2019, Vol. 39
2. 郑州大学第五附属医院放疗科 450000;
3. 郑州大学第五附属医院肿瘤科 450000
2. Department of Radiotherapy, The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China;
3. Department of Oncology, The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China
恶性胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是中枢神经系统中最常见的原发性肿瘤，约占所有脑和中枢神经系统肿瘤的30%[1]。根治性手术、放疗和化疗是临床治疗GBM常用的方法，尽管在一定程度上改善了患者病情，但对GBM患者的治疗效果较差，且极易产生不良预后[2-4]。据相关统计显示，GBM患者确诊后的中位生存时间仅为4.9个月[5]，而放疗耐受性的产生是导致GBM失败的主要原因[6]。鉴于临床中还缺乏有效的方法提高GBM细胞对放疗的敏感性，因此，迫切需要对GBM辐射治疗抗性产生的潜在机制进行深入研究，为开发新的放射增敏剂提供理论支持。
近年来，miR-124在肿瘤放疗及化疗敏感性中的作用广泛被报道[7-8]，然而，miR-124在GBM放射敏感性中的功能和调控机制还有待深入研究。本研究通过建立辐射抗性GBM细胞模型，分析miR-124在辐射抗性细胞中的表达及对肿瘤细胞放射敏感性的影响，并通过对miR-124下游靶基因进行预测，进一步探究miR-124调控GBM细胞放射敏感性的作用机制，为放疗耐受GBM患者的临床治疗提供新的生物靶点。
材料与方法1.材料：人脑胶质瘤细胞LN229和人肾上皮细胞293T(美国ATCC细胞库)、胎牛血清、RPMI 1640培养基、胰蛋白酶(美国GIBCO公司)；脂质体2000试剂、2xSYBR green master mix(美国Invitrogen公司)；miRNA First-Stand cDNA Synthesis Kit(美国GeneCopoeia公司)；Annexin V-FITC/PC双染流式细胞凋亡检测试剂盒；定点突变试剂盒(北京TaKaRa公司)；二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒、增强的化学发光(ECL)试剂、Dual Luciferase® Reporter Assay System试剂盒(美国Promega公司)；STAT3、β-肌动蛋白抗体、小鼠抗人二抗(美国Santa Cruz公司)。
2.实验方法：细胞培养和抗放射性细胞建立293T和LN229细胞培养在含10%胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养基中，并置于37℃、5% CO2的恒温培养箱中培养。每2天更换一次培养基，待细胞汇合度达85%以上时弃去培养基，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤后加入胰蛋白酶消化。将细胞悬液转移到新的离心管中，1 000 r/min，离心半径8 cm，离心5 min后弃去上清，加入完全培养基重悬细胞。在细胞处于对数生长期时，给予一定剂量的X射线照射，之后换液，继续培养并密切观察细胞状态进行传代，待细胞状态恢复良好后，进行下一次照射，重复以上操作，并逐渐加大每次的照射剂量，直到成功构建具有稳定遗传特性的放射抵抗细胞株LN229R。
3.细胞转染：miR-124模拟物(miR-124)及阴性对照(miR-NC)、STAT3重组过表达质粒(STAT3)由上海GenePharma公司合成。将培养至对数生长期的LN229R接种于6孔板中，采用脂质体转染法将上述寡核苷酸或质粒转染到细胞中。
