结直肠癌是较为常见的消化道恶性肿瘤，近年来我国结直肠癌的发病率和死亡率呈逐步上升趋势，放疗成为中晚期患者的主要治疗方案，但治疗效果差强人意，其中仅有小部分患者对放疗敏感。研究发现结直肠癌干细胞表面有许多高表达的标志物，其中癌基因Musashi1(Msi1)是当下研究的热点，因其与肿瘤的分期、淋巴结转移、ki-67、放化疗敏感性密切相关^[1]。Musashi1(Msi1)是一种进化保守型RNA结合蛋白(RBP)，Msi1作为RBP家族重要一员，通过RRM与超过60多个靶基因的mRNA 3′端非编码区的特定序列特异性结合，这些靶基因与结肠癌的放疗敏感性密切相关^[2-3]。因此，可通过研究Musashi1对结直肠癌放疗敏感性的影响，指导临床治疗，为当代放射肿瘤学提供新的治疗靶点。

1.细胞株与试剂：结肠癌HCT116细胞株、慢病毒载体、沉默Msi1慢病毒液、阴性对照组慢病毒液均由上海吉凯基因化学技术有限公司提供。McCoy′s5A培养基、胎牛血清(FBS)购于美国GIBCO公司，Pen-Strep溶液购于美国Biological Industries公司，DMSO购于北京Solarbio公司，Anti-β-肌动蛋白、Anti-Msi1购于美国Santa Cruz公司，PEAnexinV Apoptosis DetectionKi、碘化丙啶(PI)、RNA酶购于美国BD公司，单溶液细胞增殖检测试剂盒购于美国Promega公司。

2.细胞培养：细胞贴壁生长，加入含100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素以及10%胎牛血清的McCoy′s 5A培养基，置于37℃、5%CO₂饱和湿度的培养箱中培养。

3.构建沉默Msi1的细胞系：取细胞悬液中5×10⁴的目的细胞接种于6孔板中，置于培养箱中继续培养，按病毒侵染感染复数(MOI)值为20，分别向其中加入适量的携带阴性对照的病毒载体和沉默Msi1的病毒载体的病毒液，再向其中加入适量polybrene，均匀混合培养，侵染72 h后转入培养瓶中继续培养。

4.检测沉默效率：以GAPDH为内参，应用SYBR Green荧光染料法检测Msi1在HCT116-Msi1稳转株中mRNA表达, 以β-肌动蛋白为内参，应用Western blot法检测Msi1在HCT116-Msi1稳转株中蛋白表达情况。实验重复3次。最终将细胞分为3组：Msil低表达的沉默组，携带病毒载体的阴生对照组及HCT116细胞不做任何处理的空白对照组。

5.细胞外照射：采用瑞典医科达公司医用直线加速器进行细胞照射，6 MV X射线，照射野面积设为20 cm×20 cm，吸收剂量率200 cGy/min，源靶距100 cm，机架角为180°，在培养瓶或培养板下放置1 cm补偿膜进行组织补偿，室温条件下进行照射。

6.集落形成实验检测细胞放射敏感性：3组细胞按浓度梯度500~4 000个细胞分别接种于6孔板中，待细胞贴壁生长24 h后，每组细胞按由低到高的细胞接种密度接受0、2、4、6、8 Gy单次照射，照射后继续在培养箱中培养10~14 d，或当出现肉眼可见的克隆时终止培养，用甲醇固定细胞，0.2%结晶紫染色，显微镜下计数多于50个细胞的克隆数，计算克隆形成率(PE)和不同剂量点的细胞存活分数(SF)。PE%=未照射组克隆数/接种细胞数×100%，SF=照射组克隆数/(接种细胞数×PE)。实验重复3次。

7.流式细胞仪检测各组细胞凋亡：取对数生长期的3组细胞，分别接受0、8 Gy照射后的24、48、72 h常规消化收集细胞，用1×结合缓冲液将细胞重悬，取1×10⁵细胞，向其加入5 μl AnnexinV-PE和5 μl 7-AAD，于室温避光孵育15 min，再向每管中加入400 μl的1×结合缓冲液，用流式细胞仪检测。实验重复3次。

