2018, Vol. 38
2. 200032 上海, 复旦大学附属肿瘤医院放疗科 复旦大学肿瘤学系
2. Department of Radiation Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 200032, China
约70%的肿瘤患者在病程中需要接受放射治疗。放疗抗肿瘤的机制是射线造成DNA损伤，引起肿瘤细胞凋亡、坏死、自噬等。放疗也会影响肿瘤免疫，引起照射区域外的肿瘤退缩，称为远隔效应。放疗调节肿瘤免疫包括：①促进炎症因子白介素-1(IL-1)、IL-6的释放。②增加损伤相关模式分子(DAMP)，如钙网蛋白、高迁移率族蛋白1(HMGB1)、腺苷三磷酸(ATP)的表达或释放，增强肿瘤抗原的免疫源性，形成原位瘤苗。③增加肿瘤细胞主要组织相容性复合体-1(MHC-1)的表达。④激活刺激干扰基因通路(STING)，增加Ⅰ型干扰素的释放。⑤使巨噬细胞由M2型转化为M1。这些因素促进树突状细胞的成熟，提高肿瘤抗原的提呈，从而增强CD8+特异性免疫反应[1]。
尽管放疗有这些免疫调节作用，但远隔效应在临床上是罕见的，提示放疗也会有直接的免疫抑制作用，或者扩大肿瘤微环境中已经存在的免疫抑制因素。这些抑制因素可以分为两大类，细胞水平：包括调节性T细胞(Treg细胞)、髓源抑制细胞(MDSC)、肿瘤相关巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞；分子水平：免疫检测点(CTLA-4、PD-1)、转化生长因子-β(TGF-β)等[2]。放疗后肿瘤内Treg细胞数量增加[3]，Treg细胞数量增加与预后不良有关[4]，用低剂量环磷酰胺或CD25单抗消除Treg细胞可以增强放疗的抗肿瘤效果和远隔效应[5]，提示Treg细胞在肿瘤放疗中的重要作用。
一、Treg细胞1. Treg细胞的特征和作用：Treg细胞占循环CD4+T细胞的5%~10%。人类Treg细胞最早是在2001年从外周血中分离鉴定出来。Foxp3于2003年在小鼠中发现，之后被确认为也可作为人类Treg的特征性标记[6]。Treg细胞的基本特征是高表达由CD25、CD122、CD132构成的高亲和力IL-2受体，但自身几乎不生产IL-2。因此，Treg细胞高度依赖于外源IL-2以维持存活和增殖。Foxp3通过抑制IL-2生成所必须的两个转录因子AML1和NFAT，进而抑制Treg细胞合成IL-2。用IL-2抗体中和循环中的IL-2会使Treg细胞受损，造成自身免疫性反应。因此，IL-2和其受体是调控Treg存活和抑制功能的关键靶点[7]。根据其起源和抑制能力，Treg分为两大类：自然Treg细胞(胸腺Treg细胞)和适应性Treg细胞(外周来源Treg细胞)。自然Treg细胞表达CD25、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA-4)等，通过表面分子CTLA-4、膜接触传递TGF-β、旁分泌腺苷等途径发挥其免疫抑制作用。适应性Treg细胞是抗原特异性抑制细胞，主要是通过释放IL-10或TGF-β发挥免疫抑制作用。
2.肿瘤内Treg细胞增加的机制：肿瘤形成后，在经历了效应T细胞先增加而后急剧下降的同时，Treg细胞数量开始增多，当Treg细胞数量超过效应T细胞时，进入免疫抑制状态[8]。肿瘤诱导Treg在肿瘤发展的早期就达到高峰[9-10]，但其增加并非没有上限，不超过50%的CD4+T细胞[9, 11-12]。肿瘤内Treg细胞增多的机制包括：①外周Treg细胞招募。②瘤内Treg细胞增殖。③瘤内非Treg细胞转化而来。肿瘤细胞及肿瘤相关巨噬细胞会产生趋化因子CCL2、CCL17、CCL22、CCL28, 将Treg细胞招募到肿瘤中。Treg细胞进入肿瘤组织依赖于趋化因子受体CCR4。CCR4在效应T细胞中的表达不高，提示可以通过靶向CCR4选择性抑制Treg细胞在肿瘤中的功能，促进抗肿瘤效应[13-14]。
