骨肉瘤具有恶性程度高、致死率高等特点，但对于肿瘤生长在骨盆、脊柱等的患者手术治疗具有很大的局限性，放射治疗是除了手术治疗之外常见的辅助疗法^[1]，而在放射治疗的同时肿瘤周围器官也会受到损伤，部分患者还会出现放射不敏感等现象^[2]。肝癌高表达转录本(highly up-regulated in liver cancer, HULC)是一个与肿瘤有关的长链非编码RNA(long noncoding RNA, LncRNA)，最早在肝癌中发现，其基因表达水平的高低与肿瘤的易感性等有关^[3]。HULC与肿瘤细胞的生长调控有关，下调HULC抑制胃癌、肝癌等细胞的恶性表型，HULC可能是肿瘤治疗的潜在靶点^[4-5]。目前在骨肉瘤中的研究表明，HULC高表达是骨肉瘤患者预后不良的标志之一，而对于HULC在骨肉瘤细胞放射敏感性和增殖凋亡中的作用尚不明确^[6]。本研究在体外通过shRNA下调骨肉瘤细胞中HULC表达水平，明确HULC在骨肉瘤细胞放射敏感性和增殖凋亡中的作用，以期为靶向基因治疗骨肉瘤和提高骨肉瘤患者放射敏感性提供依据。

1.主要试剂和细胞：cDNA合成试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司；HULC shRNA和阴性对照慢病毒(pLVTHM)由上海吉凯基因化学技术有限公司构建包装；引物由金斯瑞生物科技有限公司合成；PI细胞周期检测试剂盒购自上海榕柏生物技术有限公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒、胞浆蛋白提取试剂盒购自江苏凯基生物技术股份有限公司；81210541I1 Cyclin D1抗体、5681543 C-Caspase-3抗体、45837088 p21抗体、35170905细胞色素C(Cyt-C)抗体购自美国Cell Signaling Technology；线粒体蛋白提取试剂盒购自艾美捷科技有限公司；骨肉瘤细胞OS732购自中国科学院上海细胞库。

2.慢病毒感染和细胞分组：骨肉瘤细胞种植于12孔板内，放在37℃，5% CO₂培养箱中培养，细胞密度约为35%时，吸取慢病毒液分别添加到细胞内，感染复数为20，在细胞中添加终浓度为6 mg/L的Polybrene混合后，继续培养过夜，将液体吸弃，添加细胞培养液，3 d后观察绿色荧光表达水平，感染效率高于90%用于后续实验。将感染HULC shRNA和阴性对照慢病毒的骨肉瘤细胞记为sh-HULC组和阴性对照组。将感染HULC shRNA和阴性对照慢病毒的骨肉瘤细胞用8 Gy剂量^[7]照射处理后记为照射+sh-HULC组和单纯照射组。采用Senergy直线加速器6 MV X射线(瑞典医科达医疗系统公司)照射，源皮距100 cm，30 cm×30 cm照射野，剂量率300 c Gy/min。细胞在受到照射后48 h可明显影响细胞增殖、凋亡等生物学特性，均选择照射48 h以后进行相关实验^[7]。

3. qRT-PCR检测干扰效果：阴性对照组、sh-HULC组细胞用TRIZOL试剂分别提取细胞中的RNA，吸取5 μl的RNA，以cDNA合成试剂盒进行反转录反应(MMLV-RT)。qRT-PCR引物为：β-肌动蛋白正向引物5′ CTACAATGAGCTGCGTGTGG 3′，反向引物5′ AAGGAAGGCTGGAAGAGTGC 3′。HULC正向引物5′ ACTCTGAAGTAAAGGCCGGA 3′，反向引物5′ TGCCAGGAAACTTCTTGCTTG 3′。PCR程序为：95℃孵育2 min；95℃孵育30 s；60℃孵育35 s；设置40个循环。β-肌动蛋白为内参，最后分别读取每个反应的Ct值，2^-△△Ct方法计算HULC表达变化。

4.四甲基偶氮唑盐(MTT)方法测定细胞增殖：将阴性对照组、单纯照射组、sh-HULC组、照射+sh-HULC组细胞依次接种到96孔板内，每个孔中添加100 μl，孵育48 h以后，将培养板分别取出，每孔添加MTT溶液各20 μl，放在培养箱内继续孵育4 h，弃上清，分别添加150 μl的二甲基亚砜(DMSO)，酶标仪上检测570 nm每孔的吸光度(A)值。经过空白孔调零以后，把阴性对照组细胞存活率设置为100%，分析各组细胞存活率变化。