8.流式细胞仪检测各组细胞周期：取对数生长期的3组细胞，分别接受0、12 Gy照射后，于48 h常规消化，以冷PBS洗涤3次后收集2×10⁶细胞，加入70%的乙醇于4℃固定过夜，过滤，PBS清洗2次，每管加入2.5 μl的RNaseA(10 mg/ml)室温孵育20 min，再加入25 μl PI染液(1 mg/ml)，室温避光保存15 min，上机检测。实验重复3次。

9.统计学处理：所有数据采用SPSS 13.0软件进行分析，符合正态分布，结果用x±s表示，两组间比较用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，重复测量设计资料采用方差分析，两两比较采用SNK检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

1. Msi1 RNA水平、蛋白水平的沉默效率：以GAPDH为内参，应用SYBR Green荧光染料法检测Msi1在HCT116-Msi1稳转株中mRNA表达情况，与空白对照组(1.213±0.301)、阴性对照组(1.197±0.285)相比，沉默组细胞中的Msi1 mRNA表达量(0.311±0.04)下降，沉默效率为74%，其差异有统计学意义(F=13.956，P < 0.05)；而空白对照组与阴性对照组之间，差异无统计学意义(P > 0.05)。

以β-肌动蛋白为内参，应用Western blot法检测Msi1在HCT116-Msi1稳转株中蛋白表达情况，结果显示，与空白对照组、阴性对照组相比，沉默组细胞中的Msi1蛋白表达量下降59%，差异有统计学意义(F=11.137，P < 0.05)；空白对照组与阴性对照组相比，Msi1蛋白表达量差异无统计学意义(P > 0.05)，见图 1。

图 1 沉默组、空白对照组和阴性对照组中Msi1蛋白的表达情况 Figure 1 Western blot assay of Msi1 protein of the Msi1 silence group, control group and NC group

2.集落形成实验检测细胞放射敏感性：结果见图 2，表 1。根据单击多靶模型拟合生存曲线，沉默组D₀、D_q、N、SF₂分别为1.55、0.88、1.76 Gy和0.43，空白对照组分别为2.17、1.51、2.01 Gy和0.64，阴性对照组分别为1.99、1.45、2.07 Gy和0.62。沉默组相对于空白对照组的放射增敏比为1.40，相对于阴性对照组的放射增敏比为1.28。沉默组的细胞放射敏感性明显高于阴性对照组和空白对照组。

图 2 沉默组、空白对照组和阴性对照组细胞的生存曲线 Figure 2 Cell survival curves of the Msi1 silence group, control group and NC group

表 1(Table 1)

表 1 细胞生存曲线相关参数 Table 1 The fitting parameters of cell survival curves 组别 D0(Gy) Dq(Gy) N(Gy) SF2 沉默组 1.55 0.88 1.76 0.43 空白对照组 2.17 1.51 2.01 0.64 阴性对照组 1.99 1.45 2.07 0.62 注：SF2. 2 Gy照射时细胞存活率

表 1 细胞生存曲线相关参数 Table 1 The fitting parameters of cell survival curves

3.未照射及照后细胞凋亡情况：结果见图 3，4，表 2。未照射时，沉默组细胞凋亡数高于空白对照组和阴性对照组(t=12.905、11.358、15.068，P < 0.05;t=19.194、16.507、14.001，P < 0.05)。8 Gy照射后，各组细胞凋亡比例均增加，沉默组在照射后的24、48、72 h的凋亡比例均高于空白对照组和阴性对照组，差异有统计学意义(F=122.638、577.481、245.369，P < 0.05)，但空白对照组和阴性对照组之间差异无统计学意义(P > 0.05)，各组凋亡比例随着时间的增加而增加，沉默组凋亡比例在各时间点增加的程度更加明显(F=65.16，P < 0.05)，可见凋亡比例呈现时间-剂量依赖性。

图 3 未照射的沉默组、空白对照组、阴性对照组照后不同时间细胞凋亡情况 Figure 3 Cell apoptosis rate of the Msi1 silence group, control group and NC group

表 2(Table 2)

