核或辐射事故发生后，应及时对受照人员进行剂量估算，进而为医学诊断和救治提供重要依据^[1-2]。染色体畸变分析被公认为事故剂量估算的“金标准”，并且在国内外重大的核事故中发挥着重要的作用^[3-4]。研究表明，双着丝粒体(dicentrics，dic)是用于生物剂量估算的主要畸变类型。着丝粒环(centric ring，r)的诱发率仅为“dic + r”的5%~10%，常与dic结合用于剂量估算^[5]。目前，国内建立的染色体畸变剂量-效应曲线大多是基于每细胞“dic + r”数。由于实际工作中r和无着丝粒环(acentric ring，ar)很难区分，不易计数，分析时容易产生误差，因此国际原子能机构(IAEA)推荐计数dic用于剂量估算，从而可以适当提高剂量估算效率和准确性^[6-8]。本研究对染色体畸变分析中常见的几种不同结构类型dic进行分析，建立相应的dic剂量-效应曲线，并验证其用于剂量估算的可行性。

1.血样采集：在签署知情同意书的前提下，采集两名成年健康男性外周血样品，无吸烟、有毒、有害化学物质和射线近期接触史。无菌条件下采集静脉血10 ml，肝素抗凝，平均分装至7个无菌照射管内，每份约1.5 ml，准备照射。

2.照射条件：由中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所二级标准剂量学实验室提供的⁶⁰Co γ射线治疗机，在室温下进行单次照射，剂量点分别为0、0.5、1、2、3、4、5和6 Gy，剂量率为0.27 Gy/min，剂量误差为±1%。照射结束后将血液置37℃温箱中静置2 h修复。

3.细胞培养、收获和制片：严格按照本实验室的操作方法进行^[9]。分别吸取各剂量点血液0.8 ml，加入4 ml RPMI 1640培养液中(含20%胎牛血清，青、链霉素各100 μg/ml，0.2 mg/ml植物血凝素和10 μg/ml的秋水仙碱)，37℃恒温培养52 h收获细胞，先用0.075 mol/L KCl低渗10 min，再用甲醇:冰醋酸(V :V =3:1)预固定、固定细胞。制片，干燥后姬姆萨染色。

4.阅片：将所有标本进行编号，分析者在油镜下选择染色体数目为46±1、分散良好、长度适中的中期细胞，分别准确计数dic的数目。本研究对常规染色体畸变分析中几种常见的不同结构类型dic拟定了一套判定方法，以保证分析结果的一致性。①经典型dic：由两条非近端着丝粒染色体形成，两着丝粒位于染色体的中部，距离较远，着丝粒外的染色体臂清晰可辨。②单端型dic：由D或G组染色体和其他组染色体形成，因此其中一个着丝粒位于染色体的顶端，另外一个着丝粒外的染色体臂清晰可辨。③近距型dic：两着丝粒位于染色体的中部，其间距小于同一分裂相中G组染色体的长度，两条染色单体互相靠近，容易计为正常。④双端型dic：由两个近端着丝粒染色体形成，两着丝粒分别位于染色体的两端。一位分析者所观察到的畸变必须由另一分析者进行审核，并记录下显微镜坐标(图 1)。

图 1 注：箭头所示为不同类型dic Figure 1 Different types of dicentrics ×1 000 A. Typical dicentrics; B. Single-ended dicentrics; C. Near-range dicentrics; D. Double-ended dicentrics

5.不同结构类型dic剂量-效应曲线的建立：每个剂量点分析细胞数必须满足统计学要求，由公式n=[(1-p)×96.04]/p(p为每细胞dic数，n为分析细胞数)求得。p值可以从预实验中得到，也可以在分析过程中求出^[10]。将各剂量点的分析细胞数和畸变数输入至由国际原子能机构(IAEA)推荐的CABAS软件中^[11]，拟合最佳二次线性方程y=a+bD+cD²，y为每细胞dic数；D为照射剂量，Gy；a为本底畸变率；b和c为回归系数。曲线的拟合优度用R²表示。

6.不同结构类型dic剂量-效应曲线的初步验证：两个验证样本照射剂量分别为0.7和3.9 Gy(X射线，能量为250 keV)，由本实验室3位分析者(Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)分别对两样本进行分析并计数不同结构类型dic数目，依据不同结构类型dic剂量-效应曲线进行剂量估算。

7.统计学处理：采用SPSS 25.0软件进行统计分析，分析前对数据进行正态性及方差齐性检验。剂量-效应关系分析采用一元线性回归。各组间比较用单因素方差分析，其后两两比较应用LSD检验。应用CABAS软件对剂量-效应曲线拟合度进行卡方检验。估算剂量的相对偏差=│估算剂量-照射剂量│/照射剂量×100%。P < 0.05为差异有统计学意义。

1. ⁶⁰Co γ射线照射离体人外周血诱发的不同结构类型dic分析：0~6 Gy ⁶⁰ Co γ射线照射血样后，不同结构类型dic的畸变率及构成比见表 1。经典型、单端型、近距型和双端型dic的畸变率均随着受照剂量的增加而升高(R²=0.943、0.928、0.886、0.939，P<0.01)；0.5~6 Gy各剂量点不同结构dic的构成均以经典型dic为主，占所有dic的69.34%~79.79%；单端型dic次之，占17.55%~23.65%；近距型dic占0.92%~4.01%；双端型dic占0.92%~3.01%。

