 cm, 转速为600 r / min, 离心结束后将细胞轻轻吹打均匀并接种到培养瓶中继续培养。24 h后予以半量换液。待细胞成球后, 在荧光显微镜下观察细胞荧光情况。
6.神经干细胞移植:将第6代mCherry-慢病毒感染的神经干细胞离心收集后消化为单个细胞, 并浓缩成1. 5×105 / μl置于冰上。大鼠常规麻醉后固定在立体定位仪上, 去除大鼠头部被毛, 消毒后沿正中线切开头部皮肤, 充分暴露颅骨。按照坐标(前囟点向后3. 5 mm, 旁开2. 5 mm, 深度3. 6 mm)向左侧海马内注射细胞浓缩液1 μl, 注射速率为0. 15 μl / min, 注射结束后微量进样器留置5 min, 头部皮肤予以缝合消毒。待大鼠麻醉清醒后再放回动物实验中心, 分笼饲养。
7.狂犬病病毒跨单突触逆向示踪:预先已用慢病毒(LV-mCherry-G-TVA)作为辅助病毒感染神经干细胞, 将4周前移植有辅助慢病毒感染的大鼠用3. 6%水合氯醛腹腔麻醉后, 固定在立体定位仪上, 去除大鼠头部被毛, 消毒后沿正中线切开头部皮肤, 充分暴露颅骨, 向同一移植部位立体定向注射狂犬病病毒(RABV-EnvA-ΔG-GFP), 注射300 nl, 注射速率为30 nl / min, 注射结束后微量进样器留置5 min, 头部皮肤予以缝合消毒。
8.免疫荧光染色:在狂犬病病毒注射后10 d, 用3. 6%水合氯醛腹腔麻醉大鼠, 先用PBS心脏灌注, 再用4%多聚甲醛固定。断头取脑, 用4%多聚甲醛固定脑组织24 h后, 依次用15%、30%蔗糖溶液梯度脱水。脱水完成后在冰冻切片机上制成厚度为40 μm的冰冻切片, 对脑切片进行免疫荧光染色。两组实验大鼠的脑片分别用PBS漂洗5 min×3次。0. 5% Triton X-100破膜10 min×2次。5%胎牛血清封闭2 h。一抗4℃过夜(鸡抗GFP 1 : 500, 兔抗mCherry 1 : 200)。一抗孵育完成后, PBS漂洗切片5 min × 3次。二抗37℃孵育1 h (Alexa Fluor 488山羊抗鸡1 : 500, Alexa Fluor 568驴抗兔1 : 500)。PBS漂洗切片5 min×3次, 滴加DAPI后贴片观察。
9.图像采集:使用激光共聚焦免疫荧光扫描显微镜采集免疫荧光照片。
结果1.神经干细胞的鉴定:培养的神经干细胞成球后进行巢蛋白细胞免疫荧光染色, 荧光显微镜下见神经球呈Nestin免疫阳性(图 1)。
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图 1 神经干细胞进行Nestin免疫荧光染色鉴定× 200 A. Nestin免疫荧光染色; B. GFP免疫荧光染色; C. A、B融合图像 Figure 1 Images Neural stem cells identified by Nestin immunofluorescence staining × 200 A. Nestin immunostaining image; B. GFP immunostaining image; C. Merge of A and B images |
2.神经干细胞移植后的逆向跨单突触神经示踪:预先用辅助慢病毒载体(带有TVA、G蛋白和mCherry荧光蛋白)感染移植的神经干细胞, 移植后4周在相同位置立体定向注射重组狂犬病病毒(带有GFP荧光蛋白), 进行mCherry和GFP荧光蛋白免疫荧光染色, C+NSCs组和R+NSCs组均可在移植区域观察到起始细胞(GFP和mCherry共标细胞, 图 2), 两组大鼠海马组织中均可在Hilus区和CA1区(图 2)中分别观察到仅表达GFP信号的神经元, C+NSCs组还在内嗅皮层(EC区)观察到仅表达GFP信号的神经元, R+NSCs组均未观察到(图 2)。
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注:红色为mCherry免疫荧光染色, 绿色为GFP免疫荧光染色, 蓝色为DAPI免疫荧光染色; 白色箭头为仅表达GFP的上一级神经元 图 2 神经干细胞移植后4周C+NSCs组和R+NSCs组神经环路的整合情况进行GFP和mCherry免疫荧光染色鉴定×200 A. C+NSCs组起始细胞; B. C+NSCs组Hilus区GFP阳性神经元; C. C+NSCs组CA1区GFP阳性神经元; D. C+NSCs组EC区GFP阳性神经元; E. R+NSCs组起始细胞; F. R+NSCs组Hilus区GFP阳性神经元; G. R+NSCs组CA1区GFP阳性神经元; H. R+NSCs组EC区 Figure 2 Integration of neural circuits in the C+NSCs group and R+NSCs group at 4 weeks after