1984年, Olivieri等^[1]发表人淋巴细胞由低剂量辐射(low dose radiation, LDR)诱导细胞遗传学适应性反应(adaptive response, AR), 随后这一现象不断被许多学者以不同的实验模式所证实, 并对其机制进行了初步探讨。许多研究表明, 低剂量电离辐射可促进机体免疫功能增强, 在LDR照射下, 多种免疫分子、免疫细胞会发生变化, 从而改变机体抗肿瘤、抗氧化能力^[2-5]。此外, LDR还可以刺激多种细胞功能, 包括繁殖与DNA损伤修复能力、体内激素平衡的改变^[6]。广东阳江是世界上几处天然高本底辐射地区之一, 人均年有效剂量5. 06 ~ 6. 86 mSv, 与职业人群剂量相当, 而一般人群人均年有效剂量为1. 8 ~ 2. 3 mSv^[7], 阳江高本底地区(HBRA)开展的天然放射性高本底辐射与居民健康关系的研究始于1972年, 前期结果提示低剂量电离辐射下, 人群免疫功能呈上升的趋势, IL-2、sIL-2R分别高于、低于对照地区(control areas, CA) ^[8-9], 且对比CA人群, HBRA人群癌症发生率和死亡率并未增加^[10-11]。动物实验和人群数据提示, 可能是低剂量辐射将免疫平衡转移到Th1, 从而增强抗肿瘤活性^[12-13]。本研究选择阳江和对照地区恩平健康男性作为研究对象, Th1型细胞分泌的白介素2 (interleukin 2, IL-2)、Th2型细胞分泌的白介素4 (interleukin 4, IL-4)、白介素5 (interleukin 5, IL-5)以及转化生长因子β1 (transforming growth factor-β1, TGF-β1)作为研究指标, 探讨长期低剂量电离辐射对人群血浆白介素水平以及免疫功能的影响。

1.研究对象:根据前期研究, 考虑以下情况: ①两地中青年人外出打工比例较高, 而45岁以上居民的这种情况则比较少。② > 65岁的老年人则逐渐进入各种疾病的高发阶段, 混杂因素多, 不适合作为本次研究的采血对象。③男性居民由于婚嫁发生迁入迁出情况较女性更少, 较少迁移, 相比之下, 男性居民的居住稳定性良好。基于上述原因的考虑, 结合2006年高本底地区部分居民免疫功能研究结果, 以血清IL-2定量结果为参考指标, 最终分别从阳江阳西县塘口镇(HBRA)和恩平市横坡镇(CA)随机选取45 ~ 65岁汉族健康男性41、44名, 90%居民世居6代以上。排除近3年在其他地方居住过6个月以上者(如外出打工、上学、参军或者做生意); 近一周有发热、急性腹泻、尿频、尿急、尿痛的个体; 近6个月内有X射线、CT等辐射因素接触的个体, 对纳入对象进行问卷调查一般情况、饮食营养、吸烟及饮酒情况、健康状况、医疗照射史、患病以及药物服用情况(如干扰素等)、居住史和应激性事件等相关情况, 以排除调查对象各项检测指标异常情况。本研究已通过广东省职业病防治院伦理委员会审查(GDHOD MEC 2016011号), 所有研究对象均已同意本次研究内容、目的, 并签署知情同意书。

2.研究方法

(1) 血浆分离:取外周静脉血5 ml, 室温静置30 min后, 20℃、2 500 r / min, 离心半径5. 5 cm, 离心20 min, 分离上层血浆, 低温保存备用。

(2) 酶联免疫吸附实验(ELISA):按照ELISA试剂盒(博士德, 广州威佳公司)说明书检测血浆中IL-2、sIL-2R、IL-4、IL-5、TGF-β1的浓度, 具体操作以IL-2为例说明。依次配制1 000、500、250、125、62. 5、31. 3、15. 6 pg / ml的标准品, 并加入酶标板上, 后1孔只加入样品稀释液作为零孔, 随后依次加入样品稀释液稀释过的待测样品100 μl; 盖上封板膜后37℃下反应90 min, 甩去酶标板内液体, 不洗; 每孔依次加入生物素抗人IL-2抗体工作液100 μl, 盖上封板膜后37℃下反应60 min, 磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次; 每孔依次加入亲和素-生物素(ABC)稀释液100 μl, 盖上封板膜, 37℃下反应30 min, PBS洗涤5次; 酶-底物(TMB)显色液事先在37℃下平衡30 min, 按每孔90 μl依次加入, 37℃避光反应15 ~ 20 min; 每孔依次加入TMB终止液100 μl, 此时溶液由蓝色转为黄色, 用酶标仪在450 nm下测定吸光度(A)。将零孔设为对照, 所有标准品和样品的吸光值减去零孔的A后, 得到结果输入ELISA绘图软件Curve Expert 1. 3中, 绘制标准曲线, 得到相应浓度结果。

