肺癌目前在世界范围内癌症发病率和死亡率中均居首位^[1]，具有发现晚和愈后差的特征^[2]。氡及其子体是继吸烟之后肺癌的第二大致病因素，在非吸烟者中是肺癌的第一大病因^[3]。Leuraud等^[4]通过对欧洲3个铀矿矿工的病例对照研究进行联合分析，拟合出肺癌与氡暴露成线性关系的几何混合模型。如果人体有生物学指标能够随着氡累积作用呈线性改变，则可以为临床因氡及其子体所致肺癌的早期诊断、靶向精准治疗提供依据。

本研究以云南某矿井下工作的矿工作为观察对象，选取与肿瘤发生发展密切相关的细胞周期^[5]以及调控细胞周期G₀/G₁期和S期的CDKs、Cyclins作为观察指标，观察随着氡累积暴露量的增加，外周血淋巴细胞周期及周期蛋白的表达情况的变化，寻找机体对氡累积暴露作用敏感的靶点。

一、资料与方法

1.研究对象：采用单纯随机抽样，选取云南省个旧市某矿井下矿工163人作为研究对象。按工龄每10年一组划分为4组，包括“0~”组82人、“10~”组35人、“20~”组25人以及“30~40”组21人。纳入标准为从事矿下工作的矿工、男性、无急性感染性疾病、恶性肿瘤、无严重家族遗传病史。本研究通过了伦理学审查，全部研究对象均签署了知情同意书。

2.调查问卷：使用自行设计的调查问卷，由当地经过培训的调查员对矿工进行面对面调查，调查内容包括调查对象的一般情况、从业情况、生活习惯、健康情况以及对氡的认知情况。调查结束后自查问卷。

3.主要仪器和试剂：LIH型氡探测器为中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所自行研制，CR-39固体径迹材料(日本FUKUVI公司)。FACS Aria流式细胞仪为美国BD公司产品，Milli-Q纯水仪和超纯水净化系统为美国Millipore公司。4%多聚甲醛溶液购自北京索莱宝公司，淋巴细胞分离液购自美国GE公司，FxCycle PI/RNase染液购自美国Life公司，破膜固定液购自美国BD公司，CDK2、CDK4(PE Conjugate)抗体购自美国CST公司，CDK6(Alexa Fluor 488 Conjugate)抗体、Cyclin A2、Cyclin D1、Cyclin E1(Alexa Fluor 647 Conjugate)抗体购自美国Abcam公司。

4.氡的测量及暴露累积剂量估算：空气中氡的测量采用GB/T 14582-93环境空气中氡的标准测量方法^[6]。氡暴露剂量估算公式为：

$ {H_{{\rm{Rn}}}} = {C_{{\rm{Rn,a}}}} \times (DC{F_{{\rm{Rn}}}} + F \cdot DC{F_{{\rm{RnD}}}}) \times {t^{[7]}} $

(1)

式中，C_{Rn, a}为氡浓度年平均值，Bq ·m^-3；DCF_Rn为氡的剂量转换因子，0.17×10^-6 mSv ·Bq^-1 ·h^-1 ·m^-3；DCF_RnD为氡子体剂量转换因子，9×10^-6mSv ·Bq^-1 ·h^-1 ·m^-3；t为全年工作时间，h；F为氡子体平衡因子，取0.4。

5.吸烟量：用吸烟指数表示。吸烟指数(包/日×年，PYS)=每天吸烟包数×吸烟年数。

6.外周静脉血采集：采用EDTA抗凝真空采血管采集肘静脉血。采集时间为每日上午9 :00—10 :00，采集量为5 ml。同时由调查员完成调查问卷并记录采血时间和编号。采集到的样本颠倒混匀5次，立刻放入冷藏箱4℃保存，为避免样本溶血干扰测定结果，运输途中始终保持低温并避免剧烈晃动。

7.外周血淋巴细胞分离：全血静置2 h，离心半径147 mm，1 500 r/min，4℃离心10 min，取下层细胞部分用于分离淋巴细胞。取15 ml离心管加入5 ml淋巴细胞分离液；向分离血浆后的下层部分按照1:1的比例，加入磷酸盐缓冲液(PBS)缓冲液，稀释混匀；将稀释后的血液样品用吸管加于淋巴细胞分离液液面上，3 000 r/min，4℃离心20 min；取第2层环状乳白色淋巴细胞层，注入预先加好5 ml PBS的新的离心管中, 充分混匀后, 1 500 r/min，室温离心10 min，弃上清，留沉淀。用PBS洗涤细胞2次，1 500 r/min，室温离心5 min，弃上清，留细胞沉淀备用。