transplantation identified by GFP and mCherry immunofluorescence staining ×200 A. Starter neurons were found in C+NSCs group; B. GFP-positive neurons were found in hilus area in C+ NSCs group; C. GFP-positive neurons were found in CA1 area in C+NSCs group; D. GFP-positive neurons were found in EC area in C+NSCs group; E. Starter neurons were found in R+NSCs group; F. GFP-positive neurons were found in hilus area in R+NSCs group; G. GFP-positive neurons were found in CA1 area in R+NSCs group; H. GFP-positive neurons were found in EC area in R+NSCs group |
讨论
电离辐射可造成脑部神经干/祖细胞的丢失, 神经发生过程受到抑制, 并导致认知功能障碍。临床前研究表明, 神经干细胞移植为许多神经系统疾病提供了一种有希望的治疗方法[8-9]。本研究通过离体和在体情况下重组狂犬病病毒和辅助病毒的组合使用, 证明了放射性认知功能障碍模型中由移植的神经干细胞分化来的神经元是可以与上一级神经元产生突触联系的。以往的研究证实, 脊髓损伤、帕金森病、脑卒中等动物模型中, 外源性移植的神经干细胞能够分化为神经元并投射到下一级宿主神经元, 促进神经系统疾病和损伤的恢复[10-12]。而对于移植后上一级神经元向移植细胞的信号输入, 目前知之甚少。
既往有研究使用电生理学、高尔基染色或传统的示踪方法验证移植细胞与宿主的突触联系, 但这些示踪方法具有方向不特异、信号间接、跨突触后信号衰减严重等问题, 无法准确识别移植细胞的宿主单突触输入源。但狂犬病病毒跨单突触示踪技术能直观显示神经元之间的相互联系, 可以用来验证移植后原有神经元向新生成的神经元的投射。本研究使用的重组狂犬病病毒表达GFP和EnvA但缺乏G蛋白, 不具有跨突触传播能力。辅助慢病毒携带mCherry、EnvA的识别受体TVA和狂犬病病毒跨突触糖蛋白(G蛋白)。慢病毒体外感染神经干细胞, 使其表达mCherry、TVA受体和G蛋白。在感染狂犬病病毒后, 表达TVA受体的神经元可被ΔG-狂犬病病毒上的EnvA特异性识别并感染, 同时表达GFP和mCherry荧光信号, 称为初始神经元。狂犬病病毒在初始神经元内包装G蛋白, 获得逆向跨突触传播的能力, 可以逆向传播到与初始神经元产生突触前接触的上一级神经。因此, C+NSCs组和R+NSCs组在各区域观察到仅表达GFP信号的神经元代表移植的神经干细胞分化而来的神经元已与该区域的神经元建立了突触联系, 由于G蛋白的表达仅限于移植的神经干细胞, 所以Hilus区、CA1区、EC区神经元不表达mCherry, 也不会发生狂犬病病毒的进一步传播。
已有研究在帕金森病模型和脑外伤模型上, 运用以狂犬病病毒为基础的逆向跨单突触示踪技术, 发现移植的胚胎干细胞分化的神经元与宿主神经元进行了早期和广泛的神经环路整合[13-14]。本研究结果显示, 移植的神经干细胞分化而来的神经元可以接受来自海马Hilus区、CA1区和远处同侧内嗅皮层区的上一级神经元的神经信号传入。这在很大程度上与内源性新生神经元整合到海马神经环路的过程相似。但是, 电离辐射对整合过程有较为显著的影响。在R+NSCs组, 未观察到移植的神经细胞与远处内嗅皮层之间的联系。本课题组前期研究表明, 电离辐射可以导致脑源性神经营养因子(BDNF)下降[15]。BDNF通过与高亲和力受体TrkB结合, 对新生神经元轴突树突的发育及突触形成有影响作用。因此, 本研究中R + NSCs组可能因BDNF-TrkB通路受损, 影响了突触素的发育, 从而影响移植的神经干细胞分化的神经元与原有神经突触建立联系。
重组狂犬病病毒作为一种精细的神经回路追踪工具, 在绘制中枢神经系统的直接突触信号输入方面发挥着重要作用。后续研究需要进一步观察干细胞来源的神经元在移植后整合到神经环路的时间进程, 全面评估新生神经元与宿主的整合情况。
利益冲突 本人及本人家属、其他研究者, 未接受其他机构提供的不当利益, 在此对研究的独立性和科学性予以保证
作者贡献声明 张洁、张奇贤负责实验, 收集数据, 撰写论文; 钟雪、陈列松协助完成实验; 田野设计研究方案, 指导实验及修改论文
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