3.统计学处理:问卷调查资料利用EpiData 3. 1录入数据库, 实验数据应用SPSS 20. 0软件处理。连续性变量使用x±s或中位数(四分位数间距)、分类变量使用频数(频率)进行统计描述; 连续性变量满足正态分布的进行成组资料t检验, 不满足正态分布则取对数后做t检验, 若仍不满足则采用秩和检验; 分类变量进行χ²检验(校正χ²检验或确切概率法); 协方差分析观察地区、年龄、吸烟、饮酒、收入等因素对上述指标的影响, P < 0.05为差异有统计学意义。

1.人群基本情况: HBRA和CA地区男性平均年龄分别为55. 05±5. 66、57. 23±5. 61岁, 总体无差异(P > 0. 05), 吸烟人群每日吸烟量分别为(15. 38±9. 75)和(21. 30±15. 62)支, 差异无统计学意义(P > 0.05)。两组人群除收入差异有统计学意义外(χ² = 19. 724, P < 0. 001), 学历、职业、家庭燃料类型、农药中毒事件、服药(干扰素、降压药、降糖药)、医疗照射事件、吸烟、饮酒、喝茶、饮食、应激事件等差异无统计学意义, 人群总体特征基本一致, 具有可比性(表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 两地区健康居民一般情况 Table 1 General situation of the healthy residents in the two regions 项目 高本底地区 对照地区 χ2值 P值 例数 41 44 年龄 55.05±5.66 57.23±5.61 1.782a 0.079 学历   文盲 1 3   小学 10 13 3.108 0.375   中学 26 27   大专及以上 4 1 职业 6.100 0.107   农民 33 41   工人 4 0   干部 1 2   其他 3 1 家庭燃料类型 5.331 0.377   柴 12 17   柴+煤气 11 9   煤炭 0 1   煤气 14 15   柴+煤炭+煤气 3 0   其他 1 2 收入>1 500元 19. 724 < 0.001   是 1 0   否 11 33 收入>1 500元 19. 724 < 0.001   是 1 0   否 11 33 农药中毒 0.482c   是 1 0   否 40 44 服药 0.028 0.866   是 9 9   否 32 35 医疗照射 1c   是 1 1   否 40 43 吸烟 1.963 0.161   是 26 34   否 15 10 饮酒 0.275 0.871   经常 21 23   偶尔 13 12   从不 7 9 饮绿茶 0.228 0.633   是 12 15   否 29 29 躯体应激事件 < 0.001 1b   是 1 2   否 40 42 心理应激事件 < 0.001 1b   是 1 1   否 40 43 注:at值; b校正χ2检验; c确切概率法

表 1 两地区健康居民一般情况 Table 1 General situation of the healthy residents in the two regions

2. ELISA结果分析:对两地区居民血浆中IL-2、sIL-2R、IL-4、IL-5、TGF-β1水平进行分析。HBRA人群IL-2血浆浓度略高于CA人群, IL-4与CA人群水平相当, sIL-2R、IL-5、TGF-β1水平低于对照地区, 其中IL-5 (t=7. 124, P < 0. 001)、TGF-β1 (t=4. 900, P < 0. 001)在两组间差异有统计学意义(表 2)。

表 2(Table 2)

表 2 两地区健康居民血浆白介素水平检查结果(ng / L, x±s) Table 2 The levels of plasma interleukins and TGF-β1 of the healthy residents in the two regions (ng / L, x±s) 地区 例数 IL-2 sIL-2R IL-4 IL-5 TGF-β1 HBRA 41 3. 99±4. 37 185. 88±38. 58 5. 04±2. 09 5. 13±1. 07 3 237±925 CA 44 3. 14±2. 05 193. 65±40. 22 5. 24±2. 45 7. 44±2. 11 4 422±1 265 t值 -0. 591 0. 907 0. 296 7. 124 4. 900 P值 0. 556 0. 367 0. 768 < 0. 001 < 0. 001 注: HBRA.高本底地区; CA.对照地区

表 2 两地区健康居民血浆白介素水平检查结果(ng / L, x±s) Table 2 The levels of plasma interleukins and TGF-β1 of the healthy residents in the two regions (ng / L, x±s)

