2. 河南省中医院肿瘤科, 郑州 450002
2. Department of Oncology, Henan Hospital of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450002, China
骨肉瘤又称为成骨肉瘤,其多发于青少年,放射治疗是目前骨肉瘤常见的治疗手段,骨肉瘤对放射敏感性差或放射抵抗是影响其治疗效果的主要原因,提高放射敏感性是骨肉瘤治疗急需解决的问题[1]。龙葵碱是提取至龙葵全草或者没有成熟的果实中的生物碱,具有消肿、清热解毒等功效[2]。近年来的研究显示,龙葵碱具有抗肿瘤功效,对于肿瘤细胞的生长具有抑制作用,对于肿瘤细胞的凋亡具有诱导作用,目前已经在宫颈癌、胰腺癌、前列腺癌等肿瘤中已经得到证实[3-5]。目前龙葵碱对于骨肉瘤细胞的作用和放射敏感性的作用尚不清楚,本研究旨在探讨龙葵碱对骨肉瘤细胞放射敏感性及增殖、凋亡的作用,为提高骨肉瘤患者的生存质量提供可能参考。
材料与方法1.材料:骨肉瘤MG-63细胞购自上海纪宁实业有限公司;Cleaved Caspase-3抗体、PCNA抗体购自美国Abcam公司;JC-1线粒体膜电位检测试剂盒、DCFH-DA法ROS含量检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司;Ki-67抗体、Bax抗体购自美国BioVision公司;龙葵碱购自北京柏奥易思生物科技有限公司;Primus直线加速器购自德国Siemens公司。
2.细胞分组:MG-63细胞分成空白对照组、单纯照射组、龙葵碱组、龙葵碱+照射组共4组,龙葵碱组、龙葵碱+照射组细胞分别在实验0 h将细胞培养液更换为含有40 μg/ml龙葵碱的含药培养液,单纯照射组、龙葵碱+照射组在实验0 h时以8 Gy剂量照射处理(6 MV X射线,照射野30 cm×30 cm,源靶距为100 cm),细胞培养48 h后用于后续实验检测。按照噻唑蓝(MTT)方法测定细胞增殖变化。
3. MTT方法测定龙葵碱对骨肉瘤细胞增殖影响:MG-63细胞按照每孔接种2 000个细胞种植到96孔细胞培养板内,培养过夜后,将孔内的上清液吸除,添加含有龙葵碱终浓度为0、10、20、40、80、160 μg/ml的细胞培养液,继续培养48 h后,将培养板取出,分别添加MTT溶液10 μl,继续培养4 h。把孔内的液体吸弃,添加二甲基亚砜(DMSO)溶液孵育10 min后,测定470 nm每孔的吸光度(A)值,经空白孔调零以后,分析细胞存活率变化。
4.流式细胞术测定细胞凋亡:收集空白对照组、单纯照射组、龙葵碱组、龙葵碱+照射组细胞,添加磷酸盐缓冲液(PBS)把各组细胞重悬3次,再加入结合缓冲液(binding buffer)混合,添加碘化丙啶(PI)及Annexin V-FITC染液混合以后,用流式细胞仪检测凋亡变化。
5. Western blot检测细胞中Ki-67、PCNA、Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平:以含有PMSF的RIPA将空白对照组、单纯照射组、龙葵碱组、龙葵碱+照射组细胞置于冰上裂解,用细胞刮刀收集细胞碎片,继续放在冰上充分裂解30 min以后,在4℃离心机中高速离心(10 000 r/min,离心半径8 cm,离心10 min),吸取上清。用二喹啉甲酸(BCA)法对蛋白样品定量检测。取蛋白样品,添加5×上样缓冲液(loading buffer)按照4:1的体积比混合后,放在100℃孵育5 min。分别配制12%分离胶和5%浓缩胶。每孔上样40 μg蛋白样品,首先用80 V电压电泳,等到溴酚蓝进入到分离胶时,把电压调整到100 V继续电泳。