鼻咽癌常见于东南亚及我国南部地区，具有明显的人种易感性。由于鼻咽部解剖位置隐匿且首发症状缺乏特异性，大部分初治患者就诊时已进入中晚期^[1]。美国国立综合癌症网络(National Comprehensive Cancer Network，NCCN)指南已将诱导化疗加同步放化疗的治疗模式作为局部进展期鼻咽癌治疗的推荐研究模式, 多西紫杉醇+顺铂+5-氟尿嘧啶(TPF)方案作为诱导化疗的推荐。在临床中，常因受限于患者的不良反应，不得不减少化疗药物剂量或终止疗程。因此，寻找一种低毒、高效的治疗模式，是临床治疗中一个亟需解决的问题。时辰化疗根据人体生物节律的变化选择合适的用药时机，在不减轻药物疗效的同时减轻药物不良反应。近年来，调强放疗作为一种高精度的放疗手段已经在放疗领域取得了令人鼓舞的成绩，相比传统的二维放疗其5年总生存率(OS)从67.1%提高到80%以上，无局部复发生存率(LRFS)从83.8%提高到90.5%^[2]。多项研究的生存分析也提示5年局部控制率(LC)均>90%^[3-4]。本研究希望通过比较时辰化疗联合调强放射治疗是否比常规化疗能够在不降低药物疗效的同时减轻治疗相关不良反应，减轻化疗药物对淋巴免疫系统的抑制，为传统的化疗药物找到一种新的应用模式。

1.研究设计：本次前瞻性临床研究通过贵州医科大学附属医院/贵州省肿瘤医院伦理委员会认证，伦理编号(2015-03)。研究对象为本中心收治自2015年7月至2017年4月的159例初治局部进展期鼻咽癌患者(时辰化疗组79例，常规化疗组80例)，入组条件：①经病理确诊的局部进展期鼻咽癌患者[根据2010国际抗癌联盟(Union for International Cancer Control，UICC)分期标准，T_1~4，N_0~3，Ⅲ~Ⅳ_B期]，无远处转移的证据(M₀)。均有可测量的肿瘤病灶。②卡氏评分(KPS)≥70、美国东部肿瘤协作组(Eastern Cooperative Oncology Group, ECOG)体力状况评分标准≤2。③年龄18~70岁，性别不限。④无主要器官的功能障碍；骨髓造血功能无明显异常(白细胞≥4.0×10⁹/L，血小板≥100×10⁹/L，血红蛋白≥90 g/L)，肝功能正常(总胆红素、天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶升高≤1.5倍的正常值上限)，肾功能正常(肌酐≤1.5倍正常值上限)，心电图正常不影响治疗。⑤能理解本研究并已签署知情同意书。本研究入组的159例患者，2例患者因个人原因申请出组，157例患者纳入不良反应评估，27例患者因经济问题未完成治疗计划，最终130例患者纳入近期疗效分析。经χ²检验，时辰化疗组与常规化疗组性别、年龄、病理类型分布差异均无统计学意义(P>0.05, 表 1)。因此，时辰化疗组与常规化疗组具有可比性。

表 1(Table 1)

表 1 两组鼻咽癌患者基本临床特征比较 Table 1 Baseline between two groups in clinical characteristics 项目 时辰化疗组 常规化疗组 χ2值 P值 例数 构成比(%) 例数 构成比(%) 性别 0.002 0.969   男 57 74.0 59 73.8   女 20 26.0 21 26.3 年龄(岁) 0.001 0.974   < 45 31 40.3 32 40.0   ≥45 46 59.7 48 60.0 病理类型 2.666 0.264   非角化型癌 11 14.3 18 22.5   非角化未分化型癌 63 81.8 61 76.3   角化型癌 3 3.9 1 1.2 T分期 0.194 0.979   T1 2 2.6 2 2.4   T2 5 6.5 4 5.0   T3 15 19.5 15 18.8   T4 55 71.4 59 73.8 N分期 0.525 0.913   N0 5 6.5 7 8.8   N1 15 19.5 17 21.2   N2 38 49.3 39 48.8   N3 19 24.7 17 21.1

表 1 两组鼻咽癌患者基本临床特征比较 Table 1 Baseline between two groups in clinical characteristics

