早熟衰老或早衰(premature senescence)是指细胞在生长和发育过程中，在非端粒信号刺激下，增殖能力和生理功能下降，提前出现退行性改变^[1]。通常细胞早衰发生时伴随以下特征：细胞形态改变^[2]，增殖能力减弱，糖酵解相关标志物β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性增高，胞内溶酶体数量增多^[3-5]，迁移能力降低；早衰相关蛋白P16、P53表达增加。

日光中的中波紫外线(ultraviolet B，UVB)长期或过量照射会对皮肤细胞产生严重损害^[6]，其中人源角质形成细胞(keratinocytes，KC)是UVB作用于人皮肤的重要靶点细胞^[7]。Kim等^[8]和Kim^[9]发现UVB可诱导HaCaT细胞(永生化KC)发生早衰。现有的研究中涉及的UVB剂量点较少，且仅揭示了UVB诱发的早衰现象，对早衰信号通路并未进一步阐明。本研究以HaCaT细胞为模型，来确定UVB可诱发细胞早衰并探索相关机制。

1.仪器与试剂：SH4B-T紫外光疗仪(上海Sigma公司)；Thermo Lab systems MK3酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；倒置相差显微镜及成像系统(日本Olympus公司)。胎牛血清、MEM/EBSS培养基购自美国HyClone公司；磷酸缓冲盐溶液(PBS)、姬姆萨染色液、甲醛溶液均为本实验室配制；β-半乳糖苷酶细胞染色试剂盒、RIPA细胞裂解液、溶酶体红色荧光探针、青霉素-链霉素溶液均购自江苏碧云天公司；罗氏磷酸酶抑制剂及蛋白酶抑制剂，P53购自美国CST公司，P16抗体购自英国Abgent公司，β-肌动蛋白抗体、二抗山羊抗兔抗体和山羊抗小鼠抗体购自北京中杉金桥生物公司；人永生化角质形成细胞HaCaT购自北京协和医学院细胞库。

2.细胞照射方法：取对数生长期HaCaT细胞，UVB照射采用SH4B-T紫外光疗仪，UVB发射光波长为311~313 nm，照射距离约为40 cm，照射剂量采用本单位TN-2340紫外线强度计校准细胞。实验分为对照组和实验组，对照组UVB照射的吸收剂量为0，实验组剂量分别为20、50、80和100 mJ/cm²。

3.克隆形成实验：取指数生长期的HaCaT细胞，用培养液悬成单细胞，各组细胞分别接种500个于3 ml预温37℃培养液的60 mm培养皿中。对细胞进行照射处理，将培养皿移入37℃、5%CO₂恒温培养箱静置培养7 d后终止培养。用PBS洗涤细胞3次，甲醇固定20 min，去甲醇，姬姆萨染色15 min，冲洗晾干后解剖显微镜下计数克隆数，克隆形成率(colony forming efficiency，CFE)计算公式为：CFE(%)=克隆数/接种细胞数×100%。

4. β-半乳糖苷酶染色实验：HaCaT细胞于96孔板中培养72 h后，吸除细胞培养液，用PBS洗涤1次，每孔加入100 μl β-半乳糖苷酶染色固定液，室温固定15 min。吸除固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3 min。吸除PBS，每孔加入100 μl染色工作液，37℃孵育过夜，次日使用倒置相差显微镜及成像系统观察、拍照。

5.溶酶体红色荧光探针Lyso-Tracker Red染色实验：于暗处取少量Lyso-Tracker Red按照1 :20 000的比例加入到细胞培养液中，使最终浓度为50 nmol/L，使用前37℃预温育。照射后分别培养24、48、72 h的细胞，去除细胞培养液，加入配制的Lyso-Tracker Red染色工作液，与细胞37℃共孵育30 min。去除Lyso-Tracker Red染色工作液，加入新鲜细胞培养液。随后用化学发光仪检测红色荧光值，并用荧光显微镜及成像系统进行观察、拍照。

6.细胞划痕实验：取对数期的HaCaT细胞，调节细胞浓度为5×10⁵/ml，使用划痕实验专用培养皿，每孔加入70 μl细胞悬液，于37℃、5%CO₂恒温培养箱中培养过夜。次日使用紫外灯对HaCaT细胞进行照射，拔掉插件，细胞之间留有一道标准的划痕，加无血清的培养液，定时使用倒置相差显微镜及成像系统观察、拍摄细胞愈合的情况。

