2019, Vol. 39
胰腺癌是常见的消化道恶性肿瘤，其发病率呈逐年上升趋势，居我国恶性肿瘤第10位；胰腺癌经确诊后，5年存活率低于8%，是预后效果最差的恶性肿瘤之一[1-2]。在胰腺癌的临床治疗中，虽然手术切除提高了其总生存率，但术后感染及由于胰腺癌转移引起的术后复发较多；且晚期胰腺癌已无法经手术切除进行治疗，此时，放射治疗成为备受关注的治疗手段[3-4]。然而，患者在治疗过程中出现的放射敏感性降低影响了放疗效果，故提高胰腺癌放射敏感性是改善胰腺癌治疗现状的重要问题。
长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)为超过200个核苷酸序列组成的非编码RNA[5]。研究表明，LncRNA可作为一种竞争性的内源性RNA，与非编码miRNA交互作用，共同参与靶向基因的调控，对肿瘤的发生与发展过程产生重要影响[6]。多项研究表明，lncRNA能够调控肿瘤细胞增殖、凋亡及耐药性和放射敏感性[7-9]。结肠癌相关转录因子1(colon cancer associated transeript1, CCAT1)是近年新发现的一种lncRNA，其在胃癌、肺癌等多种肿瘤组织中高表达，参与肿瘤的发生发展[10]，但在肿瘤放射敏感性方面的研究较少。目前，关于CCAT1及其下游靶miRNA对胰腺癌放射敏感性的研究尚未报道，本研究通过检测胰腺癌组织及其细胞系中CCAT1表达，射线照射后沉默CCAT1表达对PANC-1细胞凋亡及Caspase 3活性的影响，探讨CCAT1对胰腺癌放射敏感性的作用及其潜在机制。
材料与方法1.细胞来源：收集2014年7月至2017年8月就诊于本院并确诊为胰腺癌的患者56例。参考RSI模型[11], 设置放射抗性组和放射敏感组。放射抗性组为原发肿瘤或发生转移不完全消退>3个月的患者及放射治疗后12个月内原发病灶或转移病灶两者均有局部复发的患者；放射敏感组为3个月内或局部复发性疾病结束放疗后12个月内未出现局部残留病变的患者。两组患者均于放疗后行手术切除，其中，放射敏感组32例，放射抵抗组24例。
hTERT-HPNE正常人胰腺导管上皮细胞和BxPC-3、AsPC-1、PANC-1人胰腺癌细胞系均购自中国科学院上海细胞库。
2.主要试剂及仪器：RPMI 1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶购自美国Hyclone公司；细胞培养箱购自美国Thermo公司；实时荧光定量PCR仪购自美国Life Technologies公司；Precise Clinac EX Primus直线加速器购自瑞典Elekta公司；Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪购自上海创萌生物科技有限公司；TRIzol总RNA提取试剂盒、Lipofectamine 2000转染试剂购自美国Invitrogen公司；Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒购自上海翊圣生物科技有限公司；Caspase 3活性检测试剂盒购自上海纪宁实业有限公司；荧光酶标仪购自上海艾研生物科技有限公司；RNA结合蛋白免疫沉淀实验检测试剂盒(RNA-binding protein immunoprecipitation kit)购自广州赛诚生物科技有限公司；CCAT1野生型及突变型载体购自北京本元正阳基因有限公司；所用引物由华大基因合成。
3.细胞培养与照射：hTERT-HPNE正常人胰腺导管上皮细胞和BxPC-3、AsPC-1、PANC-1人胰腺癌细胞系使用含5%胎牛血清的RPMI 1640培养液于5% CO2、37℃条件下培养，每隔3天传代1次。待PANC-1细胞生长至汇合度约85%，加入适量胰酶消化并重悬细胞，以3×105/孔接种于96孔培养板，常规培养12 h。使用Siemens Primus直线加速器6 MV X射线室温照射，吸收剂量率为3 Gy/min，以0、2、4、6、8 Gy垂直照射，射野10 cm×10 cm，源靶距30 cm，在照射后0、12、24、48 h分别检测细胞的存活分数。
4.细胞转染与分组：将PANC-1细胞以适量密度接种于6孔板，常规培养24 h，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书转染，将PANC-1细胞随机分为空白对照组(未作任何处理)，阴性对照组(转染si-RNA)，si-CCAT1-1(转染25 nmol/L量的si-CCAT1-1)、si-CCAT1-2组(转染50 nmol/L量的si-CCAT1-2)，过表达对照组(转染pcDNA)，过表达CCAT1组(转染pcDNA-CCAT1)，抑制miR-NC组(转染miR-NC)，抑制miR-130b-3p组(转染miR-130b-3p-inhibitor)，沉默CCAT1+抑制miR-NC组(共转染si-CCAT1-2和miR-NC)，沉默CCAT1+抑制miR-130b-3p组(共转染si-CCAT1-2和miR-130b-3p-inhibitor)；其中，阴性对照组、沉默CCAT1-2组、沉默CCAT1-2+抑制miR-NC组、沉默CCAT1-2+抑制miR-130b-3p组的部分PANC-1细胞，经2 Gy照射后培养48 h。