4. qRT-PCR检测mRNA和miRNA表达：采用TRIzol法提取细胞中的总RNA，利用miRNA First-Stand cDNA Synthesis Kit将miRNA反转录成互补的cDNA，U6 snRNA作为内参基因。反转录引物序列如下：miR-124，5′ GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACCGGCATT 3′；U6，5′ GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTATGGAAC 3′。以反转录生成的cDNA为模板，按照RT-PCR试剂盒说明进行扩增，反应结束后根据标准曲线和Ct值计算miR-124相对表达水平，用2-ΔΔCt表示。qRT-PCR引物序列如下：miR-124，正义5′GCTAAGGCACGCGGTG 3′和反义5′GTGCAGGGTCCGAGGT 3′；U6，正义5′ TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAGC 3′和反义5′ CCAGTGCAGGGTCCGAGGT 3′。
5.克隆形成实验分析细胞的放射敏感性：将转染后48 h的细胞接种至6 cm的培养皿中，分别给予0 Gy(对照组)、2、4、6、8 Gy 5个不同剂量的X射线照射，每组剂量点设3个重复样本。照射结束后继续培养细胞14 d，用1%结晶紫染液对细胞进行染色后，倒置显微镜下计数50个细胞以上的克隆数，并计算克隆形成率(PE)。再根据PE计算细胞的存活率(SF)，SF=照射组PE/对照组PE×100%。根据不同剂量存活率均值，采用单击多靶模型进行曲线拟合，利用Graphpad 5.0软件绘制存活曲线，得出平均致死剂量(D0)、外推值(N)、准阈剂量(Dq)、SF2和放射增敏比(SER)值。
6.流式细胞术测细胞凋亡：转染后48 h用胰蛋白酶消化细胞，调整细胞密度为1×105/ml接种于6孔板中，1 000 r/min，离心半径8 cm，离心5 min后弃去上清，PBS洗涤3次，加入100 μl的结合缓冲液重悬细胞，之后依次加入5 μl的Annexin V和PI染色，在流式细胞仪上分析细胞凋亡情况。
7.双荧光素酶报告分析：本研究首先利用TargetScan软件预测发现在STAT3 3′UTR区域中1302~1309位点处存在与miR-124互补结合的核苷酸。为进一步验证miR-124与STAT3的靶向关系，扩增了STAT3 3′UTR中含miR-124结合位点的序列，并克隆到pGL3-basic荧光素酶质粒中构建野生型STAT3(STAT3-WT)重组质粒。使用点突变试剂盒突变STAT3-WT上的miR-124结合位点，构建突变型STAT3(STAT3-MUT)重组质粒。培养293T细胞并接种于24孔板中，待细胞汇合度达85%时，按照脂质体2000试剂操作步骤将STAT3-WT或STAT3-MUT报告质粒与miR-124、miR-NC、anti-miR-124或anti-miR-NC共转染到293T细胞中，48 h后利用Dual Luciferase® Reporter Assay System检测STAT3-WT或STAT3-MUT报告质粒的荧光素酶活性。
8. Western blot检测蛋白表达：转染后48 h收集LN229R细胞，加入RIPA裂解液裂解细胞，12 000 r/min，离心半径8 cm，离心10 min后取上清，利用BCA蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。用10% SDS-PAGE电泳分离蛋白，并转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，加入5%的脱脂奶粉于4℃条件下过夜封闭，之后加入STAT3和β-肌动蛋白抗体在37℃条件下孵育2 h，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤3次，加入相应二抗孵育，后采用ECL试剂进行显影，采用Image J软件分析各组细胞中STAT3蛋白的相对表达量。
9.主要观察指标：miR-124对LN229R放射敏感性的影响；miR-124与STAT3靶向关系分析以及miR-124调控LN229R细胞放射敏感性的作用机制。
10.统计学处理：实验数据符合正态分布，用x±s表示。采用SPSS 20.0软件进行分析。两组数据间比较符合正态分布，采用独立样本t检验；多组比较经方差齐性检验采用单因素方差分析，组间比较采用SNK-q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1. miR-124在化疗敏感和耐受的LN229R细胞中的表达：采用克隆形成实验对LN229R的放射敏感性进行分析，在8 Gy的放射剂量下，LN229R细胞的存活分数(0.036±0.005 0)显著高于LN229组(0.008±0.000 7)，差异有统计学意义(t=4.762，P＜0.05)，曲线参数D0、Dq、SF2值均升高(表 1)，说明LN229R细胞具有较强的放射耐受性。采用qRT-PCR检测LN229和LN229R细胞中miR-124的表达水平。LN229R细胞中的miR-124的表达水平(0.32±0.03)显著低于LN229组(1.02±0.09)，差异有统计学意义(t=12.780，P＜0.05)。由此证实miR-124可能参与调控LN229细胞对放射的敏感性。
