2018, Vol. 38
2. 030032 太原, 山西大医院放疗科
2. Department of Radiotherapy, Shanxi Dayi Hospital, Taiyuan 030032, China
近些年，放射治疗成为脑部肿瘤患者的重要治疗手段，但是放疗在杀死肿瘤细胞的同时，会通过电离辐射的间接作用产生的活性氧对照射范围内的正常细胞造成伤害，引起学习、记忆等认知功能损伤，降低患者生存质量[1]。氢气是一种无毒无害的天然气体，2007年Ohsawa等[2]报道了氢气可以通过选择性清除羟自由基减轻缺血再灌注引起的脑损伤。从此氢气的生物学功效越来越受到人们的重视，而氢气在辐射防护领域的应用也得到进一步研究发展。由于氢气具有易燃易爆性，本实验采用将氢气溶于水中的方式制成富H2水，通过饮用摄入体内，使实验安全可靠。照射条件模拟人全颅放疗，从而探究富H2水对电离辐射致大鼠认知功能损伤的保护作用，为今后的实际应用提供参考资料。
材料与方法1.实验动物及分组：SPF级5～6周龄SD大鼠20只，雄性，体重140～170 g, 中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK-(军) 2012 -0004，合格证号：0035516；动物饲养管理于中国辐射防护研究院GLP中心屏障环境中，使用许可证号：SYXK(晋) 2013-0002。利用随机数表法，将SD大鼠按体重随机分为对照组(C)、富H2水组(HRW)、单纯照射组(IR)、富H2水干预组(HRW+IR)4个组，每组5只。C组和HRW组不接受照射，分别按20 ml/kg灌胃纯化水和富H2水；IR组和HRW+IR组接受20 Gy单次全颅照射，照前0.5 h及照后持续30 d分别20 ml/kg灌胃纯化水和富H2水。
2.试剂与仪器设备：HS-71便携式富氢水机(上海鹭樱环保科技发展有限公司)，氢气浓度为0.46 mmol/L；Elekta Synergy型直线加速器(英国Elekta有限公司)；Morris水迷宫(中国医学科学院药物研究所)；超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、丙二醛(MDA)、8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)检测试剂盒(南京建成生物工程研究所)；SN25776型酶标仪(美国Biotek公司)；柱式动物组织总RNA抽提纯化试剂盒(上海生工生物工程有限公司)；PrimeScriptTM反转录试剂盒、SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒(日本TaKaRa公司)；Light Cycler480Ⅱ型荧光定量PCR仪(德国Roche公司)。
3.照射条件：6 MeV直线加速器脑部单纯照射，照射剂量20 Gy，剂量率3 Gy/min, 源皮距1 m。
4. Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力：富H2水干预30 d后进行Morris水迷宫实验，并采用Morris水迷宫测试及分析系统采集实验图像并对数据进行分析。①定位航行实验。在正式实验开始前1 d将大鼠放入未放置平台的水池中自由游泳2 min，熟悉实验环境。定位航行实验周期为5 d，每天训练1个时段，每个时段训练4次，分别从4个象限的4个入水点入水，训练前将平台放在SE象限中，将大鼠面向池壁从入水点放入池中，对大鼠的游泳轨迹进行跟踪记录，并记录其从入水到爬到平台(四肢均在平台上)的时间，此时间即为逃避潜伏期(escape latency，LT)。让大鼠在平台上休息数秒后放回笼中。如果大鼠在2 min内未找到平台，则由实验人员将其引至平台，其逃避潜伏期记为120 s。计算每一时间段内4次逃避潜伏期均数作为这一时间段的成绩，并进行统计。②空间探索实验。在定位航行实验后进行，即第6天撤去平台，任选一个入水点将大鼠放入池中，记录1 min内大鼠的游泳轨迹并进行分析。观察分析其穿过原平台所在位置的次数，记录大鼠在原平台象限停留时间、平台象限游泳距离及穿越平台次数，以检测大鼠的空间记忆能力。
5.大鼠脑皮质SOD、GSH、MDA、8-OHdG浓度测定：富H2水干预30 d后，参照SOD、GSH、MDA、8-OHdG试剂盒说明书进行检测。