5. Real-time PCR检测CCAT1和miR-130b-3p表达：适量组织或细胞充分研磨，TRIzol法提取总RNA，使用Nanodrop ND-2000超微量核酸蛋白测定仪检测RNA浓度和纯度。调整RNA样品浓度，按照反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)说明书，将RNA反转录为cDNA，使用实时荧光定量试剂盒(日本TaKaRa公司)配制反应体系，进行PCR扩增。以GAPDH为内参，2-△△Ct法分析相对表达量，每个RNA样品重复3次，所用引物及序列见表 1。
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表 1 各种序列、载体的基本信息以及来源 Table 1 Basic information and sources of various sequences and vectors |
6.克隆形成实验：将转染后的PANC-1细胞分别以0、2、4、6、8 Gy照射后培养48 h，更换新鲜培养液，继续培养至肉眼可见克隆形成，吸除培养液。磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加入适量甲醇固定20 min，0.2%结晶紫染色10 min，计数≥50个细胞的克隆数。克隆形成率(%)=(克隆数/接种细胞数)×100%；细胞存活分数(SF2)=实验组克隆形成率/对照组克隆形成率；放射增敏比=沉默前细胞存活分数/沉默后细胞存活分数。使用GraphPad Prism 7软件进行单击多靶模型曲线拟合，计算准阈剂量(Dq)、平均致死剂量(D0)、存活分数(SF2)、放射增敏比(SER)。
7.细胞凋亡及Caspase 3活性检测：收集转染后2 Gy照射或未照射的各组PANC-1细胞，PBS洗涤并重悬细胞，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI溶液混匀，避光孵育15 min，立即用流式细胞检测。在各组PANC-1细胞中加入蛋白裂解液提取总蛋白，按照Caspase 3活性检测试剂盒加入适量Ac-DEVD-pNA，37℃避光反应2 h，荧光酶标仪检测400 nm处荧光度值。
8.生物信息学分析：通过starBase v2.0在线预测网站预测CCAT1与miR-130b-3p是否存在靶向结合位点。
9.双荧光素酶报告基因检测实验分析：取PANC-1细胞，按照Lipofectamine 2000转染试剂说明书分别将CCAT1-3′UTR野生型质粒和mimics NC或miR-130b-3p mimics共转染，将CCAT1-3′UTR突变型质粒和mimics NC或miR-130b-3p mimics共转染，培养48 h后加入裂解液裂解。4℃，12 000 r/min，离心直径420 mm，离心10 min，取上清，检测荧光素酶活性。
10. RNA结合蛋白免疫沉淀实验(RIP)：收集2×107个PANC-1细胞，加入等体积的RIP裂解液裂解细胞，离心12 000 r/min，离心直径420 mm，离心10 min，取上清。按照RIPTM RNA结合蛋白免疫沉淀反应试剂盒使用说明书，在含磁珠的EP管中加入900 μl RIP免疫沉淀缓冲液(含RNase抑制剂、蛋白酶抑制剂、DNase)和100 μl细胞裂解液，加入IgG抗体或Ago2抗体，4℃孵育过夜，离心12 000 r/min，离心直径420 mm，离心10 min，弃上清，500 μl RIP Wash Buffer洗涤6次后立即进行RNA纯化，15 μl DEPC水溶解纯化RNA，-80℃保存。未加抗体的为阳性对照(Input)组，加入IgG抗体的为阴性对照(anti-IgG)组，加入Ago2抗体的为实验(anti-Ago2)组。
11.统计学处理：使用GraphPad Prism 7和SPSS 22.0统计软件进行数据分析。实验数据符合正态分布，以x±s表示。多组间数据比较经方差齐性检验，采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q检验，两组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。
结果1.放射抵抗的胰腺癌组织中CCAT1与miR-130b-3p的表达：对比放射敏感的胰腺癌组织，放射抵抗的胰腺癌组织中CCAT1表达显著上调(t=6.748，P < 0.05)，miR-130b-3p表达显著下调(t=5.898，P < 0.05)，见图 1。
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注：aCCAT1与miR-130b-3p在两种组织中比较，t=6.748、5.898，P < 0.05 图 1 CCAT1(A)和miR-130b-3p(B)在放射敏感和放射抵抗的胰腺癌组织中的表达 Figure 1 Expression of CCAT1 (A) and miR-130b-3p (B) in radiation-sensitive and radiation-resistant pancreatic cancer tissues |