表 1(Table 1)

表 1 不同结构类型dic的畸变率及其构成比(%) Table 1 The aberration rates and constituent ratios of different types of dicentrics(%) 剂量(Gy) 分析细胞数 经典型dic 单端型dic 近距型dic 双端型dic 畸变率 构成比 畸变率 构成比 畸变率 构成比 畸变率 构成比 0 10 400 0.06 100.00 0 0 0 0 0 0 0.5 4 000 2.15 78.90 0.53 19.27 0.03 0.92 0.03 0.92 1 2 400 6.25 79.79 1.38 17.55 0.17 2.13 0.04 0.53 2 1 100 21.89 77.14 5.59 19.68 0.45 1.59 0.45 1.59 3 546 47.62 76.92 11.36 18.34 1.28 2.07 1.65 2.66 4 416 83.17 69.34 28.37 23.65 4.81 4.01 3.61 3.01 5 390 129.74 71.98 41.79 23.19 5.13 2.84 3.59 1.99 6 321 174.14 72.13 54.21 22.45 8.41 3.48 4.67 1.94

表 1 不同结构类型dic的畸变率及其构成比(%) Table 1 The aberration rates and constituent ratios of different types of dicentrics(%)

2.不同结构类型dic剂量-效应曲线回归方程的拟合：应用CABAS软件分别对0~6 Gy ⁶⁰Co γ射线诱导的不同结构类型dic的组合(经典型、经典型+单端型、经典型+单端型+近距型及所有不同结构类型)dic进行剂量-效应曲线拟合，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 基于不同结构类型dic拟合的剂量-效应曲线 Table 2 Establishment of dose-response curves based on different types of dicentrics dic组合类型 剂量-效应曲线 χ2值 df值 P值 R2值 经典型 y=(5.80×10-4 ±2.36×10-4)+(1.70×10-2±4.02×10-3)D+ (4.70×10-2± 1.69×10-3)D2 1.30 5 < 0.01 0.998 经典型+单端型 y=(5.86×10-4 ±2.37×10-4)+(1.73×10-2± 4.44×10-3)D+ (6.24×10-2± 1.91×10-3)D2 4.59 5 < 0.01 0.998 经典型+单端型+近距型 y=(5.87×10-4 ±2.37×10-4)+(1.63×10-2± 4.47×10-3)D+ (6.48×10-2±1.93×10-3)D2 5.43 5 < 0.01 0.998 所有不同结构类型 y=(5.87×10-4 ±2.37×10-4)+(1.57×10-2± 4.49×10-3)D+ (6.64×10-2±1.95×10-3)D2 6.19 5 < 0.01 0.998 注：y为每细胞dic数；D为照射剂量，Gy；χ2为曲线拟合度卡方检验；df为自由度；R2为相关系数，其越接近1，说明曲线拟合度越好

表 2 基于不同结构类型dic拟合的剂量-效应曲线 Table 2 Establishment of dose-response curves based on different types of dicentrics

3.不同结构类型dic剂量-效应曲线的验证：3位分析者分别对两个验证样本进行分析，并应用4条剂量-效应曲线进行剂量估算，结果列于表 3。在0.7和3.9 Gy两照射剂量点，3位分析者应用4条曲线估算的受照射剂量差异无统计学意义(P> 0.05)。与实际照射剂量0.7 Gy相比，应用经典型dic剂量-效应曲线估算的受照剂量相对偏差为17.14%~28.57%，其他3条dic剂量-效应曲线(经典型+单端型、经典型+单端型+近距型及所有不同结构类型)估算的受照剂量的相对偏差为7.14%~21.42%；与实际照射剂量3.9 Gy相比，应用4条剂量-效应曲线估算的受照剂量的相对偏差均≤ 13.08%，均较接近于真实剂量。

表 3(Table 3)

表 3 不同结构类型dic剂量-效应曲线的初步验证 Table 3 Validation of dose-response curves based on different types of dicentrics 照射剂量 (Gy) 分析者 经典型dic估算剂量 经典型+单端型dic估算剂量 经典型+单端型+近距型dic估算剂量 所有不同结构类型dic估算剂量 平均值(Gy) 95%可信区间(Gy) 相对偏差(%) 平均值(Gy) 95%可信区间(Gy) 相对偏差(%) 平均值(Gy) 95%可信区间(Gy) 相对偏差(%) 平均值(Gy) 95%可信区间(Gy) 相对偏差(%) 0.7 Ⅰ 0.90 0.74~1.08 28.57 0.84 0.71~0.99 20.00 0.85 0.71~0.99 21.42 0.85 0.72~1.00 21.42 Ⅱ 0.86 0.71~1.03 22.86 0.82 0.68~0.96 17.14 0.82 0.69~0.96 17.14 0.81 0.68~0.95 15.71 Ⅲ 0.82 0.66~0.99 17.14 0.76 0.63~0.91 8.57 0.76 0.62~0.90 8.57 0.75 0.62~0.90 7.14 3.9 Ⅰ 4.41 3.96~4.89 13.08 4.26 3.88~4.67 9.23 4.27 3.88~4.67 9.49 4.29 3.91~4.69 10.00 Ⅱ 4.32 3.91~4.75 10.77 4.18 3.83~4.55 7.18 4.19 3.84~4.56 7.44 4.20 3.86~4.57 7.69 Ⅲ 4.12 3.75~4.50 5.64 3.98 3.66~4.31 2.50 3.97 3.65~4.30 1.79 3.98 3.67~4.30 2.05