6. mRNA表达水平的检测：采用SYBR Green实时荧光定量PCR技术，对凋亡相关基因表达水平检测caspase-3、caspase-8、caspase-9、bax、bcl-2基因的表达水平，采用生工生物工程股份有限公司设计合成的引物(表 1)，以管家基因(β-肌动蛋白)作为内参，将4个组动物提取的总RNA反转录成cDNA。以cDNA为模板，进行PCR反应。反转录反应条件为：总RNA 10 μl和反转录混合液10 μl混匀成20 μl的反应体系，放入PCR仪，经37℃反应15 min，85℃反应5 s后终止反应。PCR反应条件为：以2 μl cDNA为模板，混合液10 μl，正反向引物各0.8 μl，双蒸水6.4 μl混匀形成20 μl的反应体系进行PCR反应，95℃，30 s预变性；95℃变性5 s；60℃退火和延伸20 s；40个循环，每个样品做3次重复。以β-肌动蛋白为参比基因，对所有样品进行归一化处理，实验结果用LightCycler480版软件分析。采用2-△△Ct相对定量法估算出大鼠海马caspase-3、caspase-8、caspase-9、bax、bcl-2基因的相对表达量。
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表 1 PCR扩增基因的引物序列 Table 1 Primer sequences of the amplified gene for PCR assay |
7.统计学处理：使用SPSS 16.0软件进行分析。数据经正态性检验符合正态分布，以x ±s表示。水迷宫定向导航实验采用重复测量的方差分析，采用LSD法进一步进行两两比较；空间探索实验及内源性抗氧化剂和氧化损伤相关指标多组间均数比较，经方差齐性检验后采用单因素ANOVA方差分析，并采用LSD法进一步进行两两比较；凋亡相关基因表达水平比较采用两独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
结果1.富H2水干预后各组大鼠Morris水迷宫试验结果：列于表 2，3。由表 2可知，大鼠逃避潜伏期在时间及分组处理上差异均有统计学意义(F=57.147、6.003，P＜0.05)，第3、4和5天HRW+IR组大鼠逃避潜伏期较IR组缩短，差异有统计学意义(P＜0.05)；由表 3可知，4组间的平台象限游泳距离差异具有统计学意义(F=3.850，P＜0.05)，HRW+IR组较IR组原平台象限游泳距离延长，差异有统计学意义(P＜0.05)。
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表 2 富H2水干预后大鼠Morris水迷宫定向导航实验结果(s，x±s) Table 2 Directional navigation experiments in the Morris water maze with hydrogen-rich water intervention (s,x±s) |
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表 3 富H2水干预后大鼠Morris水迷宫空间探索实验结果( x±s) Table 3 Spatial navigation in the Morris water maze with hydrogen-rich water intervention ( x±s) |
2.富H2水对照射后脑组织中内源性抗氧化剂和氧化损伤的影响：结果列于表 4。从表 4可知，4组间的GSH、8-OHdG、MDA差异均具有统计学意义(F=6.450、5.033、4.113，P＜0.05)，进一步进行两两比较，与IR组相比，HRW+IR组大鼠脑组织中GSH浓度升高，差异有统计学意义(P＜0.05)，8-OHdG、MDA浓度均降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
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表 4 富H2水干预后大鼠GSH、SOD、MDA、8-OHdG浓度比较(x±s) Table 4 Concentrations of GSH, SOD, MDA and 8-OHdG in rat with hydrogen-rich water intervention (x±s) |
3.富H2水干预后各组大鼠凋亡相关基因实时荧光定量PCR结果：凋亡相关基因caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2和bax的PCR结果如表 5所示。利用2－ΔΔCT法对检测结果进行分析，其中对照组的caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2和bax基因表达量设为1，与IR组相比，HRW+IR组caspase-3、caspase-9基因表达水平均下降，且差异有统计学意义(t=2.956、3.087，P＜0.05)；bcl-2基因表达水平升高(t=-3.640，P＜0.05)，bax基因表达水平降低(t=5.246，P＜0.05)。
