2019, Vol. 39
2. 河南省人民医院放疗科, 郑州 450000
2. Department of Radiotherapy, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450000, China
甲状腺髓样癌(MTC)是甲状腺癌分类中的独特一型，是源自甲状腺滤泡旁细胞(C细胞)的恶性肿瘤[1]，由于该细胞不能吸收碘，对放射敏感性不高，导致放射治疗对MTC的治疗效果不理想，因此提高人髓样甲状腺癌细胞的放射敏感性对临床上治疗MTC具有重大意义。miR-129-5p在多种癌症中发挥抑癌作用，有研究表明，miR-129-5p可靶向RET原癌基因(RET)抑制MTC细胞的生长、凋亡和迁移[2]。高迁移率族蛋白B1 (HMGB1)在多种癌症中表达增强[3]，是一种抗细胞凋亡的癌蛋白，有报道miR-129-2可通过靶向HMGB1在胶质瘤细胞中发挥抑癌作用，并受DNA甲基化的影响[4]；HMGB1诱导甲状腺乳头状癌细胞过度表达mir-222和mir-221，进而促进细胞生长转移[5]。但miR-129-5p靶向HMGB1调控MTC细胞放射敏感性仍未阐明，因此，本研究拟通过开展miR-129-5p与HMGB1靶向关系验证及其对人髓样甲状腺癌细胞MZ-CRC-1和放射抵抗细胞MZ-CRC-1/R的放射敏感性影响的相关研究，为MTC的临床治疗提供科学依据。
材料与方法1.主要试剂及仪器：人髓样甲状腺癌细胞MZ-CRC-1为北京北纳生物公司产品；细胞培养板、脱脂奶粉为美国BD公司产品；DMEM高糖培养基为美国Hyclone公司产品；双抗[青霉素(10 000 units/ml)/链霉素(10 000 μg/ml)]胰酶、二甲基亚砜(DMSO)、噻唑蓝(MTT)和结晶紫为美国Sigma公司产品；蛋白提取试剂盒、BCA蛋白定量试剂盒、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、化学发光剂(ECL)为上海碧云天生物公司产品；小鼠抗人HMGB1抗体为美国Abcam公司产品；小鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)抗体为美国Santa Cruz Biotechnology公司产品；HRP山羊抗小鼠二抗为北京中杉金桥生物技术有限公司产品；miRNeasy mini试剂、QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒为德国Qiagen公司产品；High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit为美国Biosystems公司产品。miR-NC inhibitor、miR-129-5p inhibitor、miR-NC、miR-129-5p mimic、siHMGB1及无意义序列(Scrambled)、pcDNA3.0 HMGB及空载对照(Vector)为上海吉玛公司产品；lipo2000转染试剂为美国赛默飞公司产品；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒为上海碧云天生物公司产品；双荧光素酶报告基因质粒为上海汉恒生物构建；流式细胞仪为美国BD FACS Aria公司产品；X射线放疗机购自丹东市康嘉仪器有限公司。
2.细胞培养：人髓样甲状腺癌细胞MZ-CRC-1培养于含有10%胎牛血清、1%的双抗DMEM培养基中，培养条件为5% CO2、37℃恒温培养箱。
3. MZ-CRC-1/R放射抵抗细胞的建立：取对数生长的MZ-CRC-1细胞在室温下，采用X射线放疗机，6 MeV X射线垂直照射，细胞表面以1.5 cm组织等效填充物覆盖，剂量率为2.0 Gy /min，靶皮距为70 cm，照射野7 cm×7 cm，每次照射剂量为600 cGy，照射后继续培养，存活细胞用0.25%胰蛋白酶消化传代。待细胞再次达指数生长期期末时，消化细胞，将适量细胞接种传代，次日再照射相同剂量。重复以上过程，照射5次，得到抗辐射细胞株，命名为MZ-CRC-1/R。MTT法检测不同照射剂量(0、2、4、6、8 Gy)照射细胞MZ-CRC-1/R和MZ-CRC-1的细胞活力，筛选后续实验所用最佳照射剂量；MTT法检测4 Gy照射剂量下不同时间点下(0、1、2、3、4、5 d)细胞MZ-CRC-1/R和MZ-CRC-1的细胞活力。