2.不同胰腺癌细胞系中CCAT1与miR-130b-3p的表达：结果示于图 4。由图 4可见，与hTERT-HPNE人胰腺导管细胞相比，人胰腺癌细胞系BxPC-3、AsPC-1、PANC-1细胞中CCAT1表达上调(t=6.822、7.814、8.555，P < 0.05)，PANC-1细胞中CCAT1相对表达水平最高，miR-130b-3p表达下调(t=15.465、17.057、18.795，P < 0.05)，PANC-1细胞中miR-130b-3p相对表达水平最低，见图 2。
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注：1.阴性对照组；2.沉默CCAT1-1组；3.沉默CCAT1-2组；4.阴性对照+照射组；5.沉默CCAT1-2+照射组。a与阴性对照组比较，t=15.465、18.082、2.929、5.047、5.234、5.125、13.033、10.440、14.578、6.561、5.233、11.775，P < 0.05；b与阴性对照+照射组比较，t=9.704、8.661，P < 0.05 图 4 沉默CCAT1增加PANC-1细胞的放射敏感性 A.沉默CCAT1后PANC-1细胞中CCAT1的表达；B.不同剂量照射后PANC-1细胞存活曲线；C.照射沉默CCAT1后PANC-1细胞的凋亡率；D.照射沉默CCAT1后PANC-1细胞中Caspase 3的活性 Figure 4 Silencing CCAT1 increases radiosensitivity of PANC-1 cells A. CCAT1 expression in PANC-1 cells after silencing CCAT1; B. PANC-1 cell survival curve after different doses of irradiation; C. Irradiation-induced apoptosis of PANC-1 cells after silencing CCAT1; D. Irradiation-induced activity of caspase 3 in PANC-1 cells after silencing CCAT1 |
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注：1.hTERT-HPNE; 2.BxPC-3；3.AsPC-1；4.PANC-1。与hTERT-HPNE细胞比较，at=6.822、7.814、8.555，P < 0.05；bt=15.465、17.057、18.795，P < 0.05 图 2 CCAT1(A)和miR-130b-3p(B)在不同胰腺癌细胞系中的相对表达水平 Figure 2 Relative expression levels of CCAT1 (A) and miR-130b-3p (B) in different pancreatic cancer cell lines |
3.照射PANC-1细胞后CCAT1表达上调miR-130b-3p表达下调：分别检测照射后0、12、24、48 h PANC-1细胞CCAT1和miR-130b-3p相对表达水平，发现与0 Gy比较，2 Gy照射后CCAT1表达上调(t=6.322、7.808、8.242，P < 0.05)，miR-130b-3p表达下调(t=3.950、8.412、10.453，P < 0.05)，且均呈时间依赖性，见图 3。
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注：与0 Gy比较，at=6.322、7.808、8.242，P < 0.05；bt=3.950、8.412、10.453，P < 0.05 图 3 X射线照射后不同时间CCAT1(A)和miR-130b-3p(B)的表达 Figure 3 Expression of CCAT1 (A) and miR-130b-3p (B) at different times after X-ray irradiation |
4.沉默CCAT1表达可增加PANC-1细胞放射敏感性：对比Scrambled组，转染si-CCAT1-1和si-CCAT1-2的PANC-1细胞中CCAT1表达下调(t=15.465、18.082，P < 0.05)，且si-CCAT1-2组低于si-CCAT1-1组，因此，选取si-CCAT1-2进行后续实验。以不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)照射转染Scrambled siRNA和si-CCAT1-2的PANC-1细胞，细胞存活分数减小，呈剂量依赖性，且si-CCAT1-2组低于Scrambled组(t=2.929、5.047、5.234、5.125，P < 0.05)。2 Gy照射PANC-1细胞48 h后，细胞凋亡率增加(t=9.704，P < 0.05)，细胞中Caspase 3活性升高(t=8.661，P < 0.05)。