2.研究设计及样本量估计：设立时辰化疗组接受时辰化疗联合调强放射治疗(chronomodulated chemotherapy with radiotherapy，CCR)与常规化疗组接受常规化疗联合调强放疗(routine chemotherapy with radiotherapy，RCR)。采用非劣效性设计，假设常规化疗组不良反应发生率为38.7%，时辰化疗组较常规化疗组不良反应下降10%即28.7%, 设定非劣效性界值取0.05，检验水准α=0.05，检验效能为0.9，将上述数据输入PASS 11.0(Non-Inferiority Tests For Two Proportions模块)计算得到。

3.观察指标：①治疗期间出现的治疗相关不良反应，如口腔黏膜炎、胃肠道反应、骨髓抑制、肝功能损害、肾功能损害等。所有不良反应均通过常见不良反应事件评价标准(Common Terminology Criteria for Adverse Events，CTCAE 3.0)进行评估。②根据同步放化疗结束后3月内影像学检查评估近期疗效。③淋巴免疫功能变化。

4.治疗方案

(1) 化疗：时辰化疗组与常规化疗组均采用新辅助化疗+同步放化疗的治疗模式。时辰化疗组：新辅助化疗采用多西他赛(DOC)：75 mg/m²，静脉滴注，第1天(03 :30~04 :30)；顺铂(DDP)：75 mg/m²，持续静脉注射，第1~5天(10 :00~22 :00)；5-氟尿嘧啶(5-FU)：750 mg·m^-2·d^-1，持续静脉注射，第1~5天(22 :00~10 :00)。常规化疗组DOC：75 mg/m²，静脉滴注，第1天；DDP：75 mg/m²，静脉滴注，第1天；5-FU：750 mg·m^-2·d^-1，持续静脉泵入120 h，第1~5天，2周期新辅助化疗后(21~28 d/周期)即刻行同步放化疗治疗。同步放化疗期间，两组均采用顺铂同步化疗3周期(第1、22、43天)。时辰化疗组顺铂100 mg/m²，持续静脉注射，第1天(10 :00~22 :00)。常规化疗组顺铂100 mg/m²，静脉滴注，第1天。

(2) 放射治疗：由1名主任医师确定靶区和放疗计划。评价靶区及危及器官横断面的等剂量线适形分布情况，利用剂量体积直方图(DVH)进行评价达到计划要求，危及器官受量在限量范围内。所有入组病例均使用调强放射治疗(IMRT)，6 MV X射线，剂量：T_1~2 GTV_nx 69.96 Gy/33次；T_3~4 GTV_nx 73.92 Gy/33次，PTV_nx 69.96 Gy/33次，PGTV_nd 69.96 Gy/33次, PTV1 60.06 Gy/33次，PTV2 50.96 Gy/28次，1次/d，5次/周，全部放疗计划完成约7周。

5.结果与处理：疗效评价采用实体瘤疗效评价标准(Response Evaluation Criteria in Solid Tumours，RECIST 1.1)，通过同步放化疗结束后3个月内鼻咽部MRI、颈部CT等相关影像学检查及纤维鼻咽镜检对入组患者评价近期疗效，分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD)，有效率以(CR+PR)/可评价病例数计算，所有纳入近期疗效分析的病例需至少完成放射治疗T_3~4：GTV_nx(73.92 Gy/33次)× 80%=60.48 Gy/27次，T_1~2：GTV_nx(69.96 Gy/33次)× 80%=57.24 Gy/27次；化疗至少2周期TPF方案诱导化疗+2周期DDP同步化疗。治疗期间发生的不良反应，如恶心呕吐、骨髓抑制、放射性口腔黏膜炎、放射性皮炎等，使用国际不良反应标准(CTC v3.0)同步记录，并及时录入临床试验观察表(Case report form, CRF)。所有入组患者在治疗前1周、同步放化疗前1周、同步放化疗后1周内抽取外周静脉血行淋巴细胞亚群(CD3+、CD8+、CD4+、CD16++56+、CD19+、CD4+/CD8+)分析，治疗期间每周复查血常规、肝肾功能。其中，未完成总治疗计划的患者不纳入疗效统计分析，但作为可观察病例纳入治疗期间不良反应及免疫功能分析。

