新辅助同步放化疗由于可以降低直肠癌分期，减少局部复发率提高保肛率，是局部晚期直肠癌综合治疗中的重要组成部分^[1]。直肠癌新辅助放疗同步系统化疗的降期率高达57.4%^[2-3]。尽管如此，无论是从肿瘤病理缓解率还是肿瘤降期率来说，仍有40%~50%的患者对上述新辅助治疗不敏感^[1-4]。通过分子生物学手段，找到与患者新辅助放化疗疗效相关的分子标志物，有重要临床意义。X射线修复交叉互补基因1(X ray repair cross complementing group 1, XRCC1)是DNA损伤修复的重要基因，其参与离子辐射和化疗药物所致DNA损伤后的单链断裂修复和碱基切除修复^[5-6]。XRCC1基因多态性可影响其对DNA损伤修复的能力，进而影响肿瘤放化疗敏感性^[7]。本研究是一项前瞻性研究，将探讨XRCC1 rs25487多态性与局部进展期直肠癌新辅助放化疗效果的关联性。有研究显示，炎症/免疫反应与直肠癌放疗疗效相关，中性粒细胞淋巴细胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)反映人体炎症/免疫平衡状态^[8-9]。因此, 本研究探讨XRCC1 rs25487多态性与NLR等临床特征交互作用对新辅助放化疗疗效的影响，旨在为局部进展期直肠癌个体化治疗提供参考依据。

1.研究对象：本研究建立了一个前瞻性队列，纳入于2018年8月至2019年7月在贵州医科大学附属医院/贵州省肿瘤医院腹部肿瘤科就诊的55例局部进展期直肠癌患者作为研究对象。纳入标准：①经病理诊断的直肠腺癌。②肿瘤下缘距离肛缘12 cm以内。③经直肠MRI评估为T₃~T₄期和(或)N+。④血常规、肝肾功能、电解质及心肺功能检查均正常，无放化疗及手术禁忌证。⑤既往未接受过放疗、化疗等抗肿瘤治疗。诊断疾病至入组前无氟尿嘧啶类药物过敏史、无铂类药物过敏史。排除标准：①同时性多原发恶性肿瘤。②手术为非根治性手术，无法评估T、N分期。③治疗前行胸部CT、中上腹部CT增强检查评估发现远处脏器转移。本研究经贵州省肿瘤医院伦理委员会批准(审批号:20180409), 所有患者或其亲属签署知情同意书。

2.基线资料：纳入患者在治疗前通过医院电子病历系统收集患者的社会人口学资料(如年龄、性别等)和身高、体重、肿瘤分期、癌胚抗原(carcinoembryonic antigen，CEA)、NLR值、病理完全缓解情况(pathologic complete response, pCR)等临床信息。在治疗前采集所有患者空腹静脉血检测XRCC1 rs25487多态性。

3.治疗方案:术前同步放疗：所有患者均采取三维调强适形放疗(IMRT)。三维计划系统(ADAC-Pinnacle 9.3)制定放疗计划，均采用瑞典医科达公司Synergy直线加速器6 MV X射线放疗。放疗靶区勾画参考2018年中国医师协会结直肠肿瘤专业委员会放疗专委会制定的《直肠癌术前/术后适形/调强放疗靶区勾画共识与图谱》^[10]。大体肿瘤体积(GTV)：肠镜和影像学显示的直肠肿瘤；转移淋巴结(GTVnd)：影像学提示的区域转移淋巴结；CTVp:原发灶头脚方向外扩2 cm的范围；临床靶区(CTV)：包括直肠系膜区、骶前区、髂内及闭孔淋巴引流区、骶3上缘以上的髂外和部分髂总淋巴引流区。计划靶区PTV由CTV外扩而成(左右、头脚及背腹方向均外扩0.5 cm)。危及器官的勾画包括照射范围内及PTV上1 cm的小肠、结肠、膀胱、双侧股骨头。6 MV X射线，常规分割，计划靶区PTV处方剂量为50.4 Gy，1.8 Gy/次，1次/d，5次/周，共28次。放疗同步的化疗方案：氟尿嘧啶400 mg/m²，静脉推注，第1天, 同时氟尿嘧啶2 400 mg/ m²，持续静脉泵入46~48 h; 奥沙利铂85 mg/m²，静脉输注，第1天；亚叶酸钙400 mg/m²，静脉输注，第1天。每两周重复1次，放疗期间同步2~3个周期，放疗至手术间隔期内行2~3个周期。55例患者中位同步化疗周期为4个周期，80%的患者完成了4周期以上化疗。根治性手术：放疗结束后6~8周手术。所有入组患者均按全直肠系膜切除原则(total mesorectal excision，TME)行经腹会阴直肠切除术或前切除术，且术后病理提示全部患者获得完整切除(R0)。