4. qRT-PCR检测miR-129-5p在MZ-CRC-1和MZ-CRC-1/R：分别用miRNeasy mini从培养的MZ-CRC-1/R和MZ-CRC-1细胞中提取miRNA。使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit从2 μg RNA中合成cDNA。随后用QuantiTect SYBR Green PCR一式3份进行qRT-PCR。以U6为内参，计算miR-129-5p的表达水平。收集数据并使用2-ΔΔCt方法分析以定量相对miRNA表达水平。
5.抑制miR-129-5p对MZ-CRC-1细胞放射敏感性的影响：利用lipo2000转染试剂将miR-NC inhibitor、miR-129-5p inhibitor转染至对数生长期的细胞MZ-CRC-1细胞中，分别记为miR-NC inhibitor组和miR-129-5p inhibitor组，转染后24 h，利用qRT-PCR方法检测miR-129-5p的表达水平；取转染后24 h后的细胞，将其消化下来以每孔5×103个细胞接种至96孔板中，根据实验要求，同时设置5个复孔，分别在1、2、3、4、5 d加入MTT溶液，37℃继续培养4 h，加入等量二甲基亚砜(DMSO)，在490 nm波长下，采用酶标仪检测吸光度(A)值，并根据miR-129-5p inhibitor组A值与miR-NC inhibitor组A值的比值计算细胞活力。取miR-NC inhibitor组和miR-129-5p inhibitor组细胞并经4 Gy X射线照射，分别记为miR-NC inhibitor+4 Gy组和miR-129-5p inhibitor+4 Gy组，同时以不作任何处理的MZ-CRC-1细胞为对照组，以4 Gy剂量照射的MZ-CRC-1细胞为4 Gy组，48 h后采用Annexin V-FITC/PI试剂盒操作步骤检测细胞凋亡情况。
6.过表达miR-129-5p对MZ-CRC-1/R细胞放射敏感性的影响：分别将miR-NC、miR-129-5p mimic转染至对数生长期的细胞MZ-CRC-1/R细胞中，分别记为miR-NC组和miR-129-5p inhibitor组，转染后24 h，参考方法4中qRT-PCR方法检测miR-129-5p的表达水平；参照方法5中MTT方法检测细胞活力。取miR-NC组和miR-129-5p组细胞并经4 Gy X射线照射，分别记为miR-NC+4 Gy组和miR-129-5p+4 Gy组，同时以不作任何处理的MZ-CRC-1/R细胞为空白对照组，以4 Gy X射线照射的MZ-CRC-1细胞为4 Gy照射组，48 h后采用Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡情况。
7.双荧光素酶报告基因实验：利用Tragetscan在线预测分析软件对miR-129-5p与HMGB1靶向结合位点进行分析，设计包含与miR-129-5p结合序列和突变序列的HMGB1基因片段，构建野生型(WT)，两种突变型(Mut-1和Mut-2)及两种共突变型(Mut-1&2)的HMGB1双荧光素报告基因载体，分别记为HMGB1-WT、HMGB1-Mut-1、HMGB1-Mut-2和HMGB1-Mut-1 & 2。将上述HMGB1野生型和突变型双荧光素报告基因载体分别与无义序列阴性对照(miR-NC)、miR-129-5p mimic共转染至MZ-CRC-1细胞中，双荧光素酶报告基因实验检测各组细胞中荧光素酶活性变化。