7.蛋白提取及Western blot实验：RIPA细胞裂解液裂解HaCaT细胞，加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂，冰浴振荡45 min，采用离心半径8.3 cm，12 000 r/min，离心10 min取上清，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。加入5×上样缓冲液，煮沸10 min，放入-20℃冰箱，备用。

取30 μg上样，制备15%的聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳，将蛋白转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂奶粉封闭，分别用抗P53抗体(工作浓度1 :1 000)、抗P16抗体(工作浓度1 :1 000)及抗β-肌动蛋白多抗(工作浓度1 :2 000)检测P53、P16及β-肌动蛋白的表达，一抗及二抗孵育后，采用增强化学发光(ECL)法显影。电泳条带经Image J软件处理计算，目的条带与内参条带的比值代表目的蛋白的表达水平。

8.统计学处理：采用SPSS 23.0统计软件进行数据处理，数据符合正态分布，计量资料用x±s表示。多组间比较采用单因素方差分析，LSD法进行组间两两比较。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.不同剂量UVB照射后HaCaT细胞形态变化：如图 1和表 1所示，随着UVB照射剂量的增加，HaCaT细胞变大，同时变大的细胞比例增多(F=115.18，P < 0.05)。

A.0 mJ/cm2；B.20 mJ/cm2；C.50 mJ/cm2；D. 80 mJ/cm2；E.100 mJ/cm2 图 1 不同剂量UVB照射后72 h HaCaT细胞形态变化姬姆萨染色×100 A. 0 mJ/cm2; B.20 mJ/cm2; C.50 mJ/cm2; D. 80 mJ/cm2; E.100 mJ/cm2 Figure 1 Morphology of HaCaT cells 72 h after UVB exposure with different doses Giemsa staining ×100

表 1(Table 1)

表 1 不同剂量UVB照射后72 h HaCaT细胞早衰检测指标(%, x±s) Table 1 Index of premature senescence of HaCaT cells at 72 h after different doses of UVB exposure (%, x±s) 照射剂量 (mJ/cm2) 样本数 细胞形态 变化比率 克隆形成率 衰老细胞 比率 0 5 5.28±1.53 90.47±1.30 43.34±3.63 20 5 16.76±1.83a 75.27±1.50a 49.29±1.36a 50 5 28.00±2.65ab 53.60±4.42ab 54.50±4.13a 80 5 36.42±2.52abc 33.20±1.31abc 58.67±3.47ab 100 5 43.14±3.51abcd 24.33±1.72abcd 60.52±1.18abc F值 115.18 410.32 16.31 P值 < 0.05 < 0.05 < 0.05 注：a与0 mJ/cm2组比较，t=2.418~34.106，P < 0.05；b与20 mJ/cm2组比较，t=3.810~26.267，P < 0.05；c与50 mJ/cm2组比较，t=2.448~15.093，P < 0.05；d与80 mJ/cm2组比较，t=3.481、4.573，P < 0.05

表 1 不同剂量UVB照射后72 h HaCaT细胞早衰检测指标(%, x±s) Table 1 Index of premature senescence of HaCaT cells at 72 h after different doses of UVB exposure (%, x±s)

2.不同剂量UVB照射后HaCaT细胞存活率的变化：结果如表 1所示，UVB照射HaCaT细胞72 h后，20、50、80、和100 mJ/cm²不同剂量间差异均有统计学意义(F=410.32，P < 0.05)，克隆形成率降低。

3.不同剂量UVB照射后HaCaT细胞β-半乳糖苷酶活性的变化：如图 2所示，UVB照射HaCaT细胞后72 h，对照组β-半乳糖苷酶染色较浅，且数量较少；而实验组细胞被染成蓝绿色，染色较深，HaCaT细胞体积增大，形状不规则。细胞计数结果显示，与对照组β-半乳糖苷酶活性相比，实验组活性增高，差异有统计学意义(F=16.31，P < 0.05)。

