2019, Vol. 39
扩散峰度成像(DKI)作为一项新的磁共振功能成像技术，分析水分子扩散行为时是依据多项式模型的，可用于量化真实水分子扩散与理想状态下高斯分布扩散位移偏离的大小，以表征水分子扩散受限程度和扩散的不均质性，反映组织微观结构的变化[1]。目前DKI已广泛应用于多种肿瘤疾病的研究及临床应用[2-5]。本研究从动物模型层面探讨DKI在预测食管癌放疗敏感性的应用价值及相关机制，为该技术的临床应用提供理论依据。
材料与方法1.实验细胞及动物：人食管癌Eca-109瘤株，由河北医科大学第四医院科研中心提供。40只免疫功能缺陷型BALB/c裸鼠，雄性，4~6周龄，体重18~20 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司(合格证号：1605200)，饲养于河北医科大学第四医院动物实验中心，无特定病原体环境，光照明暗12 h交替；自由饮水及取食；相对湿度为50%±10%，温度为(23±2)℃。
2.细胞培养及移植瘤模型的建立：将人食管癌Eca-109肿瘤细胞通过细胞贴壁培养(RPMI 1640培养液)的方法扩增传代，用胰消化酶法扩增收集细胞悬液，配成浓度为1×107/ml的细胞悬液，选择裸鼠的右前肢背部作为接种部位，每只裸鼠接种细胞数量为5×106/0.2 ml。2周后即可形成短径约10 mm的皮下移植瘤。
3.实验分组：将建模成功的40只荷瘤裸鼠按照随机数表法分为两组：实验组24只，接受6 MV X射线15 Gy单次剂量照射；对照组16只，不接受任何处理。两组荷瘤裸鼠均于照前1 d及照后行MRI扫描。观察时间1个月，隔日1次，共16个时间点。根据上述实验结果选择7个关键时间点，分为7组，每组12只, 根据随机数表法分为实验组6只，对照组6只。7组分别在照前1 d和照后1、3、5、7、17、29 d行MRI扫描。完成MRI扫描后立即处死荷瘤裸鼠。
4.照射方式：使用瑞典医科达公司直线加速器(Synergy 2349)，6 MV X射线，2 cm×2 cm射野，源皮距100 cm，剂量率为300 cGy/min，单次剂量15 Gy，被覆1 cm的组织补偿膜。所有实验组的荷瘤裸鼠均取俯卧位固定，在清醒状态下进行照射。
5. MRI检查方法：采用德国西门子公司3.0T磁共振扫描仪，扫描序列包括T1WI、T2WI及DWI序列。DWI采用高清弥散序列，b值分别选取0、600、800、1 000、2 000、2 500、3 000 s/mm2。每次扫描前用2%戊巴比妥对荷瘤裸鼠进行腹腔注射麻醉(0.05 ml/只)，并将荷瘤裸鼠包裹于鲜猪肉内放入线圈中。
6.移植瘤体积的测量：用电子游标卡尺来测量移植瘤的最大直径(a)及与之相垂直的短径(b)，根据公式V=ab2/2计算移植瘤体积大小，Vx为照射后x天移植瘤的体积。计算每只裸鼠移植瘤照射前后体积的变化，即ΔVx=(Vx-V0)/V0×100%。
7.移植瘤细胞密度和坏死比例检测：将荷人食管癌癌裸鼠移植瘤病理切片经苏木精-伊红(HE)染色。细胞密度：每张组织切片随机选取5个完整且不重叠的高倍镜视野(×400)，使用Image J软件将病理照片转化成黑白图片，黑色部分为细胞核。移植瘤组织细胞密度=细胞核面积/照片总面积×100%，最后计算5个视野的平均值。坏死比例：每张组织切片随机选取1~3个完整且不重叠的低倍镜视野(×40)，用Image J软件计算，肿瘤坏死比例=坏死面积/肿瘤面积×100%。
8.图像分析：图像的分析采用Body diffusion toolbox 1.2.1进行。设定阈值为7，信号强度低于7的默认为是噪声，不参与参数的计算，高斯核设置为1。选取肿瘤最大层面进行测量，避开肿瘤中心坏死区域，随机在肿瘤组织内选取5个感兴趣区(ROI)，测量肿瘤组织的表观弥散系数(ADC)、平均扩散峰度(MK)、平均扩散系数(MD)，并取平均值为最终测量值。
9.统计学处理：采用SPSS 13.0软件包进行统计学分析。定量资料的正态性检验采用Kolmogorov-Smirnov(K-S)检验，数据符合正态分布，用x±s表示。对不同时间点的肿瘤体积、ADK、MK、MD进行两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果1.照射前后移植瘤体积的比较：实验组裸鼠移植瘤在接受照射后明显出现生长延迟现象，对照组移植瘤体积在照射后第5天即达到体积倍增，而实验组则为第17天。照射前两组移植瘤体积V0差异无统计学意义(P>0.05)，第1、3天对照组移植瘤体积与实验组大致相当，第5天后实验组移植瘤体积增长变缓，对照组体积稍大于实验组，但差异仍无统计学意义(P>0.05)，在第7天有短暂的下降，且从照射后第7天开始实验组体积明显小于对照组(t=3.206~6.149, P＜0.05，表 1)。
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表 1 两组移植瘤照射后不同时间体积比较(cm3，x±s) Table 1 Comparison of the volumes of transplanted tumors between radiotherapy and control groups at different time after radiotherapy (cm3, x±s) |
2.移植瘤照射前后ADC值的比较：实验组在照射后第1天ADC值有所下降，第3天迅速升高，到第7天时升至最高点，后ADC值逐渐下降，至第17天后保持在与照前比较一致的水平。而对照组ADC值在第1天开始逐渐下降，至第7天开始保持在比较低的水平。两组的照射前及照后第1天ADC差异无统计学意义(P>0.05)，从照射后第3天开始实验组ADC值明显高于对照组(t=-11.018~-2.049, P＜0.05，表 2)。
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表 2 两组移植瘤照射后不同时间点ADC值比较(×10-6mm2/s，x±s) Table 2 Comparison of ADC values between experimental and control groups at different time after radiotherapy(×10-6mm2/s, x±s) |
3.移植瘤照射前后MK值的比较：实验组在照射后第1天MK值开始下降，到第9天时降至最低点，后MK值逐渐上升，至第17天后升至疗前水平，后基本保持稳定在较疗前稍高的水平。而对照组MK值在第1天开始逐渐上升，至第17天开始保持在比较高的水平。两组照射前及照后第1天MK差异无统计学意义(P>0.05)，从照射后第3天开始实验组MK值低于对照组(t=2.492~9.323, P＜0.05，表 3)。
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表 3 两组移植瘤照射后不同时间点MK值比较(×10-3，x±s) Table 3 Comparison of MK values between experimental and control groups at different time after radiotherapy(×10-3, x±s) |
4.移植瘤照射前后MD值的比较：MD值的变化趋势与ADC值较为相似。实验组在照射后第1天MD值有小幅度的下降，第3天迅速升高，到第7天时升至峰值，后MD值逐渐下降，至第17天后保持在比较稳定的比照前稍高的水平。而对照组MD值在第1天开始逐渐下降，至第7天降至最低点，后有所上升，保持在较疗前稍低的水平。两组照射前及照后第1天MD差异无统计学意义(P>0.05)，从照射后第3天开始实验组MD值高于对照组(t=-6.609~-2.052, P＜0.05，表 4)。
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表 4 两组移植瘤照射后不同时间点MD值比较(×10-6mm2/s，x±s) Table 4 Comparison of MD values between experimental and control groups at different time after radiotherapy(×10-6mm2/s, x±s) |
5. ROC曲线分析：利用ROC曲线找到预测移植瘤体积倍增的最佳界值，从肿瘤体积倍增20%至300%，以20%的幅度逐步递增，找到能够使体积倍增120%的截点为第7、9天，绘制ADC、MK、MD的ROC曲线，得到第7天曲线下面积为0.946、0.806、0.962，说明照后第7天ADC、MD都具有较高的诊断效能，预测体积倍增120%的灵敏度和特异度均较高。第9天曲线下面积分别为0.914、0.825、0.865，照后第9天ADC具有较高的诊断效能，预测体积倍增120%的灵敏度和特异度较高。与照后第7天ADC相比，MD具有与前者相同的敏感性与特异性(表 5)。
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表 5 ROC曲线分析 Table 5 ROC curve analysis |
6.移植瘤细胞密度的比较：结果见表 6。实验组与对照组在照射后第3天开始出现有统计学意义的差异，对照组细胞密度高于实验组(t=-8.387~-2.239，P＜0.05)。
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表 6 两组移植瘤照射后不同时间细胞密度的比较 Table 6 Comparison of cell density of transplanted tumor between experimental and control groups at different time after radiotherapy(%, x±s) |
7.移植瘤坏死比例的比较：结果见表 7。从照射后第3天开始实验组的坏死比例高于对照组(t=2.980~17.430, P＜0.05)。
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表 7 两组移植瘤照射后不同时间坏死比例的比较(%，x±s) Table 7 Comparison of tumor necrosis ratio between experimental and control groups at different time after radiotherapy(%, x±s) |
讨论
磁共振弥散加权成像(DWI)以表观弥散系数(ADC)作为定量参数，在评估近期疗效方面已显示出优势，但是DWI是以高斯分布为理论基础的，随着b值的增高，组织内水分子的扩散会偏离高斯分布[6]，而扩散峰度成像(DKI)是基于非高斯分布模型的，可提供更多、更接近真实组织微观结构的信息。本研究从动物模型层面选取了具代表性的MK值、MD值进行研究，寻找新的评估食管癌放疗疗效的敏感指标，为该技术的临床应用提供理论依据。
本研究结果发现实验组在照射后最初的几天体积没有减小反而继续增大，从照射后第5天开始实验组的增长幅度开始变缓，至第7天有轻度的下降，一方面由于照射后引起的组织水肿造成的体积增加，另一方面则是可能由于单次剂量照射以后的继发效应，细胞在死亡之前可以进行数次有丝分裂，即代偿性的细胞增殖。随后由于肿瘤细胞代偿增殖效应逐渐消失，而照射激活了凋亡信号传导通路，肿瘤细胞出现凋亡[7]，这段时间由照射造成的细胞溶解、肿瘤组织坏死、细胞碎片的清除会从肿瘤大体形态上表现为增长变缓甚至缩小，但是15 Gy照射不足以杀死全部肿瘤细胞，之后由于治疗期间存活的克隆源性细胞的再群体化，导致实验组移植瘤体积继续逐渐增大。而照射后第1天实验组移植瘤的ADC值出现下降，可能与早期高能X射线损伤作用使细胞膜的通透性发生改变，造成了肿瘤细胞水肿，组织细胞间隙较前明显变小，使得水分子弥散能力下降；照射导致的微循环障碍也可以引起ADC值的降低；照射后纤维组织修复也可能是造成ADC值降低的原因之一。随着照射引起的肿瘤组织损伤，从微观功能代谢方面则反映为细胞密度降低，水分子运动受限现象较治疗前相对解除，ADC值逐渐升高并在肿瘤体积下降时(第7天)达到最高值。随着实验组移植瘤的增殖，体积逐渐增大，ADC值逐渐下降。实验组ADC值从第3天开始高于对照组，ADC值先于肿瘤形态学变化发生改变。
MD值是扩散梯度场上体素内水分子扩散程度的平均值，反映整体的扩散情况，受细胞密度、细胞外间隙含水量、肿瘤对组织造成的细胞结构改变等多种因素的影响[8]。有研究表明，MD值的大小与肿瘤细胞密度呈负相关[9]。在本研究中MD值的变化趋势与ADC值较为相似。MK是衡量组织结构复杂程度的指标[10]，成像体素组织结构越复杂，水分子运动受阻越显著，水分子偏离高斯分布的程度就越大，平均峰度的数值就越大。本研究中，MK值的变化趋势与ADC值、MD值是相反的，从原理上看，ADC值、MD值、MK值均与水分子扩散有关，而水分子扩散受限程度与组织结构复杂程度有关，肿瘤组织与正常组织的差异性及细胞核形态的多样性越明显，间质血管越丰富，细胞密度越大，细胞外间隙越小，水分子扩散受限的程度越明显，结构越复杂，水分子扩散越偏离高斯分布，偏移率越大，所以ADC值越小，MD值越小，而MK值越大。本研究的结果与理论一致，照射后移植瘤生长情况和ADC值、MD值、MK值呈动态变化对应关系，且3个指标均先于肿瘤大体形态学发生改变前即出现了与肿瘤退缩有关的变化。本研究以ADC值为参照，提示照后第7天MD值具有较高的诊断效能，DKI具有早期预测食管癌放疗敏感性的价值。
本研究在第2部分实验中做相应时间点的病理对照。从趋势上看实验组照射后初期移植瘤组织坏死比例增加、细胞密度减少和增殖能力下降，这与照射导致的细胞溶解、组织坏死有关，而照射后期由于肿瘤细胞的再增殖、再群体化，细胞密度又有所增加。对照组细胞密度呈逐渐升高的趋势，在第5天最高，后有所降低，坏死比例则呈逐渐下降趋势，第7天后趋于稳定，可能与初期肿瘤细胞快速增殖，后期随着肿瘤体积不断增大，乏氧增加，增殖变缓有关。两组比较的结果均在照射后第3天开始出现有统计学意义的差异，实验组细胞密度低于对照组，坏死比例高于对照组。
综上所述，单次大剂量放射治疗可以抑制荷瘤裸鼠肿瘤生长，照射后移植瘤的ADC、MK、MD值于肿瘤大体形态学发生改变前即出现了与肿瘤退缩有关的变化，病理对照的结果表明，细胞密度及坏死比例的变化与ADC、MK、MD值的变化是基本吻合的。本研究的优势在于在实验中选取的时间点很多，可以清楚地看到各项指标的变化过程，但由于部分图像出现运动伪影，以及裸鼠与包裹猪肉间贴合较差时产生的磁敏感伪影，在一定程度上可能影响了数据的精确性；此外，在最佳b值的选择上还需要进一步的完善。DKI技术的稳定性和可靠性仍然需要大量的基础研究及临床研究进一步证实。
利益冲突 无作者贡献声明 张安度提出研究思路，设计研究方案，撰写论文；王燕飞、李扬、刘辉负责实验操作；时高峰指导实验、经费支持、修改论文；韩春、张钧指导实验、审阅论文；苏晓华、张难负责采集数据
| [1] |
Filli L, Wurnig M, Nanz D, et al. Whole-body diffusion kurtosis imaging:initial experience on non-Gaussian diffusion in various organs[J]. Invest Radiol, 2014, 49(12): 773-778. DOI:10.1097/RLI.0000000000000082 |
| [2] |
Goshima S, Kanematsu M, Noda Y, et al. Diffusion kurtosis imaging to assess response to treatment in hypervascular hepatocellular carcinoma[J]. AJR Am J Roentgenol, 2015, 204(5): W543-549. DOI:10.2214/AJR.14.13235 |
| [3] |
成芳, 所世腾, 康记文, 等. MR扩散峰度成像在浸润性乳腺癌分级及与预后因素的相关性应用研究[J]. 磁共振成像, 2017, 8(3): 164-169. Cheng F, Suo ST, Kang JW, et al. The study on the application value of DKI in the classification of invasive breast carcinoma and its correlation with prognostic factors[J]. Chin J Magn Reson Imaging, 2017, 8(3): 164-169. DOI:10.12015/issn.1674-8034.2017.03.002 |
| [4] |
Kjølby BF, Khan AR, Chuhutin A, et al. Fast diffusion kurtosis imaging of fibrotic mouse kidneys[J]. NMR Biomed, 2016, 29(12): 1709-1719. DOI:10.1002/nbm.3623 |
| [5] |
Wang D, Li YH, Fu J, et al. Diffusion kurtosis imaging study on temporal lobe after nasopharyngeal carcinoma radiotherapy[J]. Brain Res, 2016, 1648(Pt A): 387-393. DOI:10.1016/j.brainres.2016.07.041 |
| [6] |
王睿, 任静. 磁共振扩散峰度成像原理及其应用研究进展[J]. 西北国防医学杂志, 2017, 38(3): 207-210. Wang R, Ren J. Research progress on the principle and application of magnetic resonance diffusion kurtosis imaging[J]. Med J Natl Defending Forces Northwest Chin, 2017, 38(3): 207-210. DOI:10.16021/j.cnki.1007-8622.2017.03.020 |
| [7] |
Zhang HM, Wu YH, Gan Q, et al. Diagnostic utility of diffusion-weighted magnetic resonance imaging in differentiating small solid renal tumors (≤ 4 cm) at 3.0T magnetic resonance imaging[J]. Chin Med J (Engl), 2015, 128(11): 1444-1449. DOI:10.4103/0366-6999.157648 |
| [8] |
魏弢, 尹化斌, 孟凡华, 等. 瘤周水肿区DTI在高级别胶质瘤与转移瘤鉴别诊断中的应用[J]. 医学影像学杂志, 2015, 25(10): 1713-1716. Wei T, Yin HB, Meng FH, et al. Utility of peritumoral DTI in differentialting high-grade gliomas and cerebral metastases[J]. J Med Imaging (Bellingham), 2015, 25(10): 1713-1716. |
| [9] |
Kinoshita M, Hashimoto N, Goto T, et al. Fractional anisotropy and tumor cell density of the tumor core show positive correlation in diffusion tensor magnetic resonance imaging of malignant brain tumors[J]. Neuroimage, 2008, 43(1): 29-35. DOI:10.1016/j.neuroimage.2008.06.041 |
| [10] |
Hui ES, Cheung MM, Qi L, et al. Advanced MR diffusion characterization of neural tissue using directional diffusion kurtosis analysis[J]. Conf Proc IEEE Eng Med Biol Soc, 2008, 2008: 3941-3944. DOI:10.1109/IEMBS.2008.4650072 |