电泳结束后将凝胶取出,以250 mA的电流将凝胶上的蛋白转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上,转膜装置置于冰上进行。PVDF膜放在5%牛血清白蛋白中将非特异性结合位点封闭以后,分别依次与一抗和二抗常规方法反应,Ki-67、PCNA抗体以1:600稀释,Bax、Cleaved Caspase-3抗体以1:400稀释,二抗以1:4 000稀释。用ECL发光试剂盒化学发光以后,用Quantity One软件分析每组条带的吸光度值。内参为GAPDH,分析各蛋白相对表达水平。
6. JC-1法检测线粒体膜电位:收集空白对照组、单纯照射组、龙葵碱组、龙葵碱+照射组细胞,吸取1×JC-1染液添加至细胞中,37℃孵育20 min,用荧光显微镜观察红绿荧光的比值,以红绿荧光比值表示线粒体膜电位。
7.二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)法检测活性氧(ROS)水平:用不含血清的培养液将DCFH-DA按照1:1 000稀释,将空白对照组、单纯照射组、龙葵碱组、龙葵碱+照射组细胞悬浮于上述DCFH-DA溶液中,置于37℃孵育20 min,期间每隔5 min上下颠倒混合1次。最后用不含血清的培养液将细胞洗涤3次。用荧光酶标仪检测发射波长525 nm,激发波长488 nm的荧光强度,以荧光强度表示ROS水平。
8.平板克隆实验检测克隆形成能力:MG-63细胞接种到6孔板内,每孔内添加400个细胞,分别按照空白对照组和龙葵碱组分组培养,同时在实验0 h时分别给予0、2、4、6、8 Gy单剂量照射处理。静置培养12 d以后,用结晶紫染色。计数≥50个细胞的克隆数目。计算细胞存活分数,用Graph Pad Prism 5 Demo拟合存活曲线,根据单击多靶模型参数值(D0、Dq、N、SF2、k)计算放射增敏比。克隆形成率(PE)=(克隆形成数目/接种细胞数目)×100%;细胞存活分数(SF)=照射细胞克隆数目/(接种细胞数目×未照射细胞克隆形成率);单击多靶方程式为:y=1-[1-exp(-kD)]N。
9.统计学处理:所有实验重复3次,实验数据用SPSS 21.0软件进行分析。计量资料经正态性检验符合正态分布以x±s表示。两组数据间比较采用t检验,多组差异比较经方差齐性检验采用单因素方差。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1.龙葵碱抑制骨肉瘤细胞增殖:0、10、20、40、80、160 μg/ml的龙葵碱处理后的细胞存活率分别为:(100.00±9.62)%、(83.36±5.45)%、(72.68±6.91)%、(52.01±4.23)%、(43.56±3.01)%、(22.05±2.47)%,10、20、40、80、160 μg/ml的龙葵碱处理后的细胞存活率降低。40 μg/ml的龙葵碱处理后细胞存活率接近50%,选用40 μg/ml浓度的龙葵碱处理细胞。
2.龙葵碱联合照射对骨肉瘤细胞增殖影响:结果见图 1、表 1,龙葵碱组和单纯照射组的骨肉瘤细胞存活率及增殖蛋白Ki-67、PCNA表达水平降低,并且龙葵碱联合放射处理对骨肉瘤细胞存活率下调作用更强(F存活率=55.165, P < 0.05;FKi-67蛋白=50.667, P < 0.05;FPCNA蛋白=23.389, P < 0.05)。龙葵碱联合放射降低骨肉瘤细胞增殖能力。