6.统计学处理：采用SPSS 22.0软件进行数据统计分析。计量资料用x±s或中位数(上下四分位数)表示，计数资料用例数(百分比)表示。T分期、N分期、性别、年龄、病理类型、有效率的组间比较采用χ²检验；近期疗效评价、白细胞减少、中性粒细胞减少、血红蛋白减少、血小板减少、呕吐、腹泻、口腔黏膜炎、天冬氨酸氨基转移酶升高、丙氨酸氨基转移酶升高、肌酐升高等不良反应、CD3+、CD8+、CD4+、CD16++56+、CD19+、CD4+/8+淋巴细胞等观察指标的数据经正态性检验，不满足正态分布特征，采用非参数检验(Mann-Whitney U检验)；CD3+、CD8+、CD4+、CD16++56+、CD19+、CD4+/8+淋巴细胞等指标诱导化疗前与同步放化疗后的比较采用相关样本Wilcoxon符号秩和检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.两组同步放化疗后近期疗效比较：时辰化疗组可评价病例数为60例，常规化疗组可评价病例数为70例。时辰化疗组CR 6例(10%), PR 52例(86.7%)，SD 2例(3.3%)，PD 0例(0%), 有效率96.7%；常规化疗组CR 13例(18.6%)，PR 56例(80%)，SD 0例(0%), PD 1例(1.4%)，有效率98.6%。有效数据经非参数检验(Mann-Whitney U检验)，时辰化疗组与常规化疗组“同步后疗效评价”CR、PR、SD、PD的分布组间差异无统计学意义(P>0.05)。进一步比较两组的有效率，差异无统计学意义(P>0.05)。

2.时辰化疗组与常规化疗组不良反应比较：时辰化疗组与常规化疗组血红蛋白降低、血小板减少、腹泻、天冬氨酸氨基转移酶升高、丙氨酸氨基转移酶升高、肌酐升高等不良反应发生情况组间差异均无统计学意义(P>0.05)；时辰化疗组与常规化疗组白细胞减少发生率分别为84.4%、92.5%，3级或3级以上白细胞减少的发生率分别为26.0%、42.5%；时辰化疗组与常规化疗组中性粒细胞减少发生率分别为81.9%、86.2%，3级或3级以上中性粒细胞减少发生率分别为33.8%、50%，白细胞减少、中性粒细胞减少在时辰化疗组的发生率低于常规化疗组(Z=-2.222、-1.999，P < 0.05)；在非血液学不良反应方面，呕吐在时辰化疗组与常规化疗组的发生率分别为85.7%、93.7%，两组均未发生4级呕吐，3级呕吐的发生率在时辰化疗组与常规化疗组分别为5.2%、15.0%；口腔黏膜炎的发生率在两组分别为63.6%、83.7%，两组均未发生4级口腔黏膜炎，呕吐与口腔黏膜炎在两组的差异具有统计学意义(Z=-2.298、-3.571，P < 0.05, 表 2)。

表 2(Table 2)

表 2 两组鼻咽癌患者不良反应比较 Table 2 Adverse events of two groups patients with nasopharyngeal carcinoma 组别 例数 白细胞减少 中性粒细胞减少 呕吐 口腔黏膜炎 0级 1级 2级 3级 4级 0级 1级 2级 3级 4级 0级 1级 2级 3级 0级 1级 2级 3级 CCR组 77 12 13 32 13 7 14 17 20 16 10 11 23 39 4 28 15 31 3 RCR组 80 6 11 29 24 10 11 10 19 25 15 5 20 43 12 13 12 43 12 Z值 -2.222 -1.999 -2.298 -3.571 P值 0.026 0.046 0.022 0.001 注：CCR.时辰化疗；RCR.常规化疗

表 2 两组鼻咽癌患者不良反应比较 Table 2 Adverse events of two groups patients with nasopharyngeal carcinoma

