通过对斑马鱼和人类参考基因组的比较发现，70%以上的人类基因至少有一个明显的斑马鱼同源基因与之对应^[1-2]。因此，斑马鱼成为研究脊椎动物早期发育最适宜的模型动物，是基础和应用生物医学研究的重要模式生物。因斑马鱼的胚胎透明，在血液系统的发育方面具有难以替代的优势，也常用于造血调控活性剂的药物筛选^[3]。中药为多组分的复杂系统，药理研究主要使用哺乳动物，斑马鱼作为水生生物是否可以用于中药药理的研究，需要证据支持。四物汤为中药经典补血方剂，首见于唐代《仙授理伤续断秘方》^[4]，由熟地、当归、白芍、川芎四味中药组成，具有补血调血之功效，可用于治疗营血虚滞诸症。临床上主要用于治疗贫血、痛经、心绞痛、糖尿病等多种病症。现代药理学研究表明其可调控红细胞和白细胞的生成，具有辐射防护作用^[5-7]。本研究旨在通过观察四物汤对斑马鱼血液系统辐射损伤的干预作用，评价斑马鱼用于中药血液系统调控研究的可行性。

1.材料：白芍、当归、熟地、川芎药材购自于中央民族大学校医院；NaCl、KCl、Na₂HPO₄、KH₂PO₄均为分析纯，北京化工厂生产；Tricaine为试剂纯，上海麦克林生化科技有限公司提供；肝素，北京华迈科生物技术有限责任公司提供；胎牛血清，美国GIBCO公司生产。AB系斑马鱼(Danio rerio)，中国科学院水生生物研究所国家斑马鱼中心提供。斑马鱼4月龄，雄性，体质量0.14~0.20 g，72只。

2.四物汤的制备：称取白芍、当归、熟地、川芎各30 g于600 ml超纯水煎煮30 min，室温冷却沉降。4 000 g离心30 min去除粗颗粒，8 000 g离心30 min去细沉淀。取上清液为四物汤原液。并保证每次制备的四物汤液生药材含量为0.27 g/ml。

3.辐射对斑马鱼血液发育动力学改变：根据参考文献^[8]方法采用⁶⁰Co γ射线照射，照射剂量为20 Gy，照射时间21 min，吸收剂量率97.33 cGy/min。取36只斑马鱼，其中27只接受照射，照射后放入饲养循环系统中进行正常饲养。分别于照射后7、14和30 d剖杀动物，分离外周血细胞和肾髓细胞进行流式上机检测。另取9只作为未照射(0 d)对照。根据辐射消融血液的最低点，确定四物汤给药周期和实验终点。

4.四物汤药物处理：36只斑马鱼采用随机数表法分为未照射组、单纯照射组(20 Gy)、药物2 000组(四物汤液稀释2 000倍)、药物5 000组(四物汤液稀释5 000倍)。除未照射组外其他各组均按照上述条件进行照射。照射后第2天开始，药物2 000组和药物5 000组每日给予相应浓度四物汤处理4 h，连续6 d。照射后第7天剖杀动物，分离外周血细胞和肾髓细胞在流式细胞仪上检测。

5.外周血细胞分离和检测：斑马鱼尾部取血0.5 μl，经预先包被过肝素(100 μg/ml)的枪头加入到盛有700 μl 0.9×磷酸盐缓冲液(PBS)+5%胎牛血清(FBS)的EP管中，轻轻震荡摇匀。200 g离心6 min，弃上清，加入300 μl上述细胞使用液。重悬细胞，过40 μm筛网，进行流式上机检测。

6.肾髓细胞的分离和检测：取斑马鱼肾脏，放入含有2 ml含5%胎牛血清和10 ng/ml肝素0.9×PBS液中，吹打液体，将细胞充分打散。200 g离心6 min去上清。加入300 μl重悬液体，过40 μm筛网，进行流式上机检测。

7.斑马鱼细胞样品的流式细胞分析：斑马鱼造血器官为肾，全肾髓细胞(whole kidney marrow cells，WKMCs)中主要有髓系单核细胞、前体细胞、淋巴细胞和红细胞。肾髓细胞样品利用前向角散射光(forward scatter light，FSC)和侧向角散射光(side scatter light，SSC)进行分群后，呈现四群细胞，分别为髓系单核细胞、淋巴细胞、前体细胞和红细胞^[8]。斑马鱼的成熟红细胞为有核红细胞，在外周血中占96.1%~99.1%^[9]，因此对外周血样品进行细胞绝对计数，该数量的变化可以视为红细胞的变化。