4.疗效评估标准：新辅助放疗前肿瘤分期通过直肠MRI进行评估，术后肿瘤分期及病理完全缓解情况通过石蜡包埋的组织病理切片进行评估。新辅助放疗前临床分期和术后病理肿瘤分期分别标记为cTNM和ypTNM，分期标准采用美国癌症联合委员会(AJCC)分期第8版^[11]。术后T分期、N分期，与新辅助放化疗前T分期、N分期进行比较，以是否降期、病理是否完全缓解为标准判断新辅助放化疗疗效。分别以T分期、N分期是否降期，病理是否完全缓解进行分组。

5.基因分型测定：纳入患者在放疗前均用真空抗凝(EDTA)采血管采集空腹静脉血5 ml，使用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)进行抽提DNA，操作方法参照说明书，使用NanoDrop系统(美国赛默飞世尔科技公司)定量DNA，得到的DNA产物于-20℃冰箱中保存备用。通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)数据库得到目的基因的序列，遵循引物设计原则使用Primer3(Version 4.0)设计引物。采用加州大学圣克鲁兹分校(University of California Santa Cruz，UCSC)数据库中In-silico PCR tool进行引物特异性检验。正向引物：5′ TCTGACTCCCCTCCAGATT 3′，反向引物：5′ GCCCCTCAGATCACACCTA 3′。采用Bio-Rad CFX96实时PCR system(美国Bio-Rad公司)聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)进行基因片段扩增，建立PCR反应体系：2×PCR Super Mix 20 μl，上、下游引物各1 μl，DNA模板3 μl，加去离子水至40 μl。反应条件：95℃ 3 min，95℃ 20 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环；72℃ 2 min。扩增得到的序列送北京擎科新业生物技术有限公司进行DNA测序，确定各基因型。

6.统计学处理：采用R软件(http://www.R-project.org)对数据进行统计分析。采用拟合优度χ²检验分析纳入者基因型频率是否符合Hardy-Weinberg平衡。计量资料用x±s表示，根据连续变量的正态性和方差齐性, 组间比较选择t检验或U检验；计数资料以例数或率表示，组间比较采用χ²检验。建立logistic回归模型探讨XRCC1基因rs25 487位点基因型与新辅助强化治疗后降期及pCR的关联性，通过校正了患者性别、年龄、肿瘤分期、NLR、肿瘤标志物的比值比(odds ratio，OR)和95%置信区间(confidence interval，CI)评估相关性。使用分层分析探究基因-临床特征的交互作用。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.患者一般资料比较：共纳入55例患者进入研究。男性33例，女性22例。中位年龄50.7岁，NLR中位值2.72。T分期未降期组中性别、年龄、CEA、XRCC1基因型、NLR、放疗前N分期，与T分期降期组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)；但T分期未降期组中放疗前T_4B分期患者比例及放疗后yN+患者比例均显著高于T分期降期组(χ²=10.15、33.92，P < 0.05)。N分期未降期组中性别、年龄、CEA、XRCC1基因型、NLR与N分期降期组相比，差异均无统计学意义(P>0.05)；N分期未降期组中放疗前T_4B分期患者比例及放疗后ypT_3~4患者比例均高于N分期降期组(χ²=15.47、24.77，P < 0.05)。见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 55例局部进展期直肠癌患者基线特征比较 Table 1 Comparison of baseline characteristics of 55 patients with locally advanced rectal cancer 变量 T未降期 T降期 χ2值 P值 N未降期 N降期 χ2值 P值 例数 构成比(%) 例数 构成比(%) 例数 构成比(%) 例数 构成比(%) XRCC1基因型 6.16 0.053 3.98 0.137   AA 2 7.41 7 25.00 3 9.38 6 26.09   GA 9 33.33 13 46.43 12 37.50 10 43.48   GG 16 59.26 8 28.57 17 53.12 7 30.43 放疗前T分期(%) 10.15 0.038 15.47 0.004   T1 0 0 3 10.71 0 0 3 13.04   T2 3 11.11 0 0 3 9.38 0 0   T3 9 33.33 15 53.57 9 28.12 15 65.22   T4A 5 18.52 6 21.43 9 28.12 2 8.70   T4B 10 37.04 4 14.29 11 34.38 3 13.04 放疗前N分期 4.30 0.051 5.77 0.016   N0 6 22.22 1 3.57 7 21.88 0 0   N+ 21 77.78 27 96.43 25 78.12 23 100.00 治疗后ypT分期 24.43 < 0.001 24.77 < 0.001   ypT0 0 0 8 28.57 0 0 8 34.78   ypT1 0 0 0 0 0 0 0 0   ypT2 3 11.11 10 35.71 5 15.62 8 34.78   ypT3 9 33.33 9 32.14 11 34.38 7 30.43   ypT4A 5 18.52 1 3.57 6 18.75 0 0   ypT4B 10 37.04 0 0 10 31.25 0 0 治疗后ypN分期 33.92 < 0.001 48.61 < 0.001   ypN0 6 22.22 21 75.00 7 21.88 20 86.96   ypN+ 21 77.78 7 25.00 25 78.12 3 13.04 病理完全缓解 0 0 8 28.57 9.02 0.004 0 0 8 34.78 13.03 < 0.001 未达病理完全缓解 27 100.00 20 71.43 32 100.00 15 65.22 CEA(ng/ml) 14.93±23.17 15.83±30.77 -0.122a 0.904 15.61±24.62 15.09±30.71 0.069a 0.945 NLR 2.75±0.65 2.69±0.61 0.334a 0.739 2.77±0.63 2.65±0.63 0.697a 0.489 注：a为t值