A.0 mJ/cm2；B.20 mJ/cm2；C.50 mJ/cm2；D. 80 mJ/cm2；E.100 mJ/cm2 图 2 不同剂量UVB照射后72 h HaCaT细胞β-半乳糖苷酶染色实验结果β-半乳糖苷酶染色×100 β-Galactosidase staining ×100 A.0 mJ/cm2; B.20 mJ/cm2; C.50 mJ/cm2; D. 80 mJ/cm2; E.100 mJ/cm2 Figure 2 Expression of β-galactosidase in HaCaT cells 72 h after UVB exposure with different doses

4.不同剂量UVB照射后HaCaT细胞溶酶体数量的变化：如图 3与表 2所示，HaCaT细胞随UVB照射剂量的增加，24、48、72 h后溶酶体荧光信号增强，提示溶酶体数量增多，照射组差异均有统计学意义(F=17.65、38.36、13.66，P < 0.05)，早衰细胞数量增加。

图 3 不同剂量UVB照射后24、48、72 h HaCaT细胞溶酶体数量的变化溶酶体红色荧光探针×100 Figure 3 Quantitative change of lysosomes in HaCaT cells 24, 48 and 72 h after UVB exposure with different doses Lyso-Tracker Red staining ×100

表 2(Table 2)

表 2 不同剂量UVB照射后24、48、72 h HaCaT细胞溶酶体数量的变化(个/孔，x±s) Table 2 Quantitative change of lysosomes in HaCaT cells 24, 48 and 72 h after UVB exposure with different doses(/hole, x±s) 照射剂量 (mJ/cm2) 样本数 24 h 48 h 72 h 0 5 44.46±0.36 44.93±0.31 45.33±1.26 20 5 46.61±0.68a 46.89±0.60a 47.56±1.30a 50 5 47.72±1.19a 47.35±1.14a 48.99±1.49a 80 5 47.90±0.80a 49.18±0.58abc 50.06±0.61ab 100 5 49.23±0.25abc 53.50±1.42abcd 52.16±1.18abc F值 17.65 38.36 13.66 P值 < 0.05 < 0.05 < 0.05 注：a与0 mJ/cm2组比较，t=2.639~11.573，P < 0.05；b与20 mJ/cm2组比较，t=2.534~8.934，P < 0.05；c与50 mJ/cm2组比较，t=2.480~8.309，P < 0.05；d与80 mJ/cm2组比较，t=5.829，P < 0.05

表 2 不同剂量UVB照射后24、48、72 h HaCaT细胞溶酶体数量的变化(个/孔，x±s) Table 2 Quantitative change of lysosomes in HaCaT cells 24, 48 and 72 h after UVB exposure with different doses(/hole, x±s)

5.不同剂量UVB照射后HaCaT细胞迁移能力的变化：如表 3与图 4所示，UVB照射后HaCaT细胞愈合能力随照射剂量的增加而减弱，48 h后划痕基本愈合，划痕愈合率差异有统计学意义(F=8.21、11.48，P < 0.05)。

表 3(Table 3)

表 3 不同剂量UVB照射后24、48 h HaCaT细胞划痕愈合率(%，x±s) Table 3 Healing rates of scratched culture 24 and 48 h after UVB exposure with different doses (%, x±s) 照射剂量(mJ/cm2) 样本数 24 h 48 h 0 5 7.75±9.22 53.82±9.25 20 5 5.91±4.66 45.19±10.01 50 5 5.37±6.47a 37.87±11.93a 80 5 4.71±2.34ab 29.40±4.76ab 100 5 2.03±1.09ab 20.27±7.93abc F值 8.21 11.48 P值 < 0.05 < 0.05 注：a与0 mJ/cm2组比较，t=3.738、4.384、4.862、3.532、4.325、6.099，P < 0.05；b与20 mJ/cm2组比较，t=2.609、3.086、2.862、4.635，P < 0.05；c与50 mJ/cm2组比较，t=2.566，P < 0.05

表 3 不同剂量UVB照射后24、48 h HaCaT细胞划痕愈合率(%，x±s) Table 3 Healing rates of scratched culture 24 and 48 h after UVB exposure with different doses (%, x±s)

图 4 不同剂量UVB照射后0、24、48 h HaCaT细胞划痕实验结果×100 Figure 4 Scratch test of HaCaT cells 0, 24, 48 h after UVB exposure with different doses ×100

