2020, Vol. 40
2. 兰州大学第一医院肿瘤外科 730000
2. Department of Oncology Surgery, First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China
近年来，随着对机体特异性免疫效应、免疫逃逸及免疫检查点的深入研究，免疫治疗取得了长足发展[1]。常规射线在直接杀伤肿瘤细胞的同时可以激活机体免疫系统，但在缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor, HIF)、低a/β比值、P53突变、Bcl-2过表达及肿瘤代谢等多种机制参与下，容易形成放射耐受[2]，进而减弱免疫调节效应。重离子束较常规射线在诱导DNA损伤、细胞周期阻滞，增加基因表达差异及降低肿瘤异质性影响方面具有显著优势[3]，而且对放射耐受的肿瘤细胞的直接杀伤效应比常规射线强2~3倍[4]。与常规放射治疗相比，相同剂量的重离子束可以诱发更强的免疫激活效应[5]。近年来，国内外针对重离子尤其是碳离子放射治疗(carbon ion radiotherapy, CIRT)相继开展了一系列卓有成效的研究[6]。本文就重离子束诱导肿瘤细胞免疫原性死亡、肿瘤微环境变化、免疫逃逸及联合免疫治疗相关机制的研究进展进行综述。
一、重离子束辐射诱导肿瘤免疫原性细胞死亡免疫原性细胞死亡(immunogenic cell death, ICD)是被免疫系统识别并诱导产生抗肿瘤效应的细胞死亡形式，与引起损伤相关分子模式(damage associated molecular patterns, DAMPs)释放的危险信号通路激活有关[7]。相关研究表明，重离子束可以诱导以损伤相关分子模式(DAMPs)，特别是钙网蛋白(calreticulin, CRT)释放为特征的肿瘤免疫原性细胞死亡，进而激活抗肿瘤免疫反应[8]。
重离子束辐射引发肿瘤细胞簇状DNA损伤，从而诱导肿瘤细胞免疫原性死亡。经重离子束辐射后，肿瘤细胞通过释放肿瘤相关抗原(tumor associated antigens, TAAs)，激活热休克蛋白(heat shock protein, HSP)(HSP70和HSP90)并通过CRT表位转移和ATP释放等信号增强抗原提呈细胞(antigen-producing cell, APC)功能。作为一种结合Ca2+的凝集素伴侣，CRT在受到重离子辐射应激后，由内质网(endoplasmic reticula, ER)内腔转移到肿瘤细胞膜表面，形成膜暴露，即ecto-CRT。通过发挥“eat-me”信号介导作用，促进树突状细胞(dendritic cell, DC)抗原呈递能力，进而增强邻近吞噬细胞的吞噬功能，并且在激活抗肿瘤免疫应答方面发挥关键作用[9]。Huang等[8]通过光子、质子和碳离子照射后，肺腺癌A549、神经胶质瘤U251MG、舌鳞癌Tca8113及鼻咽癌CNE-2 4种人类癌细胞膜表面ecto-CRT的表达差异发现，低剂量(2、4 Gy)的碳离子辐射比同等剂量的质子和光子具有更强的诱导ecto-CRT表达的能力，但在高剂量(10 Gy)辐射下，ecto-CRT表达水平升高程度降低。分析原因认为碳离子10 Gy的物理剂量超过了诱导肿瘤细胞ICD的最佳剂量窗口，可能引发了不同的细胞死亡模式。
重离子束引发肿瘤细胞免疫原性死亡后尚可诱导多种损伤相关分子模式释放，尤其是HMGB1[10]。在同等辐射剂量下，HMGB1的暴露水平随传能线密度(linear energy transfer, LET)的增加而升高[11]。与常规X射线相比，高LET的碳离子束显著增加了多种癌细胞，尤其是NCI-H460肺癌细胞中HMGB1的释放[12]。Takahashi等[13]研究发现，与未经照射的小鼠骨肉瘤细胞株(LM8)相比，经碳离子辐射48 h后收集的细胞培养上清液中，HMGB1释放增加了3倍以上。此外，与低LET光子和质子束相比，碳离子会诱导产生更多的HMGB1等辐射调节形成53BP1焦点，这被认为是高LET辐射引起更复杂的DNA损伤模式的特征[14]。