8.细胞周期检定：70%冰乙醇固定的细胞移入离心管，2 ml PBS缓冲液洗涤细胞2次(离心半径147 mm，1 500 r/min，室温离心5 min)，留细胞沉淀；加入500 μl FxCyclePI/RNAse染液重悬细胞，并用尼龙网过滤后转移到新的流式管，室温避光孵育30 min。流式细胞仪检测细胞周期各时相所占比例情况。

9.细胞周期蛋白表达量的测定：4%多聚甲醛固定好的细胞移入离心管中，2 ml PBS缓冲液，离心，弃上清；重复2次，加入500 μl Fixation/Permeabization重悬细胞，室温避光20 min；振荡，离心，弃上清；加入1 ml Perm/wash buffer重悬细胞，室温避光10 min；振荡，离心，弃上清，分别加入抗体CDK2、CDK4、CDk6、Cyclin A2、Cyclin D1、Cyclin E1各0.35 μl，4℃避光孵育30 min；1 ml Perm/wash buffer洗涤，离心，弃上清，重复2次；150 μl Perm/wash buffer，过滤；流式细胞仪检测细胞周期调控蛋白表达量。本实验离心半径147 mm，1 500 r/min，4℃离心5 min。

10.统计学处理：使用SPSS软件分析数据，计量资料用x±s表示。对计量资料进行正态性检验，采用单因素方差分析比较高氡矿不同工龄矿工外周血淋巴细胞细胞周期各时相及细胞周期相关调控蛋白变化，组间两两比较采用LSD。多因素回归分析各周期调控蛋白的表达与氡累积剂量、年龄、BMI、吸烟量之间的关系。P＜0.05为差异有统计学意义。

二、结果

1.矿工的基本资料及累积氡暴露量：经测量，在工作场所氡的平均浓度为(4 668.86±4 183.44)Bq ·m^-3，根据内照射剂量估算公式计算矿工的年受照剂量，再分别乘以工龄，计算个人的累积氡暴露量(mSv)。采用单因素方差分析，发现年龄、工龄、吸烟指数、氡累积暴露剂量随工龄增加呈明显上升趋势，差异有统计学意义(F=153.298、790.406、13.212、779.574，P＜0.05)。

2.矿工外周血淋巴细胞周期表达情况分析：随着工龄增加，氡累积暴露量增加。各组间外周血淋巴细胞周期各时相所占比例随氡累积暴露量波动，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

3.相关细胞周期调控蛋白的表达：采用单因素方差分析，比较各相关周期调控蛋白在不同组间表达的差异。CDK2、CDK4的相对表达量在4组间呈现逐渐上升的趋势，其中与“0~”组比较，CDK2、CDK4在“20~”组、“30~40”组的表达有升高趋势，差异具有统计学意义(P＜0.05)。尚未发现Cyclin D1、Cyclin E1、Cyclin A2、CDK6表达量与氡累积暴露量变化之间的关系有统计学意义。

4.矿工外周血淋巴细胞周期蛋白表达相关因素多重线性回归分析：将变量氡暴露累积量、年龄、BMI、吸烟量引入多重线性回归方程，采用逐步法回归分析，结果见表。CDK2、CDK4表达与氡累积暴露呈正相关(P＜0.05)；CyclinD1、CDK6、CyclinA2、CyclinE1随氡累积剂量增加有变化，但差异无统计学意义(P＞0.05)。

三、讨论

氡及子体容易在密闭或狭窄空间累积，此次调查的矿井工作环境氡浓度较高，超过GBZ/T 233-2010锡矿山工作场所放射卫生防护标准^[8]中井下工作场所空气中氡浓度管理目标值为1 000 Bq/m³的规定，这与之前国内学者的研究结果相符。徐辉等^[9]、李晓颖等^[10]通过对我国非铀矿山放射性职业危害调查发现非铀矿山涉及的危害因素主要是氡暴露。张奇等^[11]调查湖南某铅锌金矿井下放射性水平，发现井下工作场所氡浓度较高，存在放射性危害，应采取相应防护措施。崔宏星等^[12]对矿山的调查研究表明，非铀矿山工作场所中氡的浓度随季节变化而有所变化，呈现冬低夏高的趋势。本研究使用的氡浓度为11—12月的氡累积测量的数据，实际年平均氡浓度可能高于本次测量的结果，矿工实际受照剂量可能会比目前计算结果还要高，今后可以增加累积测量时间，以便更准确地估算剂量。

