2018, Vol. 38
通过微核(micronucleus, MN)发生率反映染色体异常评价外源化合物的遗传毒性，已被广泛应用在化合物的安全评价，生态环境生物监测[1]。同时人外周血淋巴细胞微核实验在环境对人类健康影响的调查、职业暴露人群遗传损害监测、接受化疗患者的遗传损害调查等方面广泛应用。相较于体内红细胞微核和体外细胞系微核流式检测研究，人外周血淋巴细胞微核流式检测相关研究报道较少，研究主要集中在利用流式检测人外周血淋巴细胞微核评价外源化合物遗传毒性[2]。流式细胞术利用两种荧光染料标记细胞，叠氮溴乙锭(ethidium monazide, EMA)和SYTOX©绿色荧光(SYTOX©Green)。根据绿色荧光强弱来区分主核与微核[3-5]。本实验利用常规微量全血培养微核检测(A方法)作为标准，分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)培养流式微核检测(B方法)人外周血淋巴细胞微核建立剂量-效应曲线和受试者工作特征曲线(ROC曲线)。探讨流式细胞术检测淋巴细胞微核和常规培养微核检测的相关性和将流式细胞术应用于放射工作人员健康检查外周血淋巴细胞微核的可能性。
材料与方法1.研究对象：为建立流式细胞术分析人外周血淋巴细胞微核剂量-效应曲线，分析A、B两种检测方法的相关性，单纯随机选取2017年深圳市职业病防治院健康监护科3例健康体检志愿者进行，无吸烟史，年龄在25~35岁，血常规、生化免疫指标检查结果正常。为确定B方法检测微核超正常参考值的最佳临界值，单纯随机选取2017年深圳市职业病防治院放射工作体检人员30例进行，其中男性20例，女性10例，年龄在32~45岁。研究对象符合中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会制定的《涉及人的生物医学研究伦理审查办法(试行)》(2007)的要求，并通过深圳市职业病防治院伦理审查委员会讨论批准。严格按照批准的研究方案开展研究工作。
2.主要实验试剂与仪器：RPMI 1640培养基(美国GIBCO公司)；植物血球凝聚集素PHA(广州达晖公司)；10% (v/v)胎牛血清FBS(美国GIBCO公司)；淋巴细胞分离液(美国GE公司)；EMA染色剂(美国Sigma公司)；SYTOX© Green(美国Invitrogen公司)；淋巴分离管(LeucosepTM12 ml，德国Greiner Bio-One公司)；流式细胞仪(FACS CantoⅡTM美国BD公司)；X射线机(英国Elekta公司)。
3.研究方法：收集3名健康志愿者每位30 ml外周血，采用6 MV X射线，吸收剂量率300 cGy/min, 源靶距100 cm，照射野8.0 cm×8.0 cm。设0、0.10、0.25、0.50、1.00、3.00、5.00 Gy共6个剂量点，0 Gy为对照组。每个剂量点外周血采用A和B两种方法检测淋巴细胞微核，每个剂量点重复3次。采集30例放射工作体检人员的外周血3 ml，每份血分成两份，采用A和B两种方法进行微核检测。以A方法检测的微核率作为标准，根据约登指数最大原则选取B方法检测微核率的最佳临界值。
(1) A方法微核检测：自体血浆培养肝素钠抗凝全血[6]，37℃、5% CO2、72 h。用0.075 mol/L KCl溶液低渗处理后加入新配制的固定液(甲醇:冰醋酸=3:1)预固定；接着固定液固定、滴片、染色。分析1 000个已转化的淋巴细胞，要求细胞核完整、结构清晰，并有胞质，细胞分散较好、不重叠不成簇。计数微核细胞的数量及微核的总数。
(2) B方法微核检测：密度梯度1 000×g，离心10 min，分离单个核细胞(PBMC)，37℃、5% CO2培养72 h。收获的细胞置于冰上孵育；EMA染色后进行细胞裂解和SYTOX© Green染色，30 min室温避光至流式分析细胞[5, 7]。根据核的大小和颗粒度圈出淋巴细胞，再根据EMA和SYTOX© Green荧光信号强弱圈出微核和2n主核，主核SYTOX© Green荧光强度的1/100至1/10定义为微核[8]。微核率(%)=EMA(-)SYTOX(+) MN / EMA(-)SYTOX(+) 2n主核×100%[9]。
4.统计学处理：采用SPSS 19.0软件进行分析。不同照射剂量微核率的比较采用非参数多个独立样本秩和检验(Kruskal-Wallis)，各剂量点的微核率与对照组两两比较采用Mann-Whitney U检验；剂量-效应关系分析采用回归分析进行曲线拟合，建立回归方程；采用非参数Spearman分析两种方法相关性。采用受试者工作曲线(ROC)分析计算流式细胞术检测淋巴细胞微核超标临界值。P＜0.05为差异有统计学意义。Graphpad 5.0完成作图。