8.统计学处理：采用SPSS 20.0统计软件进行数据分析，经正态性检验和方差齐性分析，数据以x±s表示，数据资料采用单因素方差(One-Way ANOVA)检验，组间两两比较采用LSD-t检验，P < 0.05为差异具有统计学意义。

(1) 外周血细胞和全肾髓细胞数量：与未照射(0 d)相比，照射后第7天外周血细胞数量平均减少26%(t=4.537，P < 0.05)；第14天恢复至未照射水平，比第7天明显升高38%(t=8.980，P < 0.05)；第30天外周血细胞的数目略高于未照射，平均升高17%，差异无统计学意义(P>0.05)。WKMCs的变化与外周血不同。照射后第7天斑马鱼的WKMCs平均下降52%(t=28.987，P < 0.05)；第14天比未照射平均下降了37%，比第7天平均升高了31%，但差异均无统计学意义(P>0.05)；第30天WKMCs数量与未照射相比反而平均升高了41%，差异有统计学意义(t=5.275，P < 0.05)。全程分析可见，20 Gy⁶⁰Co γ射线照射后，斑马鱼外周血和WKMCs数量急剧减少，照射后第7天开始逐渐增加，第30天甚至超过照射前WKMCs的数量。斑马鱼的血液动力学变化表明该照射造成的血液损伤为可逆性损伤，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 照射后不同时间斑马鱼外周血细胞和WKMCs数量变化(x±s) Table 1 Changes of the number of peripheral blood cells and WKMCs of zebra fish after irradiation(x±s) 照射后时间(d) 只数 外周血细胞 WKMCs 0 9 80 037±32 871 37 963±12 453 7 9 59 112±18 128a 18 221±4 854a 14 9 81 718±22 528 23 936±8 649 30 9 93 832±16 544 64 554±32 422a   注：WKMCs.全肾髓细胞。a与0 d同指标比较, t=4.535, 28.987, 5.275, P < 0.05

表 1 照射后不同时间斑马鱼外周血细胞和WKMCs数量变化(x±s) Table 1 Changes of the number of peripheral blood cells and WKMCs of zebra fish after irradiation(x±s)

(2) 肾髓中各细胞数量：照射后7 d淋巴细胞、髓系单核细胞、红细胞均比0 d时减少了79%、46%、33%，差异均有统计学意义(t=66.900、18.457、9.872，P < 0.05)；照射后14 d淋巴细胞和红细胞均比0 d时减少了62%和28%，差异均有统计学意义(t=26.617、5.050，P < 0.05)。照射后髓系单核细胞数量第14天与第7天比较平均升高73%，差异有统计学意义(t=9.411，P < 0.05)；前体细胞数量在照射后第7和14天分别下降49%和43%，与0 d比较差异均无统计学意义(P>0.05)。照射后30 d所有细胞均恢复到未照射水平以上。见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 斑马鱼照射后不同时间肾髓中各细胞数量的变化(个，x±s) Table 2 Changes of the number of 4 types of cells in kidney marrow of zebra fish after irradiation (x±s) 照射后时间(d) 只数 淋巴细胞 髓系单核细胞 前体细胞 红细胞 0 9 11 745±4 191 6 959±2 165 5 478±2 886 13 054±4 258 7 9 2 504±699a 3 742±1 441a 2 785±1 165 8 739±2 351a 14 9 4 475±1 908a 6 482±2 933 3 077±1 135 9 394±3 021a 30 9 17 708±11 227 14 751±7 504a 15 260±9 554a 15 210±5 007   注：与0 d同细胞比较，at=66.900、26.617、18.457、8.956、8.644、9.872、5.050, P < 0.05

表 2 斑马鱼照射后不同时间肾髓中各细胞数量的变化(个，x±s) Table 2 Changes of the number of 4 types of cells in kidney marrow of zebra fish after irradiation (x±s)