单击多靶模型参数列于表 2，沉默CCAT1表达可增强PANC-1细胞放射敏感性。
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表 2 PANC-1细胞辐射敏感性相关参数 Table 2 Radiation sensitivity related parameters of PANC-1 cell survival curves |
5. CCAT1可负调控miR-130b-3p表达：结果示于图 5。由图 5可见，starBase v2.0在线预测结果显示，CCAT1与miR-130b-3p存在结合位点。对比miR-NC组，转染miR-130b-3p模拟物的CCTA1-WT载体荧光酶活性降低(t=9.665, P < 0.05)，而CCTA1-Mut载体荧光酶活性无明显变化。RIP实验结果如图 5C所示，对比anti-lgG组，anti-Ago2组和Input组都有CCAT1和miR-130b-3p富集(t=25.843, P < 0.05)，且Input组高于anti-Ago2组(t=29.390, P < 0.05)。进一步检测CCAT1与miR-130b-3p表达的相关性，发现沉默CCAT1，miR-130b-3p表达上调(t=9.393, P < 0.05)，过表达CCAT1，则miR-130b-3p表达下调(t=9.649, P < 0.05)，CCAT1可负调控miR-130b-3p表达。
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注：1.空白对照组；2.阴性对照组；3.沉默CCAT1-2组；4.过表达对照组；5.过表达CCAT1组。a与过表达miR-NC组比较，t=9.665，P < 0.05；b与抗IgG组比较，t=25.843、29.390，P < 0.05；c与阴性对照组比较，t=9.393，P < 0.05；d与过表达对照组比较，t=9.649，P < 0.05 图 5 CCAT1可负调控miR-130b-3p表达 A.互补序列；B.双荧光素酶报告基因检测实验结果；C.RIP实验结果；D.CCAT1对PANC-1细胞中miR-130b-3p表达的影响 Figure 5 CCAT1 can negatively regulate miR-130b-3p expression A. Complementary sequence; B. Double luciferase reporter gene test; C. RIP test; D. Effect of CCAT1 on the expression of miR-130b-3p in PANC-1 cells |
6. CCAT1通过miR-130b-3p调控胰腺癌细胞的放射敏感性：结果示于图 6。由图 6可见，转染miR-130b-3p抑制剂，miR-130b-3p-inhibitor组中miR-130b-3p表达低于miR-NC-inhibitor组(t=18.649, P < 0.05)。MTT法检测细胞存活率，发现不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)照射PANC-1细胞，各组细胞存活率剂量依赖性降低(t=2.929、5.047、5.234、5.125, P < 0.05)；对比Scrambled组，si-CCAT1-2+miR-130b-3p-inhibitor组细胞存活率无明显变化(P>0.05)，而si-CCAT1-2组和si-CCAT1-2+miR-NC-inhibitor组细胞存活率显著减小(t=6.953, P < 0.05)。2 Gy照射48后，各组细胞凋亡率较未照射的Scrambled组升高，Caspase 3活性升高；而照射的各组细胞中，沉默CCAT1表达后细胞凋亡率和Caspase 3活性高于Scrambled组(t=10.132、9.497, P < 0.05)，沉默CCAT1表达并抑制miR-130b-3p表达则细胞凋亡率和Caspase 3活性降低(t=6.953、6.836, P < 0.05)(图 6C、6D)。