表 3 不同结构类型dic剂量-效应曲线的初步验证 Table 3 Validation of dose-response curves based on different types of dicentrics

外周血淋巴细胞dic被认为是估算剂量较为可靠的生物学指标，其优势在于本底变异度低，并且对电离辐射具有较高的灵敏度和特异性^[12-15]。近年来，国外许多实验室建立了dic剂量-效应曲线，并在国际生物剂量比对中取得了较好的估算结果^[16-18]。与国内常用的“dic + r”剂量-效应曲线相比，该方法可以在一定程度上简化分析工作，特别是在核与辐射事故情况下，将会提高生物剂量估算的效率。本实验室在常规的染色体畸变分析中，发现电离辐射诱导的dic表现出不同的结构形态，但目前国内外对这些不同结构类型dic的相关报道较少。

本研究首次将染色体畸变分析中常见dic按照形态进行细化分类并拟定了一套判定方法，主要包括经典型、单端型、近距型和双端型4种不同结构类型dic。对0~6 Gy ⁶⁰Co γ射线诱导的各种类型染色体畸变分别计数，结果表明，每细胞4种不同类型dic率与受照射剂量之间存在明显的正相关。经典型和单端型dic构成比之和约占所有类型dic的92%以上，而近距型dic和双端型dic分别在各照射剂量点的构成比均 < 4%。此外，将4种不同类型dic进行组合拟合剂量-效应曲线，所建立的回归方程均呈线性平方模型，R²值均接近于1，表明曲线拟合度较好。4条曲线与印度实验室建立的0~5 Gy ⁶⁰Co γ射线照射的离体人外周血dic剂量-效应曲线y=(0.001±0.000 4)+(0.029±0.004 8)D+(0.058±0.002 4)D²(R²=0.998)相似^[19]。

生物剂量估算的最重要目的和实际应用价值是在发生核辐射事故时对受照者进行剂量估算，进而指导临床的分类诊断和治疗。应用4条dic剂量-效应曲线分别对两个验证样本进行剂量估算，结果表明，4条曲线估算的受照剂量之间差异无统计学意义，提示4条曲线均具有用于生物剂量估算的可行性。在剂量估算的准确度方面，应用3条曲线(经典型+单端型、经典型+单端型+近距型及所有不同结构类型dic)所估算的受照剂量与真实剂量之间的相对偏差均≤21.42%，而3条曲线对相同样本估算的受照剂量非常接近，表明计数近距型dic和双端型dic对剂量估算的准确性影响不大。同时，由于近距型dic和双端型dic在所有类型dic所占的比例较少并且不容易分辨，因此，在实际工作中这两种类型dic可以忽略不计。经典型dic剂量-效应曲线对两样本估算剂量的相对偏差略高于其他3条曲线，特别是在低剂量组(< 1 Gy)，对0.7 Gy的真实照射剂量估算剂量的最大值为0.9 Gy，相对偏差达到28.75%，但从临床分类诊断角度来看，该剂量仍属于过量照射；在高剂量组，各估算剂量的相对偏差均≤ 13.08%，表明在估算较高受照剂量(>1 Gy)时，可用经典型dic剂量-效应曲线代替其他类型dic进行较准确的剂量估算，这将在一定程度上缩短分析时间和提高剂量估算的工作效率。

本研究在验证剂量-效应曲线的过程中，选择本实验室3位分析者对相同样本进行了分析和剂量估算，发现不同分析者应用相同曲线对同一样本估算的受照剂量与实际照射剂量之间的相对偏差不尽相同，这与国外的研究结果相一致^[20]。其原因可能与分析人员的工作经验有关，提示在应用dic进行剂量估算时，应首先明确dic的判断标准并不断强化分析人员的识别能力，进而确保剂量估算的准确性。

综上所述，本研究建立了0~6 Gy ⁶⁰Co γ射线诱导的不同结构类型dic剂量-效应曲线，研究结果表明，在一定剂量范围内通过计数经典型dic可以较准确地估算出受照剂量，这将降低对分析人员的技术要求，并且为dic染色体自动化分析系统的研发提供理论基础，进而提高生物剂量估算水平和效率。

利益冲突  无

作者贡献声明  李爽负责实验操作、数据统计分析以及论文撰写；陆雪负责实验操作和数据整理；陈德清负责实验方案设计、数据整理和分析；刘青杰在实验方案设计，结果分析和论文修改过程中给予指导