8. Western blot检测miR-129-5p对HMGB1表达的影响：取对数生长的MZ-CRC-1和MZ-CRC-1/R细胞，分别将miR-NC inhibitor、miR-129-5p inhibitor转染至MZ-CRC-1细胞，分别将miR-NC、miR-129-5p mimic转染至MZ-CRC-1/R细胞，转染后48 h，裂解细胞、提取细胞蛋白，采用BCA蛋白定量试剂盒对蛋白定量；通过SDS-PAGE方法行蛋白电泳，采用湿转法将蛋白转至PVDF膜上，进行相应的一抗和二抗孵育，最后用ECL化学发光剂进行显影、曝光，以GAPDH为内参，分析HMGB1的相对蛋白表达量。
9. MiR-129-5p通过HMGB1对MTC细胞放射敏感性的影响：取对数生长期的MZ-CRC-1和MZ-CRC-1/R细胞进行转染实验，将MZ-CRC-1细胞分为4组：miR-NC-inhibitor组(转染miR-NC-inhibitor)、miR-129-5p-inhibitor组(转染miR-129-5p-inhibitor)、miR-NC-inhibitor + Scrambled组(共转染miR-NC-inhibitor和Scrambled)、miR-129-5p-inhibitor + siHMGB1组(共转染miR-129-5p-inhibitor和siHMGB1)；将MZ-CRC-1/R细胞分为4组：miR-NC组(转染miR-NC)、miR-129-5p组(转染miR129-5p)、miR-129-5p+Vector组(共转染miR-129-5p和Vector)、miR-129-5p +HMGB1组(共转染miR-129-5p和HMGB1)、转染方法参照lipo2000转染试剂的说明书进行操作，48 h后根据Annexin V-FITC/PI检测各组细胞凋亡情况。
10.克隆形成实验：细胞以每孔106个细胞密度接种到6孔细胞板，于培养箱内常规培养过夜后，给予0、2、4、6和8 Gy不同剂量的X射线照射。照射结束后，更换含10%胎牛血清的完全培养基在10 cm的平皿中继续培养。12 d后，先以预冷的甲醇对形成的菌落固定15 min后，再以结晶紫染色30 min，统计有效克隆细胞数(>50个细胞的集落)。按照下列公式，计算克隆形成率(PE)：PE(%)=克隆数/种植细胞数×100%。以单击多靶模拟合细胞存活曲线，计算放射增敏比(SER=对照组D0/实验组D0)。
11.统计学处理：采用SPSS 20.0软件进行分析。数据经正态性检验符合正态分布采用x±s表示。用GraphPad Prism 7进行作图。2组计量资料比较采用t检验，多组计量资料比较经方差齐性检验后采用单因素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1.抗辐射MZ-CRC-1/R细胞株的建立：用不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)的X射线照射MZ-CRC-1和MZ-CRC-1/R细胞后，克隆形成检测发现，MZ-CRC-1/R细胞存活分数显著高于MZ-CRC-1细胞(t=3.038、4.330、4.885、4.568，P < 0.05)，放射增敏比0.617；MTT法检测细胞增殖活力，结果显示，与MZ-CRC-1细胞相比，MZ-CRC-1/R细胞增殖能力提高(t=3.637、7.734、11.896、14.522，P < 0.05，图 1和表 1)，选择MZ-CRC-1增殖活力为50%的照射剂量4 Gy进行后续试验；MTT法检测4 Gy照射细胞后不同时间点(1、2、3、4、5 d)细胞增殖活力，结果显示，与MZ-CRC-1细胞相比，MZ-CRC-1/R细胞殖能力上升(t=3.118、3.464、5.436、7.206、9.037，P < 0.05，表 1)，上述结果表明，与MZ-CRC-1细胞相比，MZ-CRC-1/R细胞的放射敏感性降低，本研究成功构建抗辐射MZ-CRC-1/R细胞株。
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注：a与MZ-CRC-1比较，t=3.308、4.330、4.885、4.568, P < 0.05 图 1 MZ-CRC-1和MZ-CRC-1/R细胞的存活曲线 Figure 1 Survival curve of MZ-CRC-1 and MZ-CRC-1/R cells |