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表 5 富H2水干预后大鼠caspase-3、caspase-8、caspase-9、bcl-2和bax基因RT-PCR扩增的相对定量结果(x±s) Table 5 Quantitative results of RT-PCR assay for caspase-3, caspase-8, caspase-9, bcl-2 and bax in the brain of rat with hydrogen-rich water intervention (x±s) |
讨论
针对头颈部肿瘤患者的放射治疗手段已得到广泛应用，但其在延长患者生存期的同时，也使得患者发生放射性脑损伤的可能性大大增加，尤其是罹患头颈部肿瘤的儿童，其经过放射治疗生存期明显延长，但随着年龄的增长，会逐渐表现出认知功能损伤症状[3]，对其生长发育及生存质量产生不良影响。诸多研究表明，电离辐射会导致神经元数量减少，进而使得海马依赖性的认知功能障碍的发生[1]。海马在人体大脑内主要负责学习记忆功能，电离辐射可以通过损伤海马的神经元细胞使人海马依赖性的学习记忆等认知功能受损，还会影响空间的学习和记忆能力[4]。
目前，仅有WR-2721作为辐射防护剂被美国食品及药品管理局(FDA)认可，其作用机制是通过清除自由基尤其是羟自由基来发挥辐射保护作用[5]，但不良反应大，服用后会出现头昏、呕吐等，所以，寻找一种有效且不良反应小的辐射防护剂十分必要。氢气作为一种无毒无害且易获取的天然抗氧化剂，其应用领域十分广泛，且在辐射防护领域也受到极大关注。近几年的研究中，富氢溶液已被发现具有保护大脑[2]、心肌[6]、肝脏[7]等组织器官的作用。钱李仁和蔡建明[8]通过对小鼠进行2和4 Gy γ射线全身照射，并腹腔给予富氢溶液干预，发现富氢溶液对电离辐射所致造血系统损伤具有保护作用。梅柯[9]通过对建立的局部放射性皮炎大鼠和人正常永生化表皮细胞系HaCaT细胞照射后给予富氢溶液干预发现，富氢溶液除减轻电离辐射所致氧化损伤反应外，还可通过改变炎症相关因子、促进生长因子的表达对电离辐射所致皮肤损伤起到一定的保护作用。辐射防护领域研究者通过研究普遍认为氢气可以通过清除活性氧而达到辐射保护的作用[10]。
本次Morris水迷宫定位航行和空间探索实验结果显示，IR组大鼠的逃避潜伏期和平台时间象限游泳距离均长于C组和HRW+IR组，说明电离辐射可影响大鼠学习记忆能力，且富H2水的干预对电离辐射致认知功能障碍具有一定的改善作用。机体在接受电离辐射时，产生的氧自由基会使组织中的脂质和DNA发生过氧化反应，进而产生MDA和8-OHdG等终产物。通过对过氧化反应终产物进行检测，可以反映脑组织的氧化损伤程度以及富H2水对脑组织的电离辐射防护效果。本研究检测了脑皮质中SOD、GSH、MDA和8-OHdG等氧化应激指标，检测结果发现，富H2水对辐照大鼠进行干预后GSH含量较IR组活性显著升高，提示富H2水对脑组织中的内源性抗氧化剂可能具有一定的保护作用，并且富H2水干预后过氧化终产物MDA和8-OHdG浓度较IR组显著下降，提示灌胃给予富H2水可以减少氧化应激造成的机体损伤。本研究结果中，IR组与对照组SOD活性差异不明显，原因可能是由于经辐照后，大鼠机体具有较强的抗氧化防御系统来减轻电离辐射造成的氧化压力，导致SOD活力应激性地升高。本研究提示，富H2水可以通过中和ROS抑制电离辐射产生的间接作用，从而避免生物大分子过氧化，达到抗氧化效果，减少电离辐射对大脑的损伤作用。
bcl-2家族及其相关蛋白根据其功能可以分为促凋亡和抑凋亡两类，其中bcl-2、bcl-XL等抑制细胞凋亡，bax、bid、bim等促进细胞凋亡。bcl-2可以通过抑制活性氧而影响细胞凋亡的发生。且有研究发现，bax和bcl-2两者的比例是决定抑制细胞凋亡作用强弱的关键因素[11]。本研究就富H2水干预对bax和bcl-2在海马组织中的基因表达情况进行检测发现，与IR组相比，HRW+IR组bcl-2基因表达水平显著升高，bax基因表达水平显著降低。提示H2可能通过提高抑制凋亡基因的表达水平，降低促进凋亡基因的表达水平来抑制照射后细胞的凋亡，从而对机体产生保护作用。