5. PI单染检测细胞周期：阴性对照组、单纯照射组、sh-HULC组、照射+sh-HULC组细胞培养48 h后，分别收集各组细胞，添加磷酸盐缓冲液(PBS)将细胞分别洗涤2次。添加75%乙醇溶液固定，在每组样品中分别添加碘化丙啶(PI)染液，置于室温条件避光反应30 min，流式细胞仪检测，分析细胞周期比例变化。

6. Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡：阴性对照组、单纯照射组、sh-HULC组、照射+sh-HULC组细胞培养48 h以后，添加0.25%的胰蛋白酶消化后收集细胞，每个样品收集1×10⁶个细胞，继续添加PBS把细胞洗涤3次以后，分别加入500 μl的结合缓冲液(binding buffer)将细胞配制成单细胞悬浮液，分别添加Annexin V-FITC 5 μl和PI 5 μl，继续孵育15 min。置于流式细胞仪测定各组细胞凋亡水平。

7. Western blot检测p21、Cyclin D1、C-Caspase-3、Cyt-C蛋白表达水平:阴性对照组、单纯照射组、sh-HULC组、照射+sh-HULC组细胞培养48 h以后，收集细胞。用放射免疫沉淀(RIPA)：苯甲基磺酰氟(PMSF)=100:1的蛋白提取溶液提取细胞总蛋白，同时用细胞质和线粒体提取试剂盒提取细胞质和线粒体蛋白。每组样品上样40 μg，肉眼观察溴酚蓝电泳到分离胶的底部后终止电泳。把凝胶取出，调整300 mA电流转膜。经封闭液封闭以后，再放一抗、二抗反应液中继续2 h，ECL显色，用软件Quantity One扫描灰度值，分析蛋白表达水平。线粒体中Cyt-C蛋白内参为porin，细胞总蛋白中p21、Cyclin D1、C-Caspase-3水平和细胞质中Cyt-C蛋白内参均为β-肌动蛋白。p21、Cyclin D1、C-Caspase-3抗体以1:600稀释，Cyt-C抗体以1:200稀释，β-肌动蛋白抗体以1:1 000稀释，porin抗体以1:800稀释。

8.平板克隆实验检测细胞放射敏感性：把阴性对照组、sh-HULC组细胞用胰蛋白酶消化后，分别接种到6孔细胞培养板中，给予0、2、4、6和8 Gy X射线照射处理，放在培养箱中静置培养13 d。用1%的结晶紫染色以后，在显微镜下观察细胞克隆数目。根据单击多靶模型参数值拟合存活曲线，计算细胞存活分数，方法同文献[7]。

9.统计学处理：采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析，计量资料用x±s表示，两组数据符合正态分布采用独立样本t检验，多组差异比较经方差齐性检验采用单因素方差分析，组间比较用LSD-t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。

1. HULC shRNA慢病毒下调HULC表达：阴性对照组、sh-HULC组细胞中HULC水平分别为：1.00和0.45±0.08。HULC shRNA慢病毒感染后的骨肉瘤细胞中的HULC表达水平明显降低。HULC shRNA可以明显下调骨肉瘤细胞中HULC表达。

2. HULC shRNA慢病毒协同放射抑制细胞增殖并阻滞细胞周期：HULC shRNA慢病毒感染和放射处理后的骨肉瘤细胞存活率降低，差异有统计学意义(F=28.910, P < 0.05)。G₁期细胞比例升高，差异有统计学意义(F=11.591, P < 0.05)，S期比例降低，差异有统计学意义(F=53.305, P < 0.05)，G₂期比例没有变化，差异无统计学意义(P>0.05)；周期抑制因子p21蛋白表达升高，周期促进因子Cyclin D1蛋白表达水平降低，差异均有统计学意义(F=40.311、24.539，P < 0.05)，并且二者联合使用后细胞存活率下降更多，差异有统计学意义(F=28.910, P < 0.05)，G₁期细胞比例升高更多，差异有统计学意义(F=11.591, P < 0.05)，S期比例更低，差异有统计学意义(F=53.305, P < 0.05)，G₂期比例没有变化(P>0.05)，周期抑制因子p21蛋白表达更高，周期促进因子Cyclin D1蛋白表达水平更低，差异均有统计学意义(F=40.311、24.539，P < 0.05)，具有协同作用。下调HULC能够协同放射抑制骨肉瘤细胞增殖和周期进展(图 1和表 1)。

注：1.阴性对照组；2.sh-HULC组；3.单纯照射组；4.照射+ sh-HULC组 图 1 Western blot检测各组细胞中p21和Cyclin D1蛋白表达 Figure 1 Western blot analysis of p21 and Cyclin D1 protein expression in cells of each group

表 1(Table 1)