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表 1 放射敏感和耐受的LN229细胞在不同放射剂量下的拟合曲线的参数值 Table 1 The parameters of survival curves of LN229 and LN229R cells after radiation |
2.过表达miR-124对LN229R细胞放射敏感性和细胞凋亡率的影响：为进一步研究miR-124对LN229R细胞放射敏感性的影响，首先将miR-NC和miR-124模拟物转染到细胞中，采用qRT-PCR对转染效率进行评估。结果显示，miR-124模拟物转染组细胞中miR-124的表达水平(4.02±0.39)显著高于miR-NC转染组(0.95±0.06)，差异有统计学意义(t=13.476，P＜0.05)，说明通过转染miR-124模拟物可建立miR-124过表达细胞模型。之后采用克隆形成实验对克隆形成数据进行曲线拟合发现，与miR-NC转染组相比，辐射剂量为8 Gy时，miR-124过表达可明显降低LN229R细胞的存活率[(0.033±0.005 0)vs.(0.003±0.000 4)，t=5.655，P＜0.05, 图 1]，曲线参数D0、Dq、SF2值均降低(表 2)。流式细胞术检测结果显示，与miR-NC组相比，miR-124过表达组细胞凋亡率明显升高[(4.69±0.51)% vs.(22.34±2.42)%，t=12.361，P＜0.05，图 1]。以上结果证实，miR-124过表达可增强LN229R细胞对放射的敏感性。
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注：a照射剂量为8 Gy时，与miR-NC组相比，t=5.655，P＜0.05 图 1 miR-124过表达对LN229R细胞放射敏感性的影响 A.细胞克隆存活率；B.细胞凋亡 Figure 1 The effect of miR-124 on LN229R cells radiosensitivity A.Cell survival; B.Cell apoptosis |
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表 2 miR-124过表达对克隆形成实验拟合曲线参数值的影响 Table 2 The effect of miR-124 overexpression on the parameters of survival curves derived from clone formation experiment |
3. miR-124与STAT3靶向关系验证：利用TargetScan软件预测发现在STAT3 3′UTR区域中1302~1309位点处存在与miR-124互补结合的核苷酸(图 2)。采用双荧光素酶报告分析验证miR-124和STAT3的靶向关系，与miR-NC组相比，miR-124过表达显著抑制了STAT3-WT荧光素酶活性[(0.98±0.07)vs.(0.38±0.04)，t=12.890，P＜0.05]，但对STAT3-MUT荧光素酶活性无影响(P＞0.05)；与anti-miR-NC组相比，miR-124抑制显著促进了STAT3-WT荧光素酶活性[(1.04±0.08)vs.(3.52±0.34)，t=12.298，P＜0.05]，但对STAT3-MUT荧光素酶活性无影响(P＞0.05)。由此得知，miR-124能够与STAT3靶向结合。
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图 2 miR-124与STAT3的靶向结合序列 Figure 2 The targeting sites between miR-124 and STAT3 |