结果1.不同剂量X射线照射微核检测结果：A、B两种方法培养的淋巴细胞相对存活率均＞50%，符合国际协调委员会(International Conference on Harmonization，ICH)颁布的指导原则S2 (R1)中受照细胞相对存活率不低于55%±5%[10]的要求。两种方法检测微核结果列于图 1。由图 1可知，两种方法各剂量点微核率差异有统计学意义(H=97.60.36, P＜0.001)，与对照组相比，两种方法0.50、1.00、3.00、5.00 Gy组微核率均有显著增加(P＜0.01)，而0.10、0.25 Gy组较对照组差异无统计学意义(P＞0.05)。0.50~5.00 Gy照射剂量范围的A方法拟合曲线为
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图 1 X射线照射后淋巴细胞微核的剂量-效应曲线 注：A方法为常规微量全血培养微核检测方法；B方法为分离外周血单个核细胞培养流式微核检测。黑色线为线性回归直线；彩色线为剂量点连线 Figure 1 Dose response curves of lymphocyte MN after X-ray irradiation |
2.流式细胞术检测微核临界值选取：用A、B两种方法得到微核检出率分别为16.67%和33.33%，B方法的检出率高于A方法。以A方法得到的MN≥6‰作为鉴别诊断微核超过本地区正常参考值标准[11]，选择ROC曲线上最靠近左上方的点，根据统计结果中各可能切点的灵敏度和特异度计算约登指数，以约登指数最大的切点为临界点(约登指数=敏感度+特异度-1)。ROC曲线显示曲线下面积(AUC)为0.962，标准误为0.043，P=0.001，95%置信区间为0.88~1.00，依据约登指数最大原则，确定流式微核检测的最佳临界值为12.5‰，此时灵敏度为85.7%，特异度为92.3%(图 2)。
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图 2 ROC曲线分析流式细胞术检测微核临界值 注：参考线代表被试者的辨别力为0 Figure 2 The threshold of ROC curve analysis for the MN detection using flow cytometry. |
讨论
职业健康检查或临床检验人外周血淋巴细胞微核，可监测环境和职业暴露引起的遗传损伤。《放射工作人员职业健康监护技术规范》GBZ 235-2011检查项目及周期规定，外照射和内照射工种淋巴细胞微核率为必检项目，多数实验室常采用常规微量全血培养微核检测方法[12]。Lukamowicz等[8]利用基因毒性和非基因毒性化合物染毒人外周血淋巴细胞，运用三染料染色流式检测微核，得到与细胞分裂阻滞技术一致结果。Lukamowicz-Rajska等[13]进一步研究利用淋巴细胞作为小型化外源化合物毒性检测模型，快捷、简便的检测外源毒物的遗传毒性。自动化检测应用在人群微核监测未见报道。
常规微量全血培养微核检测方法所制定的MN剂量-效应曲线可快速、准确估算剂量，与染色体畸变分析结合使用可相互补充和验证[14-15]。本研究利用流式细胞术自动检测外周血淋巴细胞微核结果存在明显的剂量-效应关系，与先前报道一致[16-17]。两种检测方法的相关系数显示，流式细胞术检测微核和常规微核检测方法的一致性强，有良好的相关性。流式细胞术应用在人外周血淋巴细胞微核检测上免除了人工阅片的客观性差和耗时长等缺点，实现了自动化检测微核，为职业健康检查、临床检测人外周血淋巴细胞微核奠定了基础。
本研究在流式细胞术检测微核结果存在明显的剂量-效应关系的基础上尝试将流式细胞术自动检测应用在临床微核检测中。ROC曲线用图形显示新的检测方法的灵敏度和特异度之间相互关系，曲线下面积可以作为检测方法准确性评价的指标[18-19]。为了进一步说明流式细胞术检测微核应用临床的可能性，本研究采用ROC曲线分析，确定流式检测微核超标的最佳临界值。灵敏度＞80%和特异度＞90%，曲线下面积为0.962均提示新的检测方法具有较好的准确性，验证流式自动检测淋巴细胞微核应用在临床检测的可能性。
Bitgen等[20]报道泌乳素瘤发生的风险和微核率升高呈正相关，基于微核试验可预测癌症发生[21]，国家卫生计生委发布关于增补血液淋巴细胞微核率检测等3项临床检验项目，纳入《医疗机构临床检验项目目录》。使得外周血淋巴细胞微核检测在监测遗传损伤，预测肿瘤发生、监控肿瘤放化疗预后等方面得以临床应用。因此建立流式细胞仪自动检测外周血淋巴细胞微核试验方法有着广泛的应用前景和市场需求。
利益冲突 无作者贡献声明 杨学琴负责实验设计、实验操作和论文撰写；李丽梅、陈钰婷和高朝贤协助实验；刘征宇协助实验；惠长野和张文负责试验统筹规划
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