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表 1 X射线照射后MZ-CRC-1和MZ-CRC-1/R的细胞活力(%, x±s) Table 1 Cell viability of MZ-CRC-1 and MZ-CRC-1/R after X-ray irradiation (%, x±s) |
2. miR-129-5p在MZ-CRC-1/R细胞中表达下调：qRT-PCR检测miR-129-5p在MZ-CRC-1和MZ-CRC-1/R细胞中的表达量，结果显示，与MZ-CRC-1细胞(1.00±0.06)相比，miR-129-5p在MZ-CRC-1/R细胞中的表达(0.26±0.03)显著下调(t=19.107，P < 0.05)。
3.敲低miR-129-5p诱导MZ-CRC-1细胞放射抵抗：qRT-PCR检测miR-129-5p表达，结果显示，与miR-NC-inhibitor组细胞(1.00±0.06)相比，miR-129-5p-inhibitor组细胞中miR-129-5p表达(0.19±0.02)显著降低(t=22.183，P < 0.05)；MTT法检测不同时间点(0、1、2、3、4和5 d)下的细胞活力，结果显示，与miR-NC-inhibitor组细胞(100±8、75±8、62±6、45±4、36±4、23±2)相比，miR-129-5p-inhibitor组细胞增殖能力在1 d时(103±6、89±9)差异无统计学意义(P>0.05)，3、4和5 d时(69±7、61±6、53±5)显著增加(t=5.156、6.005、9.649，P < 0.05)；流式细胞术检测细胞凋亡率，结果显示，与0 Gy组(4.38±0.51)%相比，4 Gy组细胞凋亡率(25.49±2.67)%显著增加(t=13.451，P < 0.05)，与miR-NC-inhibitor+4 Gy组(26.32±2.71)%相比，miR-129-5p-inhibitor+4 Gy组细胞凋亡率(11.25±1.32)%显著降低(t=8.659，P < 0.05，图 2)。
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图 2 抑制miR-129-5p并经照射后MZ-CRC-1细胞凋亡的流式细胞图 Figure 2 The flow apoptosis diagram of MZ-CRC-1 cells after inhibition of miR-129-5p and irradiation |
4.过表达miR-129-5p增加MZ-CRC-1/R细胞放射敏感性：qRT-PCR检测miR-129-5p表达，结果显示，与miR-NC组细胞(1.00±0.07)相比，miR-129-5p组细胞中miR-129-5p表达(4.67±0.45)显著上调(t=13.958，P < 0.05)；MTT法检测不同时间点(0、1、2、3、4和5 d)下细胞增殖能力，结果显示，与miR-NC组细胞(100±6、93±9、82±8、74±7、64±6、56±6)相比，miR-129-5p组细胞增殖能力在0和1 d时差异无统计学意义(P>0.05)，在2、3、4、5 d时(64±6、49±5、39±4、27±3)明显降低(t=3.118、5.034、6.005、7.488，P < 0.05)；流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，与空白对照组(3.78±0.39)%相比，4 Gy照射组细胞凋亡率(12.67±1.35)%明显增加(t=10.958，P < 0.05)，与miR-NC+4 Gy组(13.49±1.41)%相比，miR-129-5p+4 Gy组细胞凋亡率(24.58±2.67)%显著增加(t=6.362，P < 0.05)。