4. miR-124对STAT3蛋白表达的调控：为研究STAT3能否参与调控LN229R细胞的放射敏感性，首先采用Western blot对放射敏感和耐受细胞中STAT3蛋白表达水平进行测定，STAT3在LN229R细胞中的蛋白表达水平显著高于LN229细胞[(2.69±0.31)vs.(1.04±0.07)，t=8.993，P＜0.05]，由此初步证实STAT3可能参与调控LN229细胞的放射敏感性。之后进一步探究了miR-124对STAT3蛋白表达的调控，与miR-NC组相比，外源过表达miR-124显著抑制STAT3蛋白表达[(0.96±0.08)vs.(0.37±0.04)，t=11.425，P＜0.05]；相反，与anti-miR-NC组(0.97±0.03)相比，下调miR-124明显促进了STAT3蛋白表达[(1.01±0.09)vs.(2.42±0.28)，t=8.304，P＜0.05]。以上结果证明，STAT3在LN229R细胞中高表达，且miR-124可负调控STAT3蛋白表达。
5. STAT3逆转miR-124对LN229R细胞的放射增敏作用：采用Western blot法测定STAT3表达，与pcDNA转染组相比，STAT3转染可显著增加STAT3蛋白表达，说明STAT3可用于之后的过表达功能分析[(1.01±0.02)vs.(2.56±0.14)，t=10.6，P＜0.05]。利用克隆形成实验对克隆形成数据进行生存曲线拟合，结果如图 3所示，与pcDNA组相比，在8 Gy照射剂量下，STAT3过表达可显著增加LN229R细胞的存活分数[(0.041±0.005)vs.(0.085±0.005)，t=10.6，P＜0.05]，且曲线参数D0、Dq、SF2均升高(表 3)，说明STAT3过表达可降低LN229R细胞对放射的敏感性。为进一步研究miR-124是否通过靶向抑制STAT3表达发挥放射增敏作用，分别将miR-124、miR-124+pcDNA和miR-124+STAT3转染到LN229R细胞中，采用qRT-PCR法测定各组细胞中STAT3蛋白表达水平，与miR-123+pcDNA组相比，STAT3转染可逆转miR-124对LN229R细胞中STAT3表达的抑制作用[(1.06±0.05)vs.(3.26±0.17)，t=6.141，P＜0.05]。利用克隆形成实验对克隆形成数据进行生存曲线拟合，结果如图 3所示，与miR-124+pcDNA组相比，外源回补STAT3显著增加了LN229R细胞的存活分数[(0.002±0.001)vs.(0.051±0.005)，t=9.246，P＜0.05](图 3)，且曲线参数D0、Dq、SF2均升高(表 4)。以上结果证实，外源回补STAT3可逆转miR-124对LN229R细胞的放射增敏作用，由此说明，miR-124通过靶向抑制STAT3表达改善了LN229R细胞对放射的敏感性。
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注：照射剂量为8 Gy时，a与pcDNA组相比，t=10.6，P＜0.05；b与miR-124+pcDNA组相比，t=9.246，P＜0.05 图 3 外源回补STAT3对LN229R细胞放射敏感性(A)及STAT3对miR-124改善的LN229R细胞放射敏感性(B)的影响 Figure 3 The effects of STAT3 on the radiosensitivity of LN229R cells (A) and miR-124-transfected LN229R cells (B) |
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表 3 上调STAT3对克隆形成实验拟合曲线的参数值的影响 Table 3 The effect of STAT3 overexpression on parameter value of curve derived from clone formation experiment |
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表 4 上调STAT3对miR-124降低的克隆形成实验拟合曲线的参数值的影响 Table 4 The effect of STAT3 overexpression on the parameters of survival curve of miR-124 transfected cells derived from clone formation experiment |
