目前,放射性物质和放射技术已经广泛用于国防、医疗、工业等各个行业。辐射所带来的不良反应不可忽视,而急性高剂量的核辐射暴露时有发生,危害公共安全,同时也具有潜在的灾难性后果[1]。急性高剂量核辐射暴露可能来自多种潜在的灾害情景,如核反应堆熔毁或核弹爆炸等[2]。癌症放射治疗对正常组织的不良反应也是进一步应用更高剂量辐射的障碍[3]。目前的核辐射防护剂主要由于其功能效果不佳和不良反应进一步限制了其在核辐射防护的临床应用[4]。辐射防护剂,也称为预防剂,必须在暴露于辐射之前施用,通过在初始放射性化学事件发生之前起效,来防止核辐射损伤[3-5]。
近年来,一些研究证明Toll信号通路在辐射损伤和防护方面具有重要作用。有研究发现[6],在致死的全身照射之前单次注射CBLB502用于保护小鼠免受胃肠道和造血急性放射综合征的影响,并且使得小鼠存活率大幅提高。同时,其他学者发现TLR2的缺失会导致小鼠在辐射中更快的死亡[7]。而TLR4则在体内可以提供内源性辐射防护以及抑制内毒素血症的发生发展[8]。
一、Toll样受体的生理作用Toll样受体(TLR)作为许多哺乳动物先天的免疫元件,同时也是生物体在进化的过程中存在的非常保守的一类模式受体,在有机体自我应对微生物等感染具有很重要的意义。TLRs通过识别高度保守的结构基序来激活下游的细胞因子,完成其抗感染等特性。这类结构序包括病原体相关分子模式(PAMP)或损伤相关分子模式(DAMP)[9-10]。相应配体通过PAMP和DAMP刺激TLR,启动下游的信号级联放大反应,从而激活一系列转录因子,如NF-κB。TLR信号传导导致多种细胞反应,包括产生干扰素、炎性细胞因子和指导适应性免疫应答的效应细胞因子的激活和级联反应。可利用这些TLR相关途径的激活来研究各种TLR配体在改变辐射响应中的能力。最近,TLR已被证明表现出在小鼠以及猴中的抗辐射效果[11]。该研究证明了TLR中的几个激动剂已具有针对电离辐射的致死作用的保护作用。然而,不同的TLR识别病原体的特定组分,并启动不同的下游信号传导途径,其防护效应也随之不同。同时TLRs之间的作用相似,而不同器官的TLRs的分布和丰度各不相同。因此,多个TLR的共激活可能比单个TLR激动剂发挥更强和更广泛的辐射保护作用,也是值得研究的方向。研究显示,TLRs途径主要是通过触发髓样分化因子88(MyD88)和TRIF依赖的信号通路来发挥其生理作用[12]。TLR与其配体结合后随即磷酸化其下游的介质IKK-β和丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs),包括ERK1/2、c-jun终止激酶(JNK)1/2和p38,并得以活化核因子NF\|κB和蛋白(AP)-1[10]。
二、TLR2及其配体在抗辐射免疫损伤中的积极作用TLR2具有明显的辐射防护效应,相应配体也是研究的热点方向。Shakhov等[13]研究指出,TLR2配体细菌脂蛋白(BLP)可通过激活含有Toll样受体2(TLR2)的异二聚体受体复合物在哺乳动物中诱导先天免疫应答。
TLR2信号传导的激活导致抗凋亡因子、抗氧化剂和NF-κB依赖性的上调并影响下游的反应,所有这些都与辐射防护相关[14]。小鼠致死性全身照射(TBI)后,在照射前48 h和照射后24 h之间给予模拟的天然存在的支原体BLP结构的合成脂肽(sLP)后,可以明显提高小鼠存活率。sLP的防护有效性主要表现在减轻核辐射导致的造血损伤。比如在骨髓和脾脏中血小板回落受到遏制,血细胞和粒细胞也相对应地较大幅度增加。另外,在Shakhov等[13]的实验中,sLP并没有提高TLR2敲除小鼠的存活率,即sLP介导的辐射防护效应需要借助TLR2通路。同时,sLP本身在造血中就具有许多有益的作用,注射后会强烈诱导多种细胞因子的分泌,包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)角质形成细胞化学引诱物(KC)和白细胞介素6(IL-6)等。而sLP诱导的细胞因子,特别是G-CSF可能是sLP的辐射防护活性的介质之一。