3.组间及组内前后CD8+、CD4+、CD16++56+、CD4+/8+淋巴细胞计数比较：化疗前时辰化疗组与常规化疗组CD8+、CD4+、CD16++56+、CD4+/8+淋巴细胞计数在时辰化疗组与常规化疗组之间的组间差异均无统计学意义(P>0.05)；同步放化疗后CD4+、CD4+/8+、CD8+淋巴细胞计数在时辰化疗组与常规化疗组之间的组间差异均无统计学意义(P>0.05)，但同步放化疗后时辰化疗组CD16++56+淋巴细胞计数高于常规化疗组，差异有统计学意义(Z=-2.332，P < 0.05)。经相关样本Wilcoxon符号秩和检验，时辰化疗组与常规化疗组同期放化疗后CD8+、CD4+、CD16++56+、CD4+/8+淋巴细胞计数等指标与治疗前相比均有下降，差异有统计学意义(Z=-6.438~-0.283, P < 0.05)，见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 两组鼻咽癌患者诱导化疗前及同步放化疗后淋巴细胞亚群比较 Table 3 Lymphocyte immune functionof two groups patients with nasopharyngeal carcinoma before induction chemotherapy andafterconcurrent chemo-radiotherapy 组别 例数 CD8+ CD4+ CD16++56+ CD4+/8+ 中位数 四分位数 中位数 四分位数 中位数 四分位数 中位数 四分位数 CCR组 58   治疗前 426 347, 558 619 481, 851 241 185, 325 1.46 0.96, 1.96   治疗后 153a 90, 291 168a 112, 267 137a 85, 233 1.16a 0.79, 1.64 RCR组 62   治疗前 395 317, 508 440, 768 161, 338 1.14, 2.17   治疗后 174b 76, 276 152b 91, 231 96bc 56, 179 1.03b 0.74, 1.54 注：CCR.时辰化疗；RCR.常规化疗。a与本组治疗前比较，Z=-6.438、-5.842、-4.316、-0.283，P < 0.05；b与本组治疗前比较，Z=-6.236、-5.640、-5.626、-4.425，P < 0.05；c与CCR组治疗后比较，Z=-2.332，P < 0.05

表 3 两组鼻咽癌患者诱导化疗前及同步放化疗后淋巴细胞亚群比较 Table 3 Lymphocyte immune functionof two groups patients with nasopharyngeal carcinoma before induction chemotherapy andafterconcurrent chemo-radiotherapy

现有研究发现，在哺乳类动物中，生物钟的调节中枢位于下丘脑前部的视交叉上核(SCN)^[5]。流行病学研究提示，从事昼夜节律经常改变的工种的人群相对于工作作息规律的人群有更高的癌症患病率。传统的肿瘤治疗方法通常是手术辅以一种或多种化疗药物联合放射治疗，然而化疗药物常杀伤肿瘤组织的同时也损伤了正常细胞，为患者带来难以耐受的不良反应。本研究以人体生物节律为基础，结合目前时辰药理学的进展，通过观察时辰化疗组与常规化疗组治疗期间的治疗疗效及相关不良反应，试图寻找一种在不降低治疗疗效的同时能减轻化疗不良反应的化疗药物的给药模式。目前已有相关研究肯定了时辰化疗的近期疗效，且治疗相关不良反应的发生率更低，对淋巴细胞亚群的抑制更轻^[6-7]。但是过去的研究将时辰化疗单纯应用在同步放化疗期间^[6]，未见用于诱导加同步放化疗中。本研究通过扩大样本量，将时辰化疗应用在治疗的全程，以期获得更为显著的结果。

本研究中，时辰化疗组与常规化疗组同步放化疗后近期疗效评价及有效率差异无统计学意义，与李媛媛等^[8]的结论类似。本研究中常规化疗组的总有效率98.6%稍高于时辰化疗组96.7%，常规化疗组存在疾病进展，但差异无统计学意义。Lin等^[9]在一项随机临床研究中对比了采用时辰化疗或常规化疗在局部进展期鼻咽癌患者的1年、3年和5年总生存(OS)差异并无统计学意义，提示时辰化疗在治疗反应方面并不优于常规化疗，本研究的远期疗效需要进一步随访。