讨论
放疗在脑肿瘤的治疗中发挥着核心作用，在过去几十年，手术辅助放疗是临床中对GBM患者进行治疗的标准方法。尽管放射疗法及各种新型化疗药物的临床应用提高了治疗效果，但患者的生存率仍然较低，其中放疗抵抗被认为是导致GBM治疗失败的原因之一，因此，有必要寻找一种新型的放疗增敏剂以提高GBM患者的临床治疗效果。随着分子生物学技术的不断发展，miRNAs在肿瘤放疗耐受性中的作用被广泛研究。如Zhen等[9]研究显示，在受照的GBM细胞中，miR-10b过表达通过促进细胞增殖并抑制凋亡增强肿瘤细胞对放射的耐受性；Guo等[10]证实，miR-26a通过靶向抑制ATM蛋白表达改善GBM细胞对放射敏感性，也预示了miR-26b可能作为潜在的生物靶点改善GBM患者的放射治疗效果。
微小RNA(microRNA，miRNA)是通过与靶基因的3′-非翻译区(3′-untranslated region，3′-UTR)完全或不完全互补结合调节基因表达的小非编码RNA[11]，在基因表达的调控中发挥重要的负调控作用[12]。miRNA可调节大约60%的蛋白质编码基因，并可通过调控细胞的生长、分化、凋亡以及细胞周期等在肿瘤发展中起重要作用。根据它们调控的基因或途径，miRNA可以在癌症中起肿瘤抑制剂或癌基因的作用，近年来，越来越多的证据表明miRNA可影响肿瘤细胞对化疗或放射的敏感性，这一发现也为GBM的临床诊断和治疗提供了新的思路[13-14]。miR-124最早被报道在神经元细胞中高度表达[15]，但之后的研究表明，该miRNA在多种癌症组织中(如结直肠癌[16]、乳腺癌[17]、口腔癌[18])均表现出明显的下调，并发挥抑癌活性。MiR-124是哺乳动物神经系统最具特征性的一种小分子RNA，在人类基因组中具有高度的保守性[19]。近年来研究表明，miR-124可通过调控肿瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、上皮-间质转化(EMT)等生物学过程参与肿瘤的发生发展，并发挥抑癌因子作用，在某些癌症中miR-124还可参与肿瘤化疗或放射抗性产生过程。如miR-124可通过靶向阻断EMT诱导剂PRRX1表达增强结肠直肠癌细胞的放射敏感性[20]；通过外源过表达miR-124可降低宫颈癌细胞的克隆形成及放射增敏比，促进放射后细胞的凋亡率，最终改善宫颈癌对放射的敏感性[21]。为研究miR-124对GBM患者放射敏感性的影响，在本研究中，首先对miR-124在LN229或LN229R细胞中的表达水平进行检测，结果显示，在LN229R细胞中miR-124的表达水平显著下调，由此初步证实miR-124可能参与GBM放射耐受性产生过程。进一步的功能分析揭示miR-124过表达可增强LN229R细胞的放射敏感性并生存并促进细胞凋亡。在之前的研究中，Deng等[22]证实，miR-124上调能够促进GBM细胞及小鼠移植瘤对放射的敏感性，该结论也与本研究结果相一致。
STAT3是研究较为广泛的致癌因子，在多种肿瘤组织和细胞中高表达。大量研究证实，STAT3的异常高表达可通过激活下游相关基因表达或诱导肿瘤细胞自噬，参与调控肿瘤的放射敏感性。例如，在受照的食管鳞状细胞癌细胞(ESCC)中，STAT3抑制剂stattic和NSC74859可通过抑制细胞增殖和集落形成，并促进细胞凋亡和DNA双链断裂改善ESCC的放射敏感性[23-24]；利用慢病毒干扰技术敲低STAT3可降低Bcl-2、VEGF和p53表达，最终增强喉鳞癌细胞对放射的敏感性[25]。为进一步研究miR-124是否通过调控下游靶基因表达诱导放射耐受的GBM细胞凋亡，并降低细胞生存率，进而影响肿瘤细胞对放射的敏感性，对miR-124的靶基因进行预测和分析，结果证实STAT3是miR-124的一个靶基因，且外源回补STAT3可逆转miR-124对细胞生存的抑制。
综上所述，miR-124在LN229R细胞中表达量降低；上调miR-124可通过靶向抑制STAT3改善GBM细胞的辐射敏感性，由此为GBM放射增敏的个性化治疗提供理论支持。
利益冲突 全体作者无利益冲突，排名无争议，未因进行该研究而接受任何不正当的职务和财务利益作者贡献声明 马建负责实验和论文撰写；王新军、付旭东负责数据统计；周少龙、田碧协助完成实验；闫琳参与研究设计与指导，提出修改意见
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