表 1 55例局部进展期直肠癌患者基线特征比较 Table 1 Comparison of baseline characteristics of 55 patients with locally advanced rectal cancer

2.遗传平衡定律检验：XRCC1基因rs25 487位点检测出3种基因型：AA、GA、GG型。在T分期降期组与未降期组中以及N分期降期组与未降期组中，等位基因型A和等位基因G遗传学分布符合Hardy-Weinberg平衡，表明本研究样本群体具有较好的遗传代表性，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 不同分组中等位基因的Hardy-Weinberg平衡定律检验 Table 2 Genetic equilibrium test of alleles in various groups 组别 例数 G频率(%) AA GA GG χ2值 P值 T未降期组 27 75.93 2 9 16 0.01685 0.89671 T降期组 28 51.79 7 13 8 0.01665 0.89733 N未降期组 32 71.87 3 12 17 0.01524 0.90175 N降期组 23 52.17 6 10 7 0.10338 0.74781 (OR=5.43，P > 0.05)。

表 2 不同分组中等位基因的Hardy-Weinberg平衡定律检验 Table 2 Genetic equilibrium test of alleles in various groups

3. XRCC1 rs25487多态性与新辅助放化疗后降期及病理缓解的关联性：logistic回归分析显示，调整了年龄、性别、放疗前分期、CEA、NLR的混杂因素影响以后，相较于AA基因型患者, GG型患者新辅助放化疗后T降期的发生率更低，差异有统计学意义(OR=0.1，P < 0.05)。相较于AA基因型患者, GG型患者N降期的发生率有降低趋势，但差异无统计学意义(OR=0.25，P>0.05)。而GA型患者无论是T降期还是N降期上均未发现与AA基因型患者有疗效差异。进一步分析发现，相较于AA或GA基因型患者, GG型患者新辅助放化疗后pCR率降低，差异有统计学意义(OR=0.07，P < 0.05)。

4. XRCC1基因-临床特征交互作用对新辅助放化疗疗效的影响：分层分析发现，性别、年龄、治疗前CEA值在新辅助放化疗疗效方面与基因型未见有交互作用。但NLR值与基因型在T降期率上有交互作用。相对于NLR≥2.72的GG基因型患者，NLR＜2.72的AA/GA基因型患者，T降期率升高差异有统计学意义(OR=8.76，P < 0.05)，N降期率也有升高的趋势，但差异无统计学意义

局部进展期直肠癌新辅助放化疗后肿瘤消退程度和降期情况是较为常用的疗效判断指标。肿瘤消退程度只能评估原发灶情况，对于转移淋巴结的消退无法评估。降期效果可能更能普及和反映预后^[12-13]。因此，本研究对于新辅助放化疗疗效的判断主要分析了T分期、N分期降期情况以及病理完全缓解情况。由于并非所有直肠癌患者均能从强化模式的新辅助治疗中获益。因此，积极寻找影响新辅助强化治疗敏感性的相关因素尤为重要。