表 2 沉默组、空白对照组和阴性对照组在0、8 Gy照射后不同时间点的细胞凋亡数(%，x±s) Table 2 Apoptosis index of the Msi1 silence group, control group and NC group at different time after 0 Gy and 8 Gy irradiation(%, x±s) 剂量(Gy) 组别 样本数 24 h 48 h 72 h F值 P值 0 空白对照组 6 3.357±0.744 3.393±0.830 3.430±0.436 — — 阴性对照组 6 3.248±0.416 3.327±0.461 3.453±0.517 — — 沉默组 6 7.842±0.413ab 7.868±0.492ab 7.898±0.581ab — — 8 空白对照组 6 5.852±0.635 15.520±0.729 21.103±1.094 122.638 < 0.05 阴性对照组 6 5.372±0.296 14.613±0.890 21.297±1.225 577.481 < 0.05 沉默组 6 10.473±0.821ab 27.670±0.577ab 36.922±1.829ab 245.369 < 0.05 注：“—”为未比较。a与同一时间同一剂量空白对照组比较，t=12.905、10.908、11.358、32.012、15.068、18.176，P < 0.05；b与同一时间同一剂量阴性对照组比较，t=19.194、14.315、16.507、30.155、14.001、17.385，P < 0.05。8 Gy照射后，不同时间不同组别比较，F=65.160，P < 0.05

表 2 沉默组、空白对照组和阴性对照组在0、8 Gy照射后不同时间点的细胞凋亡数(%，x±s) Table 2 Apoptosis index of the Msi1 silence group, control group and NC group at different time after 0 Gy and 8 Gy irradiation(%, x±s)

图 4 8 Gy照射后不同时间沉默组、空白对照组、阴性对照组细胞凋亡情况 Figure 4 Cell apoptosis rate of the Msi1 silence group, control group and NC group at 24 h, 48h and 72h after 8 Gy X-ray irradiation

4.照后细胞周期变化：结果见图 5，表 3。12 Gy照射后48 h，空白对照组和阴性对照组的细胞周期与未照射相比，G₂/M期细胞明显增多(t=8.588、5.317，P < 0.05), 而照射后沉默组G₂/M期比例较后两组明显下降，差异有统计学意义(F=65.398，P < 0.05)。

图 5 沉默组、空白对照组、阴性对照组0和12 Gy射线照后48 h细胞周期分布 Figure 5 Flow cytometry assay of cell cycle distribution of the Msi1 silence group, control group and NC group at 48h after 0 and 12 Gy X-ray irradiation

表 3(Table 3)

表 3 沉默组、空白对照组和阴性对照组在0、12 Gy照射后细胞周期分布(%，x±s) Table 3 Cell cycle distribution of the Msi1 silence group, control group and NC group at 48h after 0 and 12 Gy X-ray irradiation(%, x±s) 剂量(Gy) 组别 样本数 G0/G1 S G2/M 0 空白对照组 3 45.000±2.343 13.200±1.453 41.767±3.694 阴性对照组 3 45.600±1.600 13.267±1.557 41.133±1.704 沉默组 3 51.133±1.159 11.947±2.720 36.833±3.931 12 空白对照组 3 24.933±2.108 13.333±1.201 61.700±1.587 阴性对照组 3 24.800±6.222 12.467±0.603 62.767±6.838 沉默组 3 56.967±2.303 16.800±3.260 26.233±3.200ab 注：a与同一剂量同一周期空白对照组比较，t=8.588，P < 0.05；b与同一剂量同一周期阴性对照组比较，t=5.317 P < 0.05。12 Gy照后3组细胞G2/M期比较，F=65.398，P < 0.05

表 3 沉默组、空白对照组和阴性对照组在0、12 Gy照射后细胞周期分布(%，x±s) Table 3 Cell cycle distribution of the Msi1 silence group, control group and NC group at 48h after 0 and 12 Gy X-ray irradiation(%, x±s)

目前, 多数学者认为，肿瘤细胞有很大的异质性，只有极少数的具有无限增殖和自我更新能力、导致肿瘤发生的细胞，即肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)^[4]，它们大多处于乏氧环境、细胞周期处于G₀期、较强的DNA修复能力、表达ABC转运蛋白，因此对放、化疗抗拒，是肿瘤复发和转移的根源^{[3, 5-7]}。