5.验证HMGB1是miR-129-5p的靶基因：通过Target scan在线预测分析软件预测到miR-129-5p与HMGB1的3′UTR存在两处结合位点(图 3)，双荧光素酶报告基因实验结果显示，与miR-NC组相比，miR-129-5p组中HMGB1-WT载体、HMGB1-Mut-1载体、HMGB1-Mut-2载体的荧光素酶活性显著降低(t=11.754、5.604、4.683，P < 0.05)，但却不影响HMGB1-Mut-1 & 2载体的荧光素酶活性，见表 2。转染miR-129-5p-inhibitor的MZ-CRC-1细胞中HMGB1及其下游蛋白p-AKt表达(0.71±0.07、0.61±0.05)较miR-NC-inhibitor组(0.35±0.04、0.22±0.02)明显上调(t=7.734、12.544，P < 0.05)，总的AKt表达无显著变化；而转染miR-129-5p mimic的MZ-CRC-1/R细胞中HMGB1及其下游蛋白p-AKt表达(0.68±0.07、0.49±.05)较miR-NC组(0.27±0.03、0.16±0.02)显著降低(t=9.325、10.614，P < 0.05，图 3)。
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注：1. miR-NC-inhibitor组；2. miR-129-5p-inhibitor组；3. miR-NC组；4. miR-129-5p mimic组 图 3 HMGB1是miR-129-5p的靶基因验证 A. miR-129-5p与HMGB1的结合位点；B. Western blot验证miR-129-5p对HMGB1及其下游蛋白表达的影响 Figure 3 Validation of HMGB1 as the target gene of miR-129-5p A. The binding sites between miR-129-5p and HMGB1; B. Effect of miR-129-5p on the expressions of HMGB1 and its downstream proteins was validated by Western blot assay |
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表 2 两组细胞转染不同载体的荧光素酶活性(x±s) Table 2 The luciferase activity in two cell groups transfected with different vectors(x±s) |
6. MiR-129-5p通过HMGB1增加MTC细胞放射敏感性：流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，与miR-NC-inhibitor组(25.69±2.64)%相比，miR-129-5p-inhibitor组细胞凋亡率(11.34±1.24)%降低(t=8.522，P < 0.05)，与miR-NC-inhibitor+Scrambled组相比(12.54±1.31)%，miR-NC-inhibitor+siHMGB1组细胞凋亡率(22.18±2.12)%显著升高(t=6.700，P < 0.05)，表明下调miR-129-5p可诱导MZ-CRC-1细胞产生放射抵抗，而同时敲低HMGB1可增加其放射敏感性；将miR-129-5p mimic和pcDNA3.0 HMGB1共转染至MZ-CRC-1/R细胞，流式细胞术检测细胞凋亡，结果显示，与miR-NC组(12.88±1.34)%相比，miR-129-5p组细胞凋亡率(24.97±2.64)%升高(t=7.073，P < 0.05)，与miR-129-5p+Vector组(23.49±2.41)%相比，miR-129-5p+HMGB1组细胞凋亡率(14.58±1.57)%降低(t=5.365，P < 0.05)，表明过表达miR-129-5p可增加MZ-CRC-1/R细胞的放射敏感性，而HMGB1的额外补充可诱导其产生放射抵抗。