三、TLR4及其配体在抗辐射免疫损伤中的积极作用TLR4在TLR家族中和TLR2一样,其配体以及相关机制的研究也是目前热门方向之一[15]。近期Xu等[16]的研究显示,热灭活的鼠伤寒沙门氏菌(HKST)具有强大的辐射防护效应,在加入HKST后,辐射损伤细胞的凋亡明显受到了抑制,并且增加了这些细胞的存活同时也减轻了DNA损伤。HKST还延长了动物的存活期,并保护了放射敏感组织免受辐射损伤,如骨髓、脾脏和睾丸。HKST处理也逆转了CD4+和CD8+细胞的减少。通过使用TLR2和TLR4敲除小鼠,现HKST的大多数辐射防护效应在TLR4敲除小鼠中被消除。但是在TLR5敲除小鼠中并没有发现这样的作用。因而证明了HKST有效保护细胞和放射敏感组织免受TLR4偏向机制中的辐射损伤,表明HKST是一种具有低毒性的潜在辐射防护剂。
由于HKST同时具有TLR4和TLR2活性,因此,TLR2或TLR4对HKST的辐射防护作用的贡献仍然需要研究探讨[17]。使用TLR2和TLR4的敲除小鼠可以用来进一步探索其潜在的机制。数据表明,HKST的辐射防护作用机制更侧重于TLR4通路的激活[16],因为在TLR4敲除的小鼠中防护效果消失。虽然HKST的辐射防护作用侧重于TLR4通路的激活,但是在TLR2基因敲除小鼠中的辐射防护作用却没有对照的明显,表明HKST也同时激活了TLR2通路与TLR4通路用于细胞的核辐射防护。
由于辐射可以破坏DNA和蛋白质的结构和功能,这会损害代谢功能并导致细胞凋亡,衰老和坏死。DNA是辐射最关键的靶标,细胞暴露于辐射照射中后将会导致DNA双链断裂,严重时可导致细胞的坏死[18]。在此研究中,通过分析HUVEC细胞中的γ-H2AX动力学特性,发现HKST可以促进核辐射后DNA损伤的修复。深入研究其机制显示,HKST在通过抑制IL-6和TNF-α水平升高的同时,还增加了MyD88的表达,以及p38和JNK的磷酸化以起到抗炎作用。同时,HKST处理诱导NF-kB p65亚基的易位,这解释了TLR的辐射保护作用。
另外,TLR4的体内配体脂多糖(LPS)也显示出明显的辐射防护能力,但其不良反应限制了临床应用。因此,需要具有低毒性的替代TLR4激动剂。Guo等[19]发现的单磷酰脂质A(MPLA)使人耳目一新。MPLA通过天然二磷酰脂质A的水解产生,保留由TLR4识别的LPS组分,并以TLR4-MyD88依赖性方式有效地保护培养的细胞和小鼠。与天然脂质A相比,MPLA的这种结构变化使全身毒性降低>99%,并且MPLA的毒性是LPS的万分之一,证明其作为新型TLR4防护剂的优势。
四、TLR5及其配体在抗辐射免疫损伤中的积极作用TLR5较晚于TLR2/4的发现,但同样也具有辐射防护效应。Zhang等[12]的研究发现其特异性配体细菌鞭毛蛋白具备相应的特点。它通过TLR5识别后激活经典NF\|κB和NLRC4介导的基因表达,使得白细胞介素1β(IL-1β)和IL-18水平的提高。TLR5主要表达于上皮细胞、黏膜CD11c +吞噬细胞和肝细胞的表面,使其活化能够提供针对一系列挑战的保护,包括感染、有毒化学物质和γ射线[20]。然而,TLR5并不在表达有TLR4的许多先天免疫细胞上表达。这就解释了为什么鞭毛蛋白不引起全身性炎症反应(肿瘤坏死因子α等的大量分泌)或其相关的不良反应事件的发生。另一方面,鞭毛蛋白具有对免疫细胞增殖或动员的效用。此外,鞭毛蛋白处理的小鼠分离的骨髓前体细胞具有比未处理的骨髓前体细胞在核辐射环境中更高的生存能力。这表明鞭毛蛋白可以通过影响骨髓造血前体细胞来发挥辐射防护效应。
五、TLR9及其配体潜在的辐射防护作用Toll样受体9(TLR9)与其他亚型一样,在先天免疫中扮演着举足轻重的作用[21]。它的表达主要是在各种免疫或非免疫细胞的溶酶体中进行[22]。TLR9在感知高度保守的未甲基化CpG基序后活化,使得相应的促炎细胞因子和IFN-1的产生并引起下游的反应。在此之外,TLR9还与细胞应激反应有关。Pacini等[5]的研究表明,紫外线会很大程度上激活原代人角质形成细胞中TLR9的表达,并增加细胞的抗辐射效应。而HPV中E6和E7能够干扰这种机制,这是βHPV类型与皮肤癌发生机制之一。因而上调TLR9表达对于皮肤癌的治疗有重要作用,也间接表明TLR9的辐射防护作用,虽然只是在紫外线辐射防护上,但其潜在的防护作用机制更有待于日后的深入研究。