3.协方差分析:以年龄为连续变量, 地区、收入、吸烟、饮酒为分类变量, 对两地区居民血浆白介素浓度(对数转换后)进行协方差分析。分析结果显示, 调整相关因素后, IL-5和TGF-β1间仍有明显差异(F = 35. 646、11. 181, P < 0.05), 收入、年龄、饮酒对两地居民各白介素及TGF-β1水平无明显影响, 吸烟对IL-2水平影响最大(F = 5. 283, P < 0.05)。

本研究采用常规ELISA法检测了HBRA和CA人群血浆中Th1型细胞因子IL-2及其可溶性受体sIL-2R、Th2型细胞因子IL-4、IL-5和Th3型/ Treg细胞因子TGF-β1, 结果中IL-2血浆浓度HBRA略高于CA以外, 其余指标HBRA均低于CA。与CA相比, HBRA具有更高IL-2浓度和更低sIL-2R浓度, 结果与前期低剂量电离辐射研究结果一致^{[8-9, 14]}。IL-2是参与机体免疫应答, 尤其是细胞免疫的重要细胞因子, 对T细胞分化增殖起促进作用, 具有抗病毒、抗肿瘤和增强机体免疫功能等作用, 在人体对抗原的免疫应答过程中具有重要意义^[15]。sIL-2R是IL-2R的可溶形式, 能有效结合IL-2, 竞争性地抑制mIL-2Rα与血浆中游离的IL-2的结合, 血清中过量的sIL-2R可能会减弱IL-2的可用性, 减弱免疫细胞活化与增殖的刺激作用^[16-17]。本研究中高本底组人群IL-2略高于对照组, 提示细胞免疫水平可能升高, 同时sIL-2R水平略低, 对IL-2竞争性结合减弱, 可使IL-2在免疫过程中更大程度发挥效用, 提高免疫功能。

研究结果提示, 低剂量电离辐射下Th2型细胞因子IL-4、IL-5和Th3型/ Treg细胞因子TGF-β1水平低于对照地区, 其中IL-5和TGF-β1间差异有统计学意义。IL-4、IL-5可辅助参与体液免疫, 同时IL-4可抑制IFN-γ诱导Th0细胞向Th1细胞分化^[18]。TGF-β1参与机体免疫应答的负调控, 抑制机体的免疫应答。有研究表明, Th2型细胞因子IL-5可以上调人嗜酸性粒细胞中TGF-β1的表达^[19]。本研究中HBRA组IL-5水平低于CA组, 对TGF-β1的表达促进低于CA组, 该表达差异与刘树铮^[20]和Attar等^[21]的研究一致, 说明HBRA组免疫表达可能更偏向Th1型, Th2、TGF-β1类细胞因子分化减弱, 同时对Th1类细胞因子分化抑制减弱, 而活化的Th1细胞可在IL-2和IFN-γ的作用下, 进一步促进Th1细胞和Tc细胞的活化并抑制Th2细胞的增殖, 提高细胞免疫^[22]。

另外, 协方差分析结果提示, 吸烟对IL-2水平有显著作用。烟草作为多种慢性疾病的危险因素, 可从多方面影响机体健康。既往动物实验表明烟草对多种白细胞介素水平有影响, 如白介素1β (interleukin 1β, IL-1β)、白介素8 (interleukin 8, IL-8)、肿瘤坏死因子α (tumor necrosis factor α, TNF-α) ^[23], 但对IL-2水平影响无相关数据, 有待进一步研究。本研究结果表明, 长期接受低剂量辐射照射后可能使Th1细胞功能增强, Th1细胞功能增强是细胞免疫增强的基础, 有理由推测HBRA健康居民免疫功能可能有略强于对照地区的趋势。同时Th1 / Th2比值升高, 是Th1漂移的标志, 这些结果表明, 低剂量电离辐射将免疫平衡转移到Th1, 从而增强机体免疫功能和抗肿瘤活性^[12-13]。

综上所述, 受长期低剂量电离辐射影响, 天然高本底地区居民的血浆白介素呈现不同的水平变化, 免疫平衡可能偏移向Th1型, 免疫功能略强于对照地区, 提示长期慢性低剂量电离辐射可能增强机体免疫, 为低剂量电离辐射诱导适应性反应的机制提供了一些证据, 有待进一步增加样本量或采取其他灵敏度较高的方法进行研究。

利益冲突  无

作者贡献声明  唐颖、苏世标和温翠菊负责实验设计、操作和论文撰写; 靳雅丽和林海辉协助实验数据收集和统计分析; 谈伟君总体指导实验进行和修改论文