李洁等^[10]在一项非小细胞肺癌的临床研究中指出，以顺铂为基础的时辰化疗方式在血液学及消化系统不良反应上有优势；Focan等^[11]的Ⅰ~Ⅱ期临床试验发现通过时辰给药可增加2倍的抗肿瘤疗效，使黏膜不良反应降低到1/5，还可减少50%的外周神经系统不良反应，这个结果已被欧洲癌症治疗研究所证实^[11]。顺铂是具有高致吐风险的化疗药物，顺铂的消化系统症状通常取决于患者血浆中游离铂的浓度以及还原型谷胱甘肽(GSH)的昼夜分泌节律，有研究指出，血浆中游离铂与血浆蛋白的结合率最高的时间为16 :00，并且GSH的分泌高峰也在下午^[12-13]，在这个时段用药，顺铂产生的不良反应更轻。口腔黏膜炎的发生与5-氟尿嘧啶(5-FU)的用药密切相关，5-FU的代谢在正常细胞中同样存在周期性变化，二氢嘧啶脱氢酶(dihydropyrimidine dehydrogenase, DPD)则是该代谢过程的关键限速酶，有研究指出该酶的活性也具有明显的昼夜节律，采用时辰化疗给药方式能明显降低其不良反应^[14-15]。紫杉醇作为一种对乳腺癌、卵巢癌、肺癌、头颈部癌具有良好单药有效率的抑制微管解聚的抗癌药物，有研究发现无论多西紫杉醇的用药模式如何，最大疗效和耐受剂量均出现于荷瘤小鼠的休息期，最大不良反应出现在荷瘤小鼠的活动期，并将多西紫杉醇的最佳用药时间定为凌晨4 :00^[16]。本研究在血液学的不良反应观察中，时辰化疗组的血液学不良反应，尤其是白细胞、中性粒细胞的减少较常规化疗组轻微，3级或3级以上的不良事件发生率也更低，考虑于时辰化疗的减毒效应有关，李媛媛等^[17]在一项前瞻性临床研究对比增量时辰化疗与常规化疗联合三维适形放疗治疗过程中的不良反应，增量时辰化疗组的骨髓抑制及消化系统不良反应更轻。本研究时辰化疗组的呕吐、口腔黏膜炎发生率及严重程度也明显低于常规化疗组，Jin等^[18]在一项Ⅱ期前瞻性随机临床研究中将60例患者分指出与常规化疗组相比，时辰化疗组白细胞减少、血小板减少、恶心、呕吐的发生率更低。血红蛋白减少、血小板减少、天冬氨酸氨基转移酶升高、丙氨酸氨基转移酶升高、肌酐升高等观察指标的差异无统计学意义。

在免疫功能方面，治疗前后淋巴细胞亚群无论是时辰化疗组还是常规化疗组都降低，差异有统计学意义，这提示放化疗明显对存在免疫抑制效应。从二维放疗到调强放射治疗时代，局部复发及远处转移依然是鼻咽癌治疗的主要失败模式^[19-20]，虽然有相关研究提示诱导化疗可以减少局部进展期鼻咽癌患者的远处转移风险^[21]，但是高强度的化疗对免疫功能存在损害，一项以不同剂量联合依维莫司对患者淋巴细胞亚群影响的研究结果指出免疫抑制与肾癌患者的不良预后有关^[22]，这提示恶性肿瘤患者淋巴细胞亚群的变化情况可能是一个潜在的预后因素。在本研究中，诱导加同步放化疗治疗后，时辰化疗组与常规化疗组的各亚群淋巴细胞计数的较前均降低，提示放化疗治疗对患者存在免疫抑制，但时辰化疗组的CD16++56+淋巴细胞绝对值计数明显较常规化疗组高，且差异有统计学意义，提示时辰化疗的非特异性免疫功能保护较常规化疗组更好。Zhou等^[23]的一项回顾性研究指出CD16++56+淋巴细胞计数与套细胞淋巴瘤患者的总生存具有相关性。CD16++56+淋巴细胞作为一种无MHC限制的免疫细胞，对肿瘤具有直接杀伤作用，其绝对值计数的降低提示非特异性免疫功能的损伤，有研究提示，CD16++56+淋巴细胞可增强CD8+淋巴细胞的特异性免疫应答，并提示更好的预后^[24]。

本研究中常规化疗组CD4+淋巴细胞百分比降低幅度大于时辰化疗组，虽然同步放化疗后CD4+淋巴细胞两组差异无统计学意义，但是从CD4+淋巴细胞亚群抑制的程度上，常规化疗组有更加明显的抑制趋势。通常情况下，CD4+/8+淋巴细胞比值在人体外周血中处于相对稳定的状态，免疫功能低下时，CD4+/8+比值会出现低下，李卓玲等^[6]在一项鼻咽癌同步时辰化疗的前瞻性研究中指出，同步放化疗后，采用时辰化疗的患者CD4+/8+比值较使用常规化疗的患者高，毕婷等^[7]也在一项鼻咽癌时辰诱导化疗的前瞻性研究中发现常规化疗组患者较时辰化疗组患者具有更明显的CD4+/8+的下降趋势。本研究中，同步放化疗后时辰化疗组的CD4+/8+为1.16，高于常规化疗组1.00，虽然差异无统计学意义，但提示时辰化疗组对免疫功能有更好的保护趋势。

综上所述，时间调节化疗是一种安全合理的用药方式，在保证治疗疗效的前提下，可显著减轻患者的治疗相关不良反应并改善免疫抑制的情况，这对于提高局部进展期鼻咽癌患者治疗期间的耐受性及减轻免疫抑制是有优势的。