肿瘤细胞和肿瘤驯服后的免疫细胞释放大量的TGF-β，促进Treg细胞增殖[15]。此外，肿瘤细胞死亡后释放大量腺苷，亦可作用于Treg细胞表面的腺苷A2A受体促进Treg细胞增殖[16]。
有证据表明，Treg细胞可由具有效应T细胞潜能的CD4+CD25-细胞转化而来[11, 17-18]，且不需要增殖[11]。但Treg细胞转化需要2个条件，一是抗原提呈受损、肿瘤抗原免疫性差、TGF-β持续存在[19]；二是有吲哚胺2，3-双氧酶(IDO)的存在。IDO是一种色氨酸降解酶，使色氨酸降低，促进Treg细胞转化[20]。肿瘤细胞也可表达IDO降解色氨酸，促进Treg细胞转化[21]。
在荷瘤状态下，增殖和转化是相互独立的过程。转化不需要增殖[11]，增殖也不会限制转化比例的增加[18]。当Treg细胞清除掉后，转化会成为维持Treg细胞相对高稳态水平的主要方式。此种情况下转化而来的Treg细胞会取代之前存在的大部分自然Treg细胞。
3. Treg细胞抑制细胞免疫的机制：Treg细胞不仅可以控制T细胞，也可以控制B细胞、NK细胞、树突状细胞和巨噬细胞[22]。Treg发挥免疫抑制作用涉及的分子包括：CTLA-4、PD-L1[23]、IL-2、IL-10、TGF-β、IL-35、GITR、LAG3、颗粒酶B、cAMP[24]。Treg细胞在凋亡过程中也通过CD39、CD73使大量的ATP转化为腺苷，诱导免疫抑制[25]。肿瘤内浸润的Treg细胞表达还可表达IL-1R2、PD-L1、PD-L2、CCR8，通过其他免疫检查点机制发挥免疫抑制作用[26]。
效应T细胞经Treg细胞抑制后的命运包括凋亡、无能、休眠[24]。有体外实验显示Treg细胞可以使识别自身抗原的CD8+T细胞无能[27]。这些无能的CD8+T细胞对抗原刺激高度反应，增殖多，但产生IL-2等细胞因子少，表达共抑制分子CTLA-4，呈幼稚态(CD45RAhighCCR7+)。T细胞出现无能状态取决于Treg细胞的抑制强度和TCR的亲和力：高亲和TCR刺激后导致T细胞凋亡，中等亲和力TCR刺激会导致T细胞无能，低亲和力TCR刺激导致T细胞休眠。
二、Treg细胞与放疗1.放疗增加Treg细胞的机制：放疗对Treg细胞的作用是剂量依赖的，Treg细胞对放疗诱导死亡相对抵抗[28]，但0.94 Gy的放疗剂量足以抑制其增殖[29]。放疗可增加正常组织和肿瘤组织内的Treg细胞[30]。肿瘤经照射后增加的Treg细胞高表达CTLA-4，发挥免疫抑制作用。放疗后瘤内的Treg细胞比其他T细胞增殖更快。用芬戈莫德(fingolimod)抑制T细胞浸润并不能阻止放疗后Treg细胞扩增，表明放疗后增加的Treg细胞来源于已存在于瘤内Treg细胞的增殖，放疗后Treg细胞的增殖依赖于TGF-β和IL-33信号[30]。此外，瘤内的巨噬细胞也介导放疗后Treg细胞增加。巨噬细胞对放疗抵抗，放疗后巨噬细胞表达MHC-Ⅱ增加，促进Treg细胞浸润入肿瘤组织，这一现象由细胞周期基因CDKNLA介导[31]。