表 1 各组p21和Cyclin D1蛋白表达及细胞存活率和周期分布(x±s) Table 1 Expression of p21 and Cyclin D1 protein cell survival rate and cell cycle distribution in each group(x±s) 组别 样本数 p21 Cyclin D1 细胞周期(%) 细胞存活率(%) G1 S G2 阴性对照组 3 0.31±0.03 0.43±0.06 50.15±5.14 19.84±1.17 30.01±3.10 100.00±9.65 sh-HULC组 3 0.45±0.05a 0.32±0.03a 62.35±4.22a 11.47±1.36 26.18±1.32 71.36±5.27a 单纯照射组 3 0.49±0.07b 0.29±0.02b 66.05±5.23b 10.84±1.23 27.11±2.51 63.48±5.93b 照射+sh-HULC组 3 0.86±0.09cd 0.15±0.04cd 77.17±7.54cd 7.21±1.30 25.62±1.45 49.32±5.76cd F值 40.311 24.539 11.591 53.305 2.316 28.910 P值 0.000 0.000 0.003 0.000 0.152 0.000 注：与阴性对照组比较，at=4.159、2.841、3.177、4.512, bt=4.094、3.834、3.756、5.585，P < 0.05；c与sh-HULC组比，t=6.897，6.584，2.983，4.890，P < 0.05；d与单纯照射组比，t=5.621，5.422，2.106, 2.967，P < 0.05

表 1 各组p21和Cyclin D1蛋白表达及细胞存活率和周期分布(x±s) Table 1 Expression of p21 and Cyclin D1 protein cell survival rate and cell cycle distribution in each group(x±s)

3. HULC shRNA慢病毒协同放射诱导细胞凋亡：HULC shRNA慢病毒感染和放射处理后的骨肉瘤细胞凋亡率和凋亡蛋白C-Caspase-3水平均升高，差异有统计学意义(F=79.604、97.696，P < 0.05)，并且二者联合后具有协同作用，骨肉瘤细胞凋亡率和凋亡蛋白C-Caspase-3水平升高更多，差异有统计学意义(F=79.604、97.696，P < 0.05)。下调HULC能够协同放射共同促进骨肉瘤细胞凋亡(图 2和表 2)。

注：1.阴性对照组；2.sh-HULC组；3.单纯照射组；4.照射+ sh-HULC组 图 2 HULC shRNA慢病毒感染和放射后细胞凋亡率和凋亡蛋白C-Caspase-3表达变化   A.流式细胞术检测细胞凋亡；B. Western blot检测C-Caspase-3蛋白表达变化 Figure 2 Apoptotic rate and expression of apoptotic protein C-Caspase-3 after HULC shRNA lentivirus infection and irradiation   A.Flow cytometry assay of apoptosis; B.Western blot assay of C\|Caspase\|3 protein expression

表 2(Table 2)

表 2 各组细胞C-Caspase-3蛋白水平和凋亡率(x±s) Table 2 C-Caspase-3 protein level and apoptotic rate of cells in each group(x±s) 组别 样本数 细胞凋亡率(%) C-Caspase-3 阴性对照组 3 2.98±0.23 0.26±0.03 sh-HULC组 3 22.61±3.26a 0.56±0.04a 单纯照射组 3 26.14±2.81b 0.69±0.06b 照射+sh-HULC组 3 36.21±3.26cd 1.03±0.08cd F值 79.604 97.696 P值 0.000 0.000 注：与阴性对照组比较，at=8.898、6.573, bt=10.498、9.421, P < 0.05;c与sh-HULC组比，t=6.164、10.297, P < 0.05；d与单纯照射组比，t=4.564、7.449, P < 0.05

表 2 各组细胞C-Caspase-3蛋白水平和凋亡率(x±s) Table 2 C-Caspase-3 protein level and apoptotic rate of cells in each group(x±s)

4. HULC shRNA慢病毒协同放射促进细胞线粒体释放Cyt-C：HULC shRNA慢病毒感染和放射处理后的骨肉瘤细胞细胞质中Cyt-C蛋白水平升高，差异有统计学意义(F=79.546、89.913，P < 0.05)，线粒体中Cyt-C蛋白水平降低，并且二者联合后，骨肉瘤细胞细胞质中Cyt-C蛋白水平升高更多，线粒体中Cyt-C蛋白水平降低更多，差异均有统计学意义(F=79.546、89.913，P < 0.05)。具有协同作用。下调HULC能够协同放射共同促进骨肉瘤细胞线粒体中Cyt-C释放(图 3和表 3)。

注：1.阴性对照组；2.sh-HULC组；3.单纯照射组；4.照射+ sh-HULC组 图 3 各组细胞胞质和线粒体中Cyt-C蛋白表达   A.线粒体；B.细胞质 Figure 3 Western blot assay of Cyt-C protein expression in cytoplasm and mitochondria of each group   A. Mitochondria; B. Cytoplasm

表 3(Table 3)