人肠干细胞位于肠隐窝的1~10层细胞，通过Msi1抗体染色发现Msi1阳性区域和肠道干细胞位置一致^[8]。Yousefi等^[3]发现缺失Msi基因的小鼠经过12 Gy外照射后，肠上皮丧失了再生功能。Sureban等^[9]和Li等^[10]的研究表明，Msi1在结肠癌患者的癌组织、细胞中高表达，且Msi1高表达的患者易复发和转移，降低该基因的表达水平可以抑制肿瘤的生长。这些研究均显示高表达Msi1的细胞具有干细胞特性。随后又有研究学者在细胞和动物水平证实Msi1作为癌基因，可加剧结肠癌的发生^[5]。发病机制研究发现，RNA结合蛋白(RBP)在突变的基因的转录翻译过程中发挥着重要的作用，Msi1作为RBP家族重要一员，Msi1可抑制m-Numb和p21WAF-1，并可激活Notch通路、Wnt信号通路，在肿瘤的发生、增殖、侵袭、凋亡以及细胞周期调控方面起着重要的作用^{[1, 11-14]}。

克隆实验是验证放射增敏作用的金标准，通过计数不同剂量外照射后形成的克隆数，拟合单击多靶模型，发现照射后沉默组克隆数明显少于空白对照组及阴性对照组，提示沉默组细胞克隆形成能力显著下降，从侧面反应出沉默Msi1降低了肿瘤细胞DNA放射损伤后再修复的功能。有研究学者表示胶质瘤细胞U251接受5 Gy照射后，高表达Msi1的细胞比例增加，且辐射损伤修复基因DNA-PKcs表达也增加，克隆实验中沉默Msi1表达组在接受照射后其克隆数较对照组显著下降，证明Msi1通过调控DNA-PKcs来增加放射抗性^[6]。Sureban等^[9]研究指出沉默HCT116细胞中Msi1的表达，并给予12 Gy照射后，沉默Msi1联合放疗组的细胞凋亡数是单纯照射组的4倍，证明Msi1可以增加结肠癌的放疗敏感性，本实验研究结论与之类似。

Msi1作为癌基因，抑制其表达后有促进肿瘤细胞凋亡的作用^[9]。本实验研究发现单纯沉默Msi1本身就有促进细胞凋亡的作用，当给予3组细胞8 Gy照射后，沉默组联合放疗后能更加明显地增加细胞凋亡数，进一步分析发现，单纯沉默Msi1引起的细胞凋亡数，加上对照组因射线导致的细胞凋亡数，低于沉默组因射线引起的细胞凋亡总数，从流式分析细胞凋亡技术角度再次印证了降低Msi1表达可能通过促进凋亡而达到放射增敏作用，这与Sureban等^[9]的研究一致。

细胞放射抗性与细胞周期密切相关，大部分学者认为，机体细胞照射后细胞周期阻滞于G₂/M期，因该反应有利于损伤的DNA进行修复，从而确保细胞基因组的完整性和稳定性^[15-16]。Yousefi等^[3]研究发现小鼠暴露于12 Gy照射后使得大部分处于静止期(G₀)的肠干细胞进入细胞周期促进细胞修复，而这些细胞同时高表达Msi1，当Msi1表达缺失后细胞周期阻滞于G₁期。本实验给予12 Gy外照射时，对照组细胞周期阻滞于G₂/M期，有利于损伤细胞的修复，从而增加了放射抗性，但沉默组放射后细胞周期中G₂/M期比例下降，可能沉默组通过解除G₂/M期阻滞，使细胞在照射后得不到修复就进入了下一个细胞周期，进而细胞增殖能力减低。本实验研究结果与既往研究结果^{[3, 15-16]}类似。综合以上研究，从客观的角度来看，肿瘤的发生、发展是多基因、多因素、多阶段参与的复杂过程，考虑肿瘤细胞中细胞周期的调控、放疗损伤修复的机制较多且相互关联，放射增敏作用不能仅仅考虑单一基因对细胞周期的影响。

体外实验表明，沉默Msi1可以增加肿瘤对放疗的敏感性，而其在人体内的增敏作用还尚待进一步研究，这可为现代放化疗提供重要治疗靶点，提高治疗有效率，降低肿瘤的复发转移率，从而使患者的生存期延长。