6.不同剂量UVB照射后HaCaT细胞P53、P16表达的变化：利用蛋白质印迹实验检测P53、P16蛋白表达，P53、P16表达量结果如图 5和表 4所示，经20、50、80和100 mJ/cm² UVB照射HaCaT细胞后72 h，P16表达量增加，蛋白表达差异有统计学意义(F=250.72，P < 0.05)，P53表达量也显著增加(F=68.40，P < 0.05)。

图 5 不同剂量UVB照射后72 h HaCaT细胞P53、P16蛋白的表达 Figure 5 The protein expressions of P53 and P16 in HaCaT cells 72 h after UVB exposure with different doses

表 4(Table 4)

表 4 不同剂量UVB照射后72 h HaCaT细胞P53、P16蛋白表达(x±s) Table 4 The protein expressions of P53 and P16 in HaCaT cells 72 h after UVB exposure with different doses(x±s) 照射剂量(mJ/cm2) 样本数 P16 P53 0 3 0.64±0.002 0.63±0.006 20 3 0.66±0.001a 0.66±0.000a 50 3 0.67±0.002a 0.68±0.008ab 80 3 0.72±0.010abc 0.74±0.020abc 100 3 0.89±0.190abcd 0.78±0.015abcd F值 250.72 68.40 P值 < 0.05 < 0.05 注：a与0 mJ/cm2组比较，t=2.935~27.879，P < 0.05；b与20 mJ/cm2组比较，t=2.721~24.945，P < 0.05；c与50 mJ/cm2组比较，t=5.564、24.110、5.740、10.063，P < 0.05；d与80 mJ/cm2组比较，t=18.546、4.323，P < 0.05

表 4 不同剂量UVB照射后72 h HaCaT细胞P53、P16蛋白表达(x±s) Table 4 The protein expressions of P53 and P16 in HaCaT cells 72 h after UVB exposure with different doses(x±s)

不同种类的射线诱发肿瘤细胞及正常细胞发生早衰的研究均有报道。多项研究发现，X、γ射线照射可引起人肺癌细胞H1299、乳腺间质成纤维细胞发生早衰^[10-11]。电离辐射可抑制瘢痕疙瘩细胞增殖，使细胞出现早衰表型^[12]。同时UVB辐射可诱导正常成纤维细胞中β-半乳糖苷酶的表达，细胞呈现早衰状态^[13]。本研究结果显示UVB照射后，HaCaT细胞的形态发生变化，增殖能力降低，溶酶体数量增多，同时细胞糖酵解相关标志物β-半乳糖苷酶活性(SA-β-gal)增高，迁移能力降低，表明UVB照射可致HaCaT细胞发生早衰。

目前，研究发现细胞衰老的信号通路主要有3条，分别为P16、P53和P62介导的信号通路^[14-16]。研究发现，人黑素细胞衰老过程中P53/P21信号通路激活，P53表达增加^[17]。γ射线可通过P16高表达使人乳腺间质成纤维细胞发生早衰^[11]。成纤维细胞受到电离辐射时，衰老信号激活P62，细胞进行选择性自噬降解，发生免疫反应，进入衰老状态^[14]。本研究结果发现HaCaT细胞受UVB照射后P53、P16蛋白表达升高，HaCaT细胞发生早衰。

本研究发现选取的4个UVB照射剂量点均可使HaCaT细胞发生早衰，早衰细胞出现多个早衰相关表型和特征，与文献结果一致。同时，研究发现，UVB照射HaCaT细胞后，100 mJ/cm²剂量点P16和P53蛋白表达增加显著，表明UVB可能通过激活P16和P53衰老信号通路引起HaCaT细胞发生早衰。HaCaT细胞作为表皮细胞肩负着合成黑色素的重任，因此，HaCaT细胞发生早衰可能会影响皮肤细胞黑色素的合成。这一发现，可能为揭示夏季白癜风患病率高发提供一定理论支持。

利益冲突  无

作者贡献声明  闫娟负责实验和论文撰写；刘青杰、田梅指导论文修改；陆雪、蔡恬静、李爽、赵骅、田雪蕾参与实验设计；陈德清、高玲提供研究思路和指导论文修改