实验结果显示，辐射对斑马鱼血液消融最低点为7 d，整体血液发育周期为30 d左右。因此，四物汤对斑马鱼血液系统辐射损伤的干预作用给药周期和观察时间点定为7 d。

(1) 外周血细胞和全肾髓细胞数量：与未照射组相比较，单纯照射组外周血细胞的数量平均减少26%(t=5.442，P < 0.05)。而药物2 000组和药物5 000组与未照射组比较差异无统计学意义(P>0.05)，但药物5 000组平均升高了12%。WKMCs对照射更为敏感，与未照射组比较，单纯照射组WKMCs数量下降52%(t=28.987，P < 0.05)；与单纯照射组比较，药物5 000组WKMCs数量增加57%(t=12.128，P < 0.05)。药物2 000组与单纯照射组比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 各组斑马鱼照射后外周血细胞和WKMCs数量变化(x±s) Table 3 Effects of Siwu decoction on the number of peripheral blood cells and WKMCs of zebra fish after irradiation (x±s) 组别 只数 外周血细胞 WKMCs 未照射组 9 80 037±32 871 37 963±12 453 单纯照射组 9 59 112±18 128a 18 221±4 854a 药物2 000组 9 55 751±11 523a 15 435±4 143a 药物5 000组 9 66 303±16 432 28 656±10 028b   注：WKMCs.全肾髓细胞。a与未照射组同细胞比较, t=5.442、9.882、28.987、42.407, P < 0.05; b与单纯照射组比较, t=12.128, P < 0.05

表 3 各组斑马鱼照射后外周血细胞和WKMCs数量变化(x±s) Table 3 Effects of Siwu decoction on the number of peripheral blood cells and WKMCs of zebra fish after irradiation (x±s)

(2) 肾髓中髓系单核细胞、前体细胞、淋巴细胞和红细胞数量：与未照射组相比，单纯照射组淋巴细胞数量、髓系单核细胞数量、前体细胞数量和红细胞数量分别下降369%、46%、49%和33%(t=66.900、18.457、9.889、9.872，P < 0.05)；与单纯照射组相比，药物5 000组髓系单核细胞数量、前体细胞数量和红细胞数量分别升高125%、81%和35%(t=21.598、15.473、4.594，P < 0.05)。药物5 000组淋巴细胞数量升高59%，差异无统计学意义(P>0.05), 药物2 000组4种细胞数量与单纯照射组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表 4。

表 4(Table 4)

表 4 各组斑马鱼照射后肾髓中各细胞数量的影响(x±s) Table 4 Effects of Siwu decoction on the number of 4 types of WKMCs in zebra fish after irradiation (x±s) 组别 只数 淋巴细胞 髓系单核细胞 前体细胞 红细胞 未照射组 9 11 745±4 191 6 959±2 165 5 478±2 886 13 054±4 258 单纯照射组 9 2 504±699a 3 742±144a 2 785±1 165a 8 739±2 351a 药物2 000组 9 2 111±762a 3 161±725a 2 621±971a 7 154±2 226a 药物5 000组 9 3 973±1 699a 7 106±2 260b 5 047±1 780b 11 805±4 768b   注：a与未照射组比较, t=66.900、77.224、36.687、18.451、39.769、9.889、12.645、9.872、20.089, P < 0.05; b与单纯照射组比较, t=21.598、15.473、4.594, P < 0.05

表 4 各组斑马鱼照射后肾髓中各细胞数量的影响(x±s) Table 4 Effects of Siwu decoction on the number of 4 types of WKMCs in zebra fish after irradiation (x±s)