除此之外，caspase家族与电离辐射引起的细胞凋亡也有密切联系[12]，其多数成员参与了凋亡的发生过程，其中caspase-2、caspase-8、caspase-9和caspase-10参与细胞凋亡的起始阶段，caspase-3、caspase-6和caspase-7参与细胞凋亡的执行过程。细胞凋亡的信号传导通路主要有两条途径，即死亡受体途径和线粒体途径，这两种途径共同的作用点为caspase-3的活化[13-14]，caspase-8是死亡受体途径的主要成分，此途径是在死亡受体与死亡受体配体结合后激活caspase-8后凋亡信号逐级传递而发挥作用的；caspase-9是线粒体途径的主要组成部分，线粒体途径的作用过程为线粒体释放细胞色素C，进而活化caspase-9，活化后的caspase-9酶解caspase-3前体从而活化caspase-3，两种途径均要通过效应caspase即caspase-3诱导凋亡的发生[15]。本研究主要对细胞凋亡的两条信号传导通路中关键因子caspase-3、caspase-8和caspase-9的表达情况进行检测分析，结果显示，与IR组相比，HRW+IR组caspase-3和caspase-9表达显著下降，提示富H2水干预主要影响细胞凋亡信号传导通路中的线粒体途径中关键因子的表达。综合以上研究结果，提示H2可能通过中和氧羟自由基，减少电离辐射的氧化损伤作用，从而影响细胞凋亡过程进而对大脑产生保护作用，且其可能与线粒体途径相关。
本实验初步探究了富H2水对单纯照射脑导致的认知功能损伤的保护作用，说明富H2水对电离辐射致脑损伤具有一定的保护作用。随着近几年人们对氢气研究的深入，氢气优越的特性以及广泛的作用在生物领域也越来越受到人们的重视，氢气易获取、天然无毒等优点，使其今后具有更加广阔的应用前景。
利益冲突 所有研究人员在进行该研究时，未因执行此研究而获得职务、金钱及其他不正当的财务利益，在此对研究的独立性和科学性予以保证作者贡献声明 刘梦雅负责PCR实验操作、检索文献并撰写论文；宋建波负责提供动物照射设施及指导；高洁和王新钢负责Morris水迷宫实验的操作；袁慧、王永丽和岳娟负责SOD、GSH、MDA、8-OHdG的检测和数据分析；秦秀军和李建国负责设计实验方案，指导实验操作；闻建华指导论文修改
| [1] |
Rola R, Raber J, Rizk A, et al. Radiation-induced impairment of hippocampal neurogenesis is associated with cognitive deficits in young mice[J]. Exp Neurol, 2004, 188(2): 316-330. DOI:10.1016/j.expneurol.2004.05.005 |
| [2] |
Ohsawa I, Ishikawa M, Takahashi K, et al. Hydrogen acts as a therapeutic antioxidant by selectively reducing cytotoxic oxygen radicals[J]. Nat Med, 2007, 13(6): 688-694. DOI:10.1038/nm1577 |
| [3] |
Krull KR, Minoshima S, Edelmann M, et al. Regional brain glucose metabolism and neurocognitive function in adult survivors of childhood cancer treated with cranial radiation[J]. J Nucl Med, 2014, 55(11): 1805-1810. DOI:10.2967/jnumed.114.142950 |
| [4] |
冀胜军. bdnf基因转录的表观遗传调控在电离辐射所致神经发生损伤及认知功能障碍过程中的作用研究[D]. 苏州: 苏州大学, 2014. Ji SJ. The role of epigenetic regulation of bdnf gene transcription in radiation-induced neurogenesis damage and cognitive dysfunction[D]. Suzhou: Soochow University, 2014. |
| [5] |
Gosselin TK, Mautner B. Amifostine as a radioprotectant[J]. Clin J Oncol Nurs, 2002, 6(3): 175-176, 180. DOI:10.1188/02.CJON.175-176 |
| [6] |
Hayashida K, Sano M, Ohsawa I, et al. Inhalation of hydrogen gas reduces infarct size in the rat model of myocardial ischemia-reperfusion injury[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2008, 373(1): 30-35. DOI:10.1016/j.bbrc.2008.05.165 |