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注：1.抑制miR-NC组；2.抑制miR-130b-3p组；3.阴性对照组；4.沉默CCAT1-2组；5.沉默CCAT1-2+抑制miR-NC组；6.沉默CCAT1-2+抑制miR-130b-3p组。a与抑制miR-NC组比较，t=18.649，P < 0.05；b与阴性对照组比较，t=2.929、5.047、5.234、5.125、10.132、9.497，P < 0.05；c与沉默CCAT1-2+抑制miR-NC组比较，t=4.564、6.736、8.656、6.953、6.836，P < 0.05 图 6 CCAT1调控miR-130b-3p影响胰腺癌细胞的放射敏感性 A.抑制miR-130b-3p后PANC-1细胞中miR-130b-3p的表达；B.抑制miR-130b-3p照射后PANC-1细胞存活曲线；C.抑制miR-130b-3p 2 Gy X射线照射后PANC-1细胞的凋亡率；D.抑制miR-130b-3p 2 Gy X射线照射后PANC-1细胞中Caspase 3的活性 Figure 6 CCAT1 regulates the radiosensitivity of miR-130b-3p in pancreatic cancer cells A. Expression of miR-130b-3p in PANC-1 cells after miR-130b-3p silence; B. Cell survival curve of PANC-1 cells after miR-130b-3p silence; C. Radiation-induced apoptosis of PANC-1 cells after miR- 130b-3p; D. Radiation-induced activity of Caspase 3 in PANC-1 cells after miR-130b-3p |
讨论
放射治疗是胰腺癌重要的治疗手段，能明显缓解患者的病痛，对于局部晚期胰腺癌患者尤其重要，可大大增加其生存率[12]。放射敏感性是胰腺癌放疗中的限制性因素，增加胰腺癌放射敏感性能有效改善其放疗效果，对胰腺癌的临床治疗具有重要意义。lncRNA发现之初被认为无生物学功能，随着学者的不断研究，发现lncRNA广泛参与细胞周期、细胞迁移、机体胁迫应答及肿瘤发生发展等十分重要的生理过程[13]。已有多项研究表明，lncRNA与肿瘤细胞放射敏感性有关，可用于肿瘤的诊断及治疗[14-15]。
CCAT1在结肠癌中首次被发现，其表达显著高于正常癌旁组织，过表达CCAT1可促进结肠癌细胞增殖和侵袭，诱导结肠癌的发生和转移[16-17]。在咽喉鳞状细胞癌组织中，CCAT1过表达可诱导N-钙黏蛋白和波形蛋白表达并抑制E-钙粘蛋白表达，促进癌细胞增殖和迁移，有助于咽喉鳞状细胞癌浸润和转移[18]。在肿瘤放射敏感性的研究中，已有研究表明，CCAT1可负调控miR-148b表达降低乳腺癌细胞存活率和Caspase 3活性，提高乳腺癌细胞的放射敏感性[19]；下调CCAT1表达能够抑制宫颈癌细胞增殖，增强肿瘤放射敏感性[20]。但CCAT1在胰腺癌放射敏感性中的作用及其潜在机制，尚少见文献报道。本研究检测了放射敏感和放射抵抗的胰腺癌组织中CCAT1表达，结果显示，CCAT1在放射抵抗的胰腺癌组织中表达显著上调；对比人胰腺导管细胞，CCAT1在人胰腺癌细胞系中表达上调。为进一步研究CCAT1与PANC-1人胰腺癌细胞放射敏感性的关系，以2 Gy照射PANC-1细胞后培养分别培养0、12、24、48 h并检测CCAT1在其中的相对表达水平，发现CCAT1的表达呈时间依赖性上调。以PANC-1细胞为研究对象，沉默CCAT1表达并给予2 Gy辐射照射后，细胞凋亡率增加，Caspase 3活性增强；单击多靶模型参数显示SER放射增敏比为1.641，表明沉默CCAT1表达可增强PANC-1细胞放射敏感性。
微小RNA(microRNA，miRNA)能够与靶mRNA互补结合，调控靶基因表达，参与细胞凋亡、分化、个体发育等生物过程[21]，并且与肿瘤放射敏感性密切相关。多项研究表明，miRNA可通过调节下游靶基因影响肿瘤放射敏感性[22-24]。miR-130b-3p是miR-130家族的一员，在膀胱癌组织中高表达，可通过抑制PI3K-AKT和整合素β1/ FAK信号通路，抑制癌细胞增殖、迁移和侵袭，并诱导凋亡，对膀胱癌的发生发展有抑制作用[25]；在乳腺癌中，miR-130b-3p可靶向调节Notch配体Delta-like 1，从而抑制癌细胞迁移和侵袭，是人乳腺癌转移的潜在靶标[26]。然而，关于miR-130b-3p对肿瘤放射敏感性的影响及其在胰腺癌中的作用，目前仍未报道。本研究通过starBase v2.0在线预测，发现miR-130b-3p 3′-UTR上存在CCAT1的结合位点，采用荧光素酶报告基因及RIP实验进一步验证，表明CCAT1可负调控miR-130b-3p表达。Real-time PCR实验结果显示，miR-130b-3p在放射抵抗胰腺癌组织及胰腺癌细胞系中表达下调；抑制miR-130b-3p可逆转下调CCAT1促进PANC-1细胞凋亡、增强Caspase 3活性及细胞放射敏感性的作用。
基于以上报道及本文研究，表明沉默CCAT1能够促进miR-130b-3p表达，促进PANC-1人胰腺癌细胞凋亡，降低细胞存活分数，增强Caspase 3活性，从而使PANC-1人胰腺癌细胞放射敏感性提高。以上研究结果可能为胰腺癌的放射治疗提供新靶点。
利益冲突 无作者贡献声明 宋锐撰写论文；袁金金负责数据分析；杨军、柴婷负责实验操作；陈晓娟、刘宗文负责实验设计；侯歌、王成提供研究所用新试剂及分析工具
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