表 3 各组细胞胞质和线粒体中Cyt-C蛋白变化(x±s) Table 3 Cyt-C protein changes in cytoplasm and mitochondria of cells in each group(x±s) 组别 样本数 细胞质 线粒体 阴性对照组 3 0.28±0.03 0.98±0.10 sh-HULC组 3 0.48±0.06a 0.49±0.03a 单纯照射组 3 0.50±0.04b 0.43±0.05b 照射+sh-HULC组 3 1.13±0.12cd 0.22±0.02cd F值 79.546 89.913 P值 0.000 0.000 注：与阴性对照组比较，at=3.422、10.217, P < 0.05, bt=3.764、11.468, P < 0.05;与sh-HULC组比较，ct=11.120、5.630, P < 0.05；与单纯照射组比较，dt=10.778、4.379, P < 0.05

表 3 各组细胞胞质和线粒体中Cyt-C蛋白变化(x±s) Table 3 Cyt-C protein changes in cytoplasm and mitochondria of cells in each group(x±s)

5. HULC shRNA慢病毒提高细胞放射敏感性：HULC shRNA慢病毒感染后的骨肉瘤细胞经过2、4、6和8 Gy X射线剂量照射处理以后，细胞存活分数降低，计算其放射增敏比为1.432，HULC shRNA可以提高骨肉瘤细胞放射敏感性，见图 4。

图 4 不同剂量照射后骨肉瘤细胞的存活曲线 Figure 4 Survival curve of osteosarcoma cells after different doses of irradiation

LncRNA因缺乏开放阅读框而不能编码蛋白质，其通常是由RNA聚合酶Ⅱ转录形成的，LncRNA一致被认为是人类基因组的“噪音”，随着人们对LncRNA不断的研究发现人体中80%的LncRNA有生物学特性，分别在人体正常生理和病理过程中发挥作用^[8-10]。HULC作为一种LncRNA与肿瘤的发生密切相关，在胰腺癌、结直肠癌、胶质瘤等肿瘤中发现HULC异常高表达与肿瘤患者的分期、预后等有关，并且干扰癌细胞中HULC表达，细胞增殖能力降低，HULC在肿瘤发生中可能发挥促进作用^[11-12]。之前在骨肉瘤中的研究报道显示，HULC高表达与肿瘤的恶性进展密切相关^[6]。本研究中，在体外骨肉瘤细胞中发现下调HULC可以抑制骨肉瘤细胞增殖、阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡，这进一步证实了HULC在骨肉瘤细胞生物学特性中的作用，HULC可能是骨肉瘤恶性发现的促进因子，这与上述的研究结果相符合。

在前列腺癌细胞中发现HULC具有抗肿瘤细胞辐射的作用，HULC还与肿瘤放射敏感性有关^[13]。本研究结果显示，下调HULC具有协同放射阻滞骨肉瘤细胞周期、抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡的作用，并且下调HULC后的骨肉瘤细胞放射敏感性增加，证实了HULC在骨肉瘤细胞放射敏感性中的作用，靶向抑制HULC可能是增强骨肉瘤患者放射敏感性的途径，这与上述前列腺癌中的研究相符。

细胞生物学特性的发挥受到细胞内多种蛋白的表达调控作用。细胞周期有序进展是细胞增殖的基础，p21是细胞周期抑制因子，Cyclin D1可以促进细胞从G₁期向S期转变，Cyclin D1表达减少能够将细胞周期阻滞在G₁期^[14-16]。Caspase-3是Caspase凋亡反应的效应因子，其活化生成C-Caspase-3是细胞凋亡进入不可逆阶段的标志^[17-19]。正常情况下Cyt-C多存在于线粒体中，其在受到细胞凋亡信号刺激以后可以穿过线粒体膜进入细胞质中，细胞质中的Cyt-C可以激活Caspase凋亡反应，从而诱导细胞凋亡发生^[20-22]。本研究结果证实下调HULC可以协同放射共同促进骨肉瘤细胞中C-Caspase-3、p21表达，减少细胞中Cyclin D1表达，并且下调HULC还可以诱导骨肉瘤细胞线粒体中Cyt-C进入细胞质，这提示下调HULC提高骨肉瘤细胞放射敏感性可能与调控p21、Cyclin D1阻滞细胞周期和促进线粒体释放Cyt-C诱导细胞凋亡有关。

总之，靶向下调HULC可能是提高骨肉瘤患者生存质量的潜在途径，下调HULC可以在体外阻滞细胞周期并诱导细胞凋亡，提高细胞放射敏感性，目前对于其作用机制的研究尚处于初级阶段，在以后的实验中会进行验证和探讨。本研究结果明确了HULC在骨肉瘤放射敏感性中的作用，为研究HULC在骨肉瘤中的作用机制提供了参考。