与其他射线类似，重离子束辐射不仅引发肿瘤细胞免疫原性死亡(ICD)，而且诱导了远隔效应的发生[15]。Ebner等[16]追踪报道了2例复发性结肠癌伴远处脏器转移的患者，在接受了碳离子放射治疗后，原发部位复发肿瘤以及远处病灶均明显缩小。关于重离子照射后远隔效应是否较常规放射治疗更明显以及是否通过联合免疫疗法可以进一步增强远隔效应还有待于大样本、多中心临床试验证实。
二、重离子束辐射诱导肿瘤微环境改变肿瘤进展与肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)密切相关。肿瘤细胞通过释放细胞外信号促进肿瘤血管生成，诱导外周免疫细胞募集，进而影响肿瘤微环境。由免疫系统参与的肿瘤微环境具有免疫编辑双重作用，可以通过识别其他免疫细胞，产生细胞因子并发挥免疫抑制功能，进而直接或间接地促进肿瘤细胞生长和转移[17]。
和常规射线类似，重离子束可以促使肿瘤细胞和基质发生表型变化，导致肿瘤微环境内肿瘤细胞的免疫原性改变[18]。重离子辐射诱导肿瘤微环境中转化生长因子β(TGF-β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β、IL-6等多种细胞因子改变并由此引发免疫细胞活化及功能改变。同等剂量下，碳离子较X射线可以显著提高LPS激活后巨噬细胞的吞噬活性[19]，但引起的旁观者效应却明显降低[20]。另外，重离子在显著增加大鼠胸腺及脾脏中CD3+CD4-CD8+ T细胞(细胞毒性T淋巴细胞)及CD3+CD4+CD8- T细胞(辅助性T淋巴细胞)的浸润及构成比例的同时[21]，却在一定程度上诱导了树突状细胞DC凋亡，然而由此引发的LPS及CpG-ODN处理后的DC中IFN-γ及IL-12的显著增加，却为重离子联合免疫治疗提供了新的策略[22]。
决定肿瘤微环境内炎性浸润及免疫学改变的关键因素是组织缺氧[23]。如何解决因缺氧等微环境变化诱导的放射耐受问题，已成为众多学者研究的热点。与常规射线不同，重离子束对缺氧条件耐受性明显增强[24]。即使在缺氧或低放射剂量条件下，重离子束也能明显抑制肿瘤细胞浸润和转移，同时减少肿瘤组织内血管生成和侵袭[25]。具有高LET特征的重离子束可以诱导形成高度复杂的DNA损伤，包括簇状DNA损伤和DNA双链断裂(double strand break, DSB)[26]。这些难以修复的复杂DNA损伤更容易导致细胞坏死。
与低LET的常规射线相比，重离子束不仅可以诱发更大比例的肿瘤细胞坏死，而且诱导机制不同[27]，后者具有更多诱导神经酰胺的途径以及增加复合物的能力。另外，重离子束诱导DNA双链损伤，必然导致更大程度的细胞自噬，引起细胞凋亡和有丝分裂紊乱。这种破坏细胞的方式会导致更多肿瘤特异性抗原的释放，具有更高的免疫原性，进而增强了肿瘤局部及远处病灶的免疫效应。
三、重离子束辐射与肿瘤免疫逃逸免疫逃逸作为肿瘤细胞生存的重要机制，由肿瘤和基质细胞产生的细胞因子以及癌变引起的病理生理学改变等多种机制诱导，其中包括人类白细胞抗原Ⅰ(human leukocyte antigen Ⅰ, HLAⅠ)的缺陷[28]以及糖皮质激素(glucocorticoid, GC)的诱导[29]。此外，肿瘤还可以通过各种机制逃避由NKG2D/NKG2DL介导的免疫反应。研究显示肿瘤细胞在转录、翻译和翻译后水平通过调节NKG2DL的表达，逃避NK细胞的识别，引起免疫逃逸[30]。