本研究使用的样本均为男性，矿工吸烟率比较高。Yao等^[13]的研究表明，吸烟和氡暴露对肺癌的作用介于相加和相乘之间。通过有意识地戒烟、降低工作环境中的氡浓度，可以大幅度降低氡暴露水平，更好地预防矿工肺癌的发生。另外在调查中发现，矿工的防护用具配备比较齐全，但是在现场工作时，真正使用情况存在很多问题。傅颖华等^[14-15]通过对非铀矿山工人对氡致健康危害的认知调查发现，矿工受教育程度较低，危险认知水平较低。本次调查中发现，矿工工作时口罩佩戴情况不理想。故加强对矿工生产安全、个人防护的宣传十分必要。

前期本课题组高延晓等^[16]在河北平山氡温泉周围居民与对照组相比外周血淋巴细胞周期G₀/G₁期减少，S期增加，差异有统计学意义。Chauhan等^[17]的研究也表明α粒子照射抑制DNA合成以及后继的有丝分裂，导致细胞周期阻滞，而氡及其子体被人体吸入后，会在支气管及肺泡表面黏附释放高传能线密度(LET)的α粒子对肺组织产生持续作用。本研究中的研究对象均为尚未患病的男性矿工，且样本量有限，矿工外周血淋巴细胞的细胞周期没有明显改变，但是不能说明氡及子体对人体没有作用，本研究进行了更深一步的研究。

周期依赖蛋白的蛋白激酶CDKs通过磷酸化靶蛋白Cyclins改变其活性，触发细胞周期运行。G₀/G₁期CDK2与Cyclin E结合，CDK4和CDK6与Cyclin D结合；S期与G₂期时CDK2与Cyclin A结合。Cyclin E含量高峰在G₁/S交界点，CDK2-Cyclin E促使细胞周期从G₁向S期进行^[18-19]。本研究通过多重线性回归分析表明，所选取的细胞周期相关调控蛋白中CDK2、CDK4随着矿工氡累积暴露量的增加呈现上升趋势。与高延晓等^[16]通过对外周血淋巴细胞的细胞周期及相关调控蛋白检测，发现与对照组相比CDK2、CDK4、Cyclin D1在氡温泉组表达上调的结果一致。另外，高刚等^[20]用Western blot方法检测60 WLM氡染毒后1个月处理的BALB/c小鼠肺组织，发现CDK6的表达与其对照组相比明显上调。本研究中，与“0~”组比较，另外3组的CDK6值均稍高，但是差异尚未具有统计学意义，这可能与样本量及对照的选取有关。

目前关于肿瘤研究的文献显示，CDKs、Cyclins在一些恶性肿瘤往往高达。Kumari等^[21]发现在胃癌早期Cyclin D1和Cyclin E1常常过表达。Geng等^[22]认为肝癌中Cyclin E过度表达，靶向Cyclin E的药物在肝癌治疗中是有效的，因为它们可以抑制肿瘤细胞的增殖，同时保护正常组织。Tadesse等^[23]研究选择性抑制CDK2在肿瘤治疗中具有广阔前景。本研究观察氡持续作用后人体外周血淋巴细胞周期及周期蛋白的改变，今后可以选取同一地区地面工作的矿工作为研究对象中的对照，并扩大样本量，进行更全面的分析，进一步探讨调控目前发现有改变蛋白的调控因子，例如miRNAs的改变，研究氡及子体作用人体并导致疾病的机制，从而寻找氡暴露与人体作用关系最密切的靶点，为氡及子体导致肺癌的早期诊断和临床靶向治疗提供依据。

利益冲突 本研究未因进行该研究而接受任何不正当的职务或财务利益，在此对研究的独立性和科学性予以保证
作者贡献声明 孙璐设计研究方案，并负责实验的具体操作、数据整理及分析、论文撰写；潘艳、王小春参与文稿的修改与指导；高刚、吴丽娜、朴春南参与实验过程指导；阮健磊参与现场采样及流行病学调查；刘建香全程指导