3.龙葵碱联合放射对骨肉瘤细胞凋亡影响:结果见图 2、表 2,龙葵碱组和单纯照射组的骨肉瘤细胞凋亡率及凋亡蛋白Bax、Cleaved Caspase-3表达水平升高,并且龙葵碱联合照射处理对骨肉瘤细胞凋亡促进作用更大(F凋亡率=54.588, P < 0.05;FBax蛋白=42.924, P < 0.05;FCleaved Caspase-3蛋白=51.541, P < 0.05)。龙葵碱联合照射诱导骨肉瘤细胞凋亡。
4.龙葵碱联合照射对骨肉瘤细胞线粒体膜电位和ROS水平影响:结果见表 3,龙葵碱组和单纯照射组的骨肉瘤细胞线粒体膜电位下降,细胞中ROS水平升高,并且龙葵碱联合照射处理对骨肉瘤细胞线粒体膜电位和ROS水平影响作用更强(F线粒体膜电位=40.762, P < 0.05;FROS水平=79.055, P < 0.05)。龙葵碱联合照射能够降低骨肉瘤细胞线粒体膜电位并促进细胞中ROS积累。
5.龙葵碱对骨肉瘤细胞放射敏感性影响:结果见图 3、表 4,骨肉瘤细胞经过龙葵碱处理和照射处理以后,细胞存活分数随着吸收剂量的增加而下降,根据单击多靶模型参数值D0、Dq、N、SF2、k计算龙葵碱对骨肉瘤细胞放射增敏比为1.786。
讨论
来自于植物中的天然成分由于具有不良反应小、安全等优点而成为目前肿瘤治疗中的热点,龙葵碱是一种甾体生物碱,具有杀菌、消炎、抗病毒等功效[6]。随着近年来研究的不断深入,龙葵碱抗肿瘤作用逐渐得到关注[7-8]。在前列腺癌、乳腺癌等细胞中发现,龙葵碱处理后的细胞体外凋亡水平升高,后续在结直肠癌等肿瘤细胞中也发现龙葵碱具有诱导肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞生长的作用[9-11]。这些研究表明,龙葵碱具有抗肿瘤作用。本研究在骨肉瘤细胞中证实了龙葵碱可以在体外抑制骨肉瘤细胞增殖和诱导骨肉瘤细胞凋亡的作用,龙葵碱对骨肉瘤细胞的作用与上述报道一致。本研究还进一步发现,龙葵碱可以提高骨肉瘤细胞放射敏感性,还能够协同放射共同诱导发挥抗骨肉瘤作用,提示龙葵碱不仅是一种抗肿瘤药物,还具有提高肿瘤放射敏感性的作用,龙葵碱可能是骨肉瘤治疗中的有效药物。
目前对于龙葵碱抗肿瘤机制研究发现,龙葵碱可以通过促进Bax表达和Caspase-3活化而发挥诱导细胞凋亡的作用[12-14]。Bax属于Bcl-2蛋白家族成员,是细胞凋亡发生的促进因子;Caspase-3是Caspase凋亡反应的下游因子,被活化形成Cleaved Caspase-3后才能够发挥细胞凋亡的作用,并且具有不可逆性[15-18]。细胞凋亡的发生与细胞内ROS水平有关,过量的ROS可以刺激线粒体,引起线粒体膜电位下降,从而诱导下游促凋亡蛋白的表达,引起凋亡反应[19-21]。Ki-67、PCNA是细胞增殖活性升高的标志蛋白,其表达水平的高低与细胞增殖能力呈正比[22-24]。本研究证实龙葵碱能够协同放射抑制骨肉瘤细胞中Ki-67、PCNA蛋白表达并提高Bax、Cleaved Caspase-3蛋白表达水平,上调细胞中ROS水平,降低线粒体膜电位,这可能提示,龙葵碱通过诱导ROS积累,进而影响线粒体膜电位,促进细胞中Bax表达和Caspase-3活化,诱导细胞凋亡和增殖抑制,从而发挥抗肿瘤机制和提高肿瘤细胞放射敏感性的作用。
总之,龙葵碱可能是治疗骨肉瘤和提高骨肉瘤放射敏感性的有效途径,龙葵碱可以协同放射诱导骨肉瘤细胞凋亡并抑制细胞增殖,其作用机制可能与ROS/Bax/Caspase-3有关。其具体的抗肿瘤机制尚不明确,还需要在以后的实验中进行探讨和验证。本实验为研究龙葵碱在抗肿瘤作用、提高肿瘤放射敏感性提供了新的可能的思路。
利益冲突 无作者贡献声明 阎亮负责设计和撰写论文;孙晓泽负责实验;王上增负责数据分析;段铮协助数据分析
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