讨论MTC占所有甲状腺癌的5%左右，恶性程度在甲状腺癌中较高，预后差[6-7]。目前临床治疗MTC的方法主要是手术切除，但对于高风险的患者，辅助性放化疗仍然十分必要。由于MTC放疗效果仍不理想，因此如何提高其放射敏感性迫在眉睫。多项实验表明，与亲本细胞株相比，miRNAs在相应的放射抵抗肿瘤细胞中表达水平有显著差异[8-10]，说明miRNAs可能与肿瘤细胞的放射敏感性密切相关，已有研究表明，调控其表达有可能增加肿瘤细胞放射敏感性[11]。有报道称，miR-129-5p可通过调控靶基因进而影响肿瘤细胞增殖、迁移侵袭和凋亡。例如，Wang和Yu[12]发现miR-129-5p在胃癌细胞中表达下调，通过MTT、克隆形成和Transwell实验检测发现miR-129-5p抑制胃癌细胞的增殖，迁移和侵袭。Zhang等[13]证实miR-129-5p通过靶向转录因子SOX4抑制Wnt/β-catenin信号通路，进一步抑制软骨肉瘤细胞增殖，迁移和促进细胞凋亡。此外，miR-129-5p上调还可通过调控信号转导和转录激活因子-3(STAT3)表达而影响喉癌细胞增殖，侵袭和迁移[14]。但关于miR-129-5p在人髓样甲状腺癌的研究仍较少。近期研究表明，miR-129-5p与化疗药物的敏感性密切相关。胡俊华等[15]研究发现，miR-129-5p可通过靶向胸苷蒜合成酶(TYMS)进而增加结肠癌磁暴对5-氟尿嘧啶(5-Fu)的敏感性。石瑛等[16]的研究表明miRNA-129-5p可提高乳腺癌细胞MCF-7对紫杉醇的敏感性。但关于miR-129-5p对肿瘤细胞放射敏感性的研究较少。本研究发现miR-129-5p在放射抵抗的人髓样甲状腺癌细胞MZ-CRC-1/R中表达降低，这提示miR-129-5p可能与MZ-CRC-1细胞放射敏感性有关。为进一步研究miR-129-5p对MZ-CRC-1细胞放射敏感性的影响机制，本研究在MZ-CRC-1/R细胞中上调miR-129-5p表达。结果发现，上调其表达则显著抑制细胞的增殖能力。而在MZ-CRC-1细胞中下调miR-129-5p表达可提高细胞的增殖活力，众所周知，细胞放射敏感性与细胞凋亡率密切相关，放射治疗主要是通过电离辐射诱导细胞发生凋亡，因此细胞凋亡率可作为评价放射敏感性的重要指标[17-18]。本研究结果显示，抑制miR-129-5p可抑制细胞的凋亡，过表达miR-129-5p则使放射抵抗细胞发生凋亡。综上所述，抑制miR-129-5p表达可诱导MZ-CRC-1细胞产生放射抵抗，而过表达miR-129-5p增加MZ-CRC-1/R细胞放射敏感性，这些研究结果表明，miR-129-5p与人髓样甲状腺癌的放射敏感性密切相关。
HMGB1是一种高迁移率族蛋白，能够参与细胞的生物学过程。有研究表明，miR-34a通过靶向急性髓系白血病细胞中的HMGB1促进细胞凋亡[19]。miR-142-3p可通过靶向HMGB1增加非小细胞肺癌的化疗敏感性[20]。HMGB1可增加乳腺癌细胞对γ射线的放射敏感性[21]。而关于HMGB1是否参与人髓样甲状腺癌的放射敏感性仍未可知。Wu等[22]发现，miR-129-5p与HMGB1存在靶向关系进而调控结肠癌的发生发展。但是miR-129-5p是否可靶向HMGB1参与人髓样甲状腺癌细胞的放射敏感性，仍有待研究。本研究通过双荧光素酶报告基因和Western blot实验证实miR-129-5p可靶向负调节HMGB1表达，这与文献结果相一致[22]。同时研究结果还发现HMGB1的敲低或过表达可部分逆转miR-129-5p下调或上调对MZ-CRC-1细胞放射敏感性的作用，这些结果提示，HMGB1参与miR-129-5p对甲状腺髓样癌细胞MZ-CRC-1放射敏感性的调控过程。然而，本研究并未单独研究HMGB1对MZ-CRC-1细胞放射敏感性的影响，同时miR-129-5p靶向HMGB1对甲状腺髓样癌放射敏感性的影响还应该在体外实验中进行验证。综上所述，本研究证实miR-129-5p可靶向抑制HMGB1增加甲状腺髓样癌细胞MZ-CRC-1放射敏感性，提示miR-129-5p也许可作为MTC基因治疗的新靶点，为MTC的临床治疗提供了理论依据。
利益冲突 无作者贡献声明 闫培和张振华负责设计和实验操作及撰写论文; 刘建波、连利霞协助实验; 丁超协助完成数据分析
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