肾髓是成年斑马鱼的造血器官，相当于哺乳动物的骨髓。造血干细胞在此生成，发育成造血干/祖细胞(hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs)，在特定调控下分化为定向的前体细胞，继续向下分化为多种血细胞，或是进入不同组织分化为免疫细胞^[10-11]。到目前为止，造血干细胞的定向分化仍然不明确，可以肯定的是这一过程处于特定调控的定向分化。在本实验中，全肾髓细胞的数量及其包含的四群细胞，髓系单核细胞、淋巴细胞、前体细胞和红细胞的数量在照射之后的变化规律基本为从照射开始数量减少，再到逐渐恢复至照射前的水平，最后超过照射前水平。而髓系单核细胞、淋巴细胞、前体细胞和红细胞这4群细胞由于对照射的敏感性不同，导致其细胞减少的程度并不相同。照射对红细胞的影响较小，对淋巴细胞的影响较大。在刚受到照射后淋巴细胞和前体细胞数目减少速度最快，幅度最大。而在恢复阶段，前体细胞群应最先恢复，因为前体细胞中包含了红系、髓系和淋巴系的所有前体，这些前体细胞持续不断的分化成熟，形成髓系单核细胞、淋巴细胞和红细胞^[12]，补充进入相应的细胞群中，照射后第7天前体细胞数量是对照组的51%，推测照射消融造血系统后，刺激造血干细胞持续产生，继续分化为造血祖细胞和前体细胞，随之分化为多种血液细胞。所以前体细胞在未补充足够的外周血细胞和肾髓储存细胞之前，一直处于动态变化的过程，这一过程可以从淋巴细胞、红细胞、髓系单核细胞在照射后7 d内处于降低状态，而在第7天至第14天期间已经开始回升得到证明。另一方面，前体细胞的动态变化复杂，并不容易捕捉到，这可能是前体细胞在照射第7天至第14天占比保持稳定的原因。淋巴细胞群中包含了大量的淋巴细胞、淋巴前体细胞和少量的HSPCs^[13-14]。HSPCs和淋巴细胞的形态极其相似很难分开，Stachura等^[12]将分选获得的淋巴细胞群与肾脏基质细胞共培养发现，出现了后代可以分化为红细胞、前体细胞和髓系单核细胞的克隆簇。淋巴细胞群细胞数量虽然在照射后迅速降低，且在照射后第14天前都维持在较低水平，但是其中的HSPCs部分不断的分化，对肾髓中的细胞恢复具有重要的作用。根据斑马鱼造血的动力学特征，在对四物汤的研究中选择照射后第7天作为实验观察的终点，以避免肾髓自身造血功能的快速恢复影响药效的观察。有学者利用微球对肾髓中细胞平均大小进行测量，从小到大的顺序分别为红细胞6.2 μm < 淋巴细胞8.3 μm < 髓系单核细胞15.2 μm < 前体细胞13.8 μm，结合细胞核染色判定细胞的归属^[14]。

四物汤是具有补血作用的经典中药方剂，无论是古医籍记载，还是临床应用，其补血功用被广泛认可。四物汤的现代药理学研究在动物水平证实了其具有造血促进作用和辐射保护作用，这为四物汤的造血机制探索奠定了扎实的基础^[15-16]。斑马鱼在造血方面研究的优势是啮齿类和其他动物难以达到的。因此，近年来大量应用斑马鱼研究血液系统的文章显著增多^[17-18]。基于此，本研究旨在评价斑马鱼是否能够验证中药四物汤的血液调控作用，并希望在此基础上对四物汤血液系统方面的活性作用获得更深入的认识。

斑马鱼对化学物质极为敏感，因此经常被用于水质监测和毒理研究^[19-20]。在四物汤对斑马鱼的毒性研究中发现，600倍以下稀释可引起斑马鱼死亡，1 000倍稀释连续2周不影响斑马鱼存活。1 000倍及以上稀释未见血液系统异常。因此，以四物汤2 000倍和5 000倍稀释作为斑马鱼的给药浓度。结果表明5 000倍稀释四物汤对辐射导致的斑马鱼肾髓造血细胞的消融具有明显的恢复作用，肾髓中淋巴细胞、髓单核细胞、前体细胞和红细胞的数量均有显著升高，推测四物汤可能在造血早期血液干细胞水平发挥了调节作用。本研究为揭示四物汤在造血阶段的调控机制提供参考。

利益冲突  全体作者无利益冲突，排名无争议，未因进行该研究而接受任何不正当的职务或财务利益，所写内容均中立客观，不存在任何利益冲突

志谢 中央民族大学研究生院提供课题经费资助(硕士研究生自主科研项目，SSZZKY-2019111)。感谢北京大学肿瘤医院中心实验室沈靖研究员、丁慧荣副主任技师、刘锡娟副主任技师提供流式细胞仪的使用。感谢军事医学研究院辐射医学研究所王升启、周喆研究员提供辐射源的使用

作者贡献声明  张恂负责实验方案实施、数据分析和论文撰写；张楠负责斑马鱼饲养、实验操作和样品检测；郭艳茹、刘琪、周雪、米盈盈、杨康参与实验操作；朱丹负责整体研究设计、监督实验实施，数据分析结果的复核，论文写作指导和修改