2015, Vol. 38
2. 318000 台州市中心医院 台州学院附属医院检验科;
3. 325000 温州医科大学
2. Clinical Laboratory, Taizhou Central Hospital, Affiliated Hospital of Taizhou University, Taizhou 318000, China;
3. Wenzhou Medical University, Wenzhou 325000, China
放疗是恶性肿瘤的主要治疗手段之一，约70%的恶性肿瘤患者需要放疗。然而放疗后肿瘤消退情况和局部控制率在不同瘤种以及相同瘤种不同病理类型上存在明显差异，主要原因在于放射敏感性不同，即存在放射抗拒性。增加放射治疗剂量，并提高放射敏感性，降低甚至逆转肿瘤细胞放射抗拒性是解决这一问题的两个重要方向。对于前者，运用IMRT、SBRT等新技术提高照射剂量的同时降低危及器官损伤，改变照射方式及分割剂量，在鼻咽癌、胰腺癌等取得了一定效果[1-3]。对于后者，通过分析放射敏感/抗拒肿瘤细胞的差异，探索放射抗拒相关信号通路，明确关键节点，予以抑制/阻断以期提高肿瘤细胞放射敏感性，即增敏作用。构建放射抗拒性肿瘤细胞株是重要的基础工作，放射抗拒性的形成有两条途径：一是内源性放射抗拒，即肿瘤细胞间放射敏感性不同，部分细胞放射抗拒；二是获得性放射抗拒，即放射抗拒性是在放疗过程中产生[4]。因此，通过多次照射，筛选内源性放射抗拒肿瘤细胞，诱导肿瘤细胞产生获得性放射抗