重离子束通过促进肿瘤免疫原性细胞表型变化，对肿瘤微环境进行免疫编辑，增加其对免疫监视的敏感性，进而减少肿瘤细胞免疫逃逸[11]。重离子辐射后，部分细胞获得了衰老相关分泌表型(senescence associated secretory phenotype，SASP)，并引起SASP标记物IL-6、IL-8、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等表达上调，促进肿瘤细胞衰老凋亡及氧化应激产生。这些变化对于增加肿瘤细胞免疫原性，提高效应细胞免疫应答，减少免疫逃逸至关重要[31]。另外，重离子束对调节IL/sIL-2R系统中sIL-2R的表达起到关键作用，而可溶性白介素2受体(sIL-2R)作为一种糖蛋白，在调节细胞免疫功能中具有重要作用，通常被认为是引起免疫逃逸的另一个重要指标[32]。由于重离子束消减了肿瘤负担，因此通过阻断肿瘤激活T淋巴细胞来减少sIL-2R的分泌。重离子束还可以破坏靶细胞的DNA双链，导致基因突变或细胞坏死，并触发机体对该信号的反馈调节，从而使sIL-2R与IL-2结合增加，减少浆液中sIL-2R的含量，继而激活免疫应答，减少免疫逃逸。
此外，重离子束在调节细胞周期检查点方面起到重要作用。最近一项研究表明，与相同剂量的X射线相比，经重离子照射后，协调DNA损伤和细胞周期检查点反应的检查点激酶1(CHK1)增加了约3倍[33]。值得注意的是，细胞周期检查点反应显示出明显LET依赖性。因此，重离子束在参与细胞周期调节，减少免疫逃逸方面起到关键作用。
四、重离子联合免疫检查点抑制剂治疗相关分子机制近年来，PD-L1/PD-1及CTLA-4免疫检查点作为肿瘤免疫抑制的重要组成部分，已成为免疫治疗靶位的研究热点[34]。它可以抑制T淋巴细胞的活化并增强肿瘤细胞的免疫耐受。
有研究表明，碳离子联合双重免疫检查点抑制治疗(抗PD-L1和抗CTLA-4抗体，P1C4)可以显著增强抗肿瘤免疫活性及远隔效应[13]。该研究显示，碳离子束可以提高免疫检查点蛋白PD-L1和CD80表达水平并且呈现出剂量依赖性，进而与免疫检查点抑制剂发挥协同增效作用。另外，碳离子联合免疫检查点抑制剂可以增强照射区域肿瘤细胞TILs活性。实验发现，与碳离子或P1C4单用治疗相比，碳离子联合P1C4组中CD8+/GzmB+ TILs显著增加，免疫激活指标CD8+/Treg比值明显升高。说明CD8+ T细胞在介导碳离子辐射与双重免疫治疗引起的免疫应答中发挥关键作用。此外，碳离子联合免疫检查点抑制剂在增加损伤相关分子模式如HMGB-1释放，提高远隔效应及放射敏感性，抑制肿瘤远处转移及改善预后等方面表现出显著优势。
虽然目前研究已表明重离子联合免疫检查点抑制治疗较常规射线具有优越的生物学效应，但其相关分子机制尚未完全明确。先前研究表明，辐射可以作为原位疫苗诱导剂，参与引发肿瘤免疫反应的关键步骤[35]。从机制上讲，DAMPs表达上调是由辐射诱导的mTOR信号通路激活以及随后增强的抗原呈递引发[36]。辐射可以通过诱导上调NKG2D配体表达，作为先天性和适应性免疫系统的有效免疫调节剂[37]。另外可以促进肿瘤细胞表面FAS表达上调[38]，通过FAS/FAS-L轴激活Caspases-3/6/7诱导程序性细胞死亡。通过该机制，辐射可以增强对免疫治疗诱导的细胞死亡的敏感性。此外，辐射还可以增加肿瘤细胞表面淋巴细胞浸润[39]，其主要涉及两种机制：血管内皮改变增加免疫细胞的外渗；趋化因子诱导剂表达上调促进免疫细胞的迁移和侵袭。另有研究显示，血小板内皮细胞粘附分子-1(CD31)可以通过辐射诱导表达上调，进而发挥免疫协同作用[40]。
五、总结及展望综上所述，重离子束较传统射线在诱导肿瘤细胞免疫原性死亡进而改变肿瘤微环境以及减少因放射耐受等多因素参与的免疫逃逸方面具有显著优势，并且显示出联合免疫检查点抑制剂治疗独特的生物学效应。尽管重离子联合免疫治疗在部分肿瘤已取得一定进展，但相关研究更多停留在动物模型。考虑到建立和运营重离子治疗中心高昂的成本，有必要在更多机构进行相关基础和临床试验并实现多区域数据共享及对比分析，进而为重离子联合免疫治疗推广提供数据支持。
利益冲突 无
志谢 感谢兰州大学第一医院院内基金(ldyyyn2018-21)对本研究的资助
作者贡献声明 王江涛负责文献搜集与论文撰写；冉俊涛和关泉林指导论文修改
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