XRCC1位于第19号染色体，rs25487(Arg399Gln)是常见的突变位点，该位点多态性被报道与甲状腺癌、鼻咽癌、结直肠癌等多种肿瘤易感性相关^[8-10]，然而与直肠癌同步放化疗疗效关系研究甚少。XRCC1编码后的蛋白与DNA聚合酶、DNA连接酶一起参与DNA碱基修复及DNA单链断裂重组修复^[5-6]。放疗通过直接使DNA链断裂或产生自由基损伤DNA，从而杀伤肿瘤细胞，但肿瘤细胞会在照射间隔期对DNA损伤进行修复，修复能力强的肿瘤会影响放疗的疗效。奥沙利铂等铂类药物通过作用于DNA形成烷化物，从而阻断DNA的复制及合成，抑制肿瘤细胞的分裂。既往对奥沙利铂耐药的研究中发现，DNA损伤修复能力增强是主要的耐药机制之一^[14]。XRCC1基因Arg399Gln的多态性被证实会影响DNA的损伤修复能力，除了影响放疗敏感性外，也有研究证实会影响肺非小细胞肺癌、头颈部鳞癌、宫颈癌等肿瘤铂类化疗的疗效^[15-17]。本研究纳入的直肠癌患者术前均接受了盆腔放疗及同步含有奥沙利铂的系统化疗，因此推测XRCC1基因Arg399Gln的多态性与放疗后肿瘤降期情况相关，同时通过基因-临床特征交互作用的分析，对治疗后肿瘤降期情况更有预测作用。本研究结果显示，XRCC1 rs25487的野生型GG基因型相对于纯合突变AA型而言，直肠癌新辅助放化疗后T降期及N降期失败的风险增高；这一结果在排除相关混杂因素之后成立。并且对放化疗后病理反应情况进一步分析发现，XRCC1 rs25487的野生型GG基因型相对于其他基因型，放化疗后pCR率明显降低，这一结果与降期情况的分析是一致的。既往研究发现在接受了放疗的激素抵抗性前列腺癌患者中，XRCC1 rs25487基因GG型总生存明显低于其他基因型，提示GG型与放疗抵抗相关^[18]，本研究结果与其一致。从而使患者对放疗具有更好的反应性。Lamas等^[19]研究发现携带XRCC1 rs25487的GG型的直肠癌患者相对于GA型患者同步放化疗后疗效更好；Formica等^[20]报道XRCC1 rs25487的GA型患者同步放化疗后病理反应率更好，本研究结果与其不一致，可能由于纳入人群的种族及同步化疗方案不同，上述研究纳入的均为欧洲人群，并且同步化疗方案中无奥沙利铂。既往一项Meta分析发现，XRCC1 rs25487多态性与直肠癌放疗后肿瘤退缩情况无明显相关性^[21]。这项Meta分析纳入的人群均为欧洲人群，且放疗时未接受同期奥沙利铂的系统化疗。已有研究报道在肺癌、头颈部鳞癌、宫颈鳞癌中发现XRCC1 rs25 487位点A等位基因与铂类化疗敏感性呈正相关^[16-18]。上述关于XRCC1 rs25487基因型与放化疗疗效关系的研究结论不同可能提示，在预测直肠癌治疗疗效时，种族及治疗模式可能与XRCC1 rs25487基因多态性存在交互作用，因此仍需要纳入更多样本进一步研究。

新辅助放疗后降期情况往往不是某一个独立因素可以决定的。因此，在预测降期方面，XRCC1 rs25487基因多态性与患者的临床特征是否存在交互作用，本研究也进行了探索。既往研究提示，NLR可反映患者的炎症反应与免疫功能的平衡状态，直肠癌放化疗后达pCR患者的比例与NLR显著相关^[8-9]。本研究发现，XRCC1 rs25487基因多态性在预测放化疗后T降期率上与NLR存在交互作用；相较于NLR≥2.72且携带有野生型GG基因型的患者，携带AA或GA型且NLR＜2.72的患者T降期率是其8.76倍。推测XRCC1 rs25487AA/GA型与NLR值有协同作用，NLR值较低(＜2.72)且AA/GA型患者对放化疗较为敏感。但这仍需扩大样本的随机对照试验进一步证实。

总之，在局部晚期直肠癌患者中，XRCC1 rs25487基因多态性与新辅助放化疗疗效存在密切关联，基因型与NLR值存在交互作用，会直接影响到放疗后肿瘤T降期。由于研究的样本量有限，因此在下一阶段，课题组将开展扩大样本的多中心研究，进一步验证该研究结果。

致谢 本研究受贵州省教育厅青年科技人才成长项目(黔教合KY字[2016]151)资助

利益冲突  本研究由署名作者按以下贡献声明独立开展，不涉及各相关方的利益冲突，对研究的独立性和科学性予以保证

作者贡献声明  陈唯唯负责收集资料、整理数据、统计分析和论文撰写；王文玲负责论文选题及论文修改；王刚、李小凯负责放疗计划设计；李国栋负责统计分析；董洪敏负责放疗计划审核