2. Treg细胞剥夺与放疗联合的探索：鉴于Treg在肿瘤免疫中的重要作用，放疗又会增加其数量，因此，消除或抑制Treg细胞可能会增强放疗的疗效。Son等[5]尝试用低剂量环磷酰胺或CD25单抗剥夺Treg细胞，观察对放疗疗效的影响。分别于小鼠腿部和腋下接种肿瘤，待小鼠成瘤后腹腔注射低剂量环磷酰胺(50 mg/kg，1次/周，共3次)或CD25单抗(250 μg/只)，3 d后对腿部肿瘤行12 Gy放疗，腋下肿瘤未照射用以观察远隔效应。环磷酰胺和CD25单抗都可以降低脾脏、外周血、照射瘤和未照射瘤内约50%的Treg细胞，并增加瘤内CD8+T细胞数量，进一步抑制照射瘤的生长。单纯放疗或用药组并未观察到未照射肿瘤体积的缩小，但放疗联合Treg细胞剥夺组未照射肿瘤体积显著缩小，提示Treg细胞剥夺可以增加放疗的远隔效应。在该实验中低剂量环磷酰胺的疗效优于CD25单抗，Leswis肺癌模型的疗效差于肠癌模型。在另一项研究中，照射后的肿瘤内注射DC细胞以增强抗原提呈，联合低剂量环磷酰胺或CD25单抗后也观察到了远隔效应增强。同样，环磷酰胺疗效优于CD25单抗，可能与CD25单抗除了杀灭Treg细胞也会损伤效应T细胞有关[32]。
3. Treg细胞剥夺联合放疗及其他免疫调节剂: PD-1/PD-L1单抗在多种实体瘤中都取得了令人瞩目的成绩，但有效率较低，在未经选择的人群中总体有效率仅为20%。同时联合PD-1单抗和CD25单抗清除Treg细胞较单纯PD-1单抗可以提高肿瘤控制[33]。γ-干扰素使Treg细胞脆弱是PD-1单抗起效的必要条件[34]。当放疗、PD-1单抗和CTLA-4单抗三者联合使用可以达到较为理想的疗效，其中CTLA-4单抗的作用除了解除对CD8+T细胞的作用外，还会影响调节Treg细胞的抑制功能[35]。TLR-7激动剂咪喹莫特(imiquimod)可以激活T细胞，单独使用可以抑制肿瘤生长，并与放疗有协同作用，当小剂量环磷酰胺(2 mg，单次)加入后，进一步强化对肿瘤的抑制作用，延长荷瘤鼠存活时间[36]。
三、展望CD4+T细胞过继治疗联合低剂量环磷酰胺可以有效启动肿瘤免疫反应，但会因髓源抑制细胞(CD11b+Ly6ChiCCR2hi)的扩增通过PD-1/PD-L1轴抑制肿瘤免疫而复发[37-38]。低剂量吉西他滨杀灭髓样抑制细胞或PD-L1单抗阻断PD-1/PD-L1通路可以有效预防肿瘤复发[38]。放疗联合低剂量环磷酰胺失败的病例是否也是由髓源抑制细胞介导的尚不清楚。
环磷酰胺的免疫调节作用取决于2类胃肠道菌群Enterococcus hirae和Barnesiella intestinihominis，改变肿瘤微环境，可减少Treg细胞。在肺癌中，PD-1单抗治疗前使用过抗生素的患者疗效显著降低[39]。因此，在低剂量环磷酰胺与放疗联合的过程中也需要考虑肠道微生物的影响。
环磷酰胺使用频率和剂量也需要考虑。每天方案不一定能有效启动免疫效应[40]，而6 d方案可以有效降低Treg细胞，增强NK细胞活力，并且优于9 d方案和12 d方案[41]。除了使用频率需要考虑，低剂量环磷酰胺抑制肿瘤Treg细胞的有效性也需要考虑。因为低剂量环磷酰胺抑制Treg细胞的机制是抑制其增殖，而Treg细胞还可以通过募集、转化等方式集聚到肿瘤内。因此，需要考虑更有效的、特异性剥夺瘤内Treg细胞的方法与放疗联合。
四、小结Treg细胞是机体维持免疫稳态的重要机制，也是肿瘤免疫抑制的重要原因。肿瘤通过TGF-β、腺苷等机制促进瘤内Treg细胞募集、增殖、转化，增加瘤内Treg细胞数量。Treg细胞通过直接接触和分泌细胞因子的方式抑制T细胞、B细胞、NK细胞，诱导免疫抑制状态。Treg细胞对放疗相对抵抗，放疗后肿瘤细胞通过释放TGF-β、IL33增加瘤内Treg细胞的增殖，并通过巨噬细胞增加Treg细胞募集。放疗后Treg细胞增加与预后不良有关。通过低剂量环磷酰胺或CD25单抗剥夺Treg细胞可以提高放疗对肿瘤的局部控制，并增强放疗远隔效应。Treg细胞在放疗中的作用机制，及Treg细胞的清除/抑制与放疗联合的优化值得进一步深入研究。
利益冲突 无作者贡献声明 吴俊兰负责文献搜集整理与论文撰写；范兴文协助论文撰写；吴开良指导论文修改
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