| [7] |
Fukuda K, Asoh S, Ishikawa M, et al. Inhalation of hydrogen gas suppresses hepatic injury caused by is ischemia/reperfusionthrough reducing oxidative stress[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 361(3): 670-674. DOI:10.1016/j.bbrc.2007.07.088 |
| [8] |
钱李仁, 蔡建明. 富H2溶液对细胞及造血系统的辐射防护效应研究[D]. 上海: 第二军医大学, 2011. Qian LR, Cai JM. Radioprotective effects of hydrogen on cultured cells and murine hematopoietic system[D]. Shanghai: Second Military Medical University, 2011. |
| [9] |
梅柯. 富H2溶液对表皮细胞及皮肤的辐射防护效应与机制研究[D]. 上海: 第二军医大学, 2013. Mei K. Radioprotective effects of hydrogen on HaCaT cells and head-and-neck skin of rats[D]. Shanghai: Second Military Medical University, 2013. |
| [10] |
Qian LR, Cao F, Cui J, et al. Radioprotective effect of hydrogen in cultured cells and mice[J]. Free Radic Res, 2010, 44(3): 275-282. DOI:10.3109/10715760903468758 |
| [11] |
Oltval ZN, Milliman CL, Korsmeyer SJ. Bcl-2 heterodimerizes in vivo with a conserved homolog Bax, that accelerates programmed cell death[J]. Cell, 1993, 74(4): 609-619. DOI:10.1016/0092-8674(93)90509-O |
| [12] |
Verheyde J, Benotmane MA. Unraveling the fundamental molecular mechanisms of morphological and cognitive defects in the irradiated brain[J]. Brain Res Rev, 2007, 53(2): 312-320. DOI:10.1016/j.brainresrev.2006.09.004 |
| [13] |
Nuňez G, Benedict MA, Hu Y, et al. Caspases:the proteases of the apoptotic pathway[J]. Oncogene, 1998, 17(25): 3237-3245. DOI:10.1038/sj.onc.1202581 |
| [14] |
Schulze-Osthoff K, Ferrari D, Los M, et al. Apoptosis signaling by death receptors[J]. Eur J Biochem, 1998, 254(3): 439-459. DOI:10.1046/j.1432-1327.1998.2540439.x |
| [15] |
聂艳丽, 阮之平, 南克俊. 吉西他滨作用于肝癌HepG2细胞后对DR5、caspase-8、caspase-9和caspase-3表达的影响[J]. 肿瘤防治研究, 2013, 40(2): 134-137. Nie YL, Ruan ZP, Nan KJ. Expreaaions of DR5, caspase-8, caspase-9 and caspase-3 HepG2 cell line treated with gemcitabine[J]. Cancer Res Prevent Treat, 2013, 40(2): 134-137. DOI:10.3971/j.issn.1000-8578.2013.02.003 |