六、TLRs之间的协同辐射防护作用综上,包括TLR2/4/5/9在内的几种TLR在电离辐射防护上发挥着重要作用,由于不同的组织分布和TLR的不同功能,而同时共同激活多个TLR可能产生广泛和更强的辐射保护作用[12-13, 15, 22]。比如已经发现的TLR2/4/5的共激动剂HKST显著抑制辐射诱导的细胞凋亡,同时增加细胞存活和减轻DNA损伤;以及TLR2/4的共激动剂大肠杆菌O111:B4也同样具有比单一激动剂效果强的辐射防护效应[12, 17]。在不同的组织和器官中,TLRs的分布以及丰度也有相应的不同。因此,多个TLR的共激活并非不可能,其作用比单个TLR激动剂发挥更强和更广泛的辐射保护作用。因而研究共激动剂的辐射防护作用,亦或是研制半人工共激动剂,对于辐射防护的作用可能将会更加具有意义。
七、TLRs上调相关机制的研究活性氧参与诱导细胞表面TLR2,TLR4表达的上调。目前已知电离辐射会增加TLR2和TLR4的表达[13],同时在人单核细胞THP1细胞中也增强了TLR2/4对激动剂的反应。因此,Yoshino和Kashiwaker[23]研究了电离辐射是如何增加THP1细胞中TLR2/4的表达。将用或不用药剂如环己酰亚胺和N-乙酰基-L-半胱氨酸(NAC)处理的THP1细胞暴露于射线下,然后分析TLR和丝裂原活化蛋白激酶的表达水平,发现射线照射确实增加了TLR2/4的mRNA表达水平,并且用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺处理可以消除辐射诱导的细胞表面表达的上调。此外,用抗氧化剂NAC处理不仅抑制辐射诱导的TLR2和TLR4的表达上调,而且抑制辐射诱导的c-Jun N-末端激酶(JNK)途径的激活。这些研究结果表明,活性氧与诱导细胞表面TLR2、TLR4表达的上调密切相关,而关键通路则是JNK的活化。
八、结语急性辐射暴露所带来的不良反应不可忽视,通常会导致生物体各器官的急性损害[24-25]。暴露于辐射会引起各种病理生理变化,包括直接的DNA损伤和自由基的产生,这些自由基又会导致多组织器官的辐射暴露损伤[7, 26]。TLR是许多哺乳动物先天的免疫元件,是生物体在进化的过程中存在的非常保守的一类模式受体,在有机体自我应对中可以发挥适应性的免疫反应[3, 10]。
目前报道的TLRs(2/4/5/9)的配体在体外和体内都表现出良好的辐射防护作用[7, 27]。而TLRs主要是通过触发髓样分化因子88(MyD88)和TRIF依赖的信号通路来发挥其辐射防护的效应[28-29]。TLR2的相应配体也是研究的热点方向,包括TLR2配体细菌脂蛋白(BLP),它通过激活TLR2信号传导通路,功能性的上调抗凋亡因子,抗氧化剂和细胞因子的NF-κB,而天然模拟BLP的sLP诱导的细胞因子,特别是G-CSF,可能是作为sLP的辐射防护/缓解活性的中间介质[30-31]。近来TLR4的配体HKST被证明能显著抑制辐射诱导的细胞凋亡,增加细胞存活和减轻DNA损伤[16-19]。由此显示TLR4在辐射防护中的重要地位,而HKST的辐射防护作用在TLR2基因敲除小鼠中被部分消除,表明TLR2也有助于HKST的辐射防护,因此TLRs之间的协同所显示出的辐射防护作用更加的不可忽视,共同激活多个TLR可能产生广泛和更强的辐射保护作用[16-17]。同时TRL5/9受体也同样具备潜在强大的辐射防护效应,如最近研究发现的TLR5配体细菌鞭毛蛋白,另外TLR9也被证实具有潜在辐射防护效应,与紫外线辐射防护密切相关,并且上调TLR9表达对于皮肤癌的治疗具有重要作用[32-33]。TLRs上调相关机制的研究也已明确,其中活性氧的参与诱导细胞表面TLR2,TLR4表达的上调密切相关[34-35]。根据这些证据,靶向的抗辐射治疗可能对整体辐射后的治疗疗效产生重大影响。
利益冲突 无作者贡献声明 王明宇撰写论文;王雯雯、查旭东负责收集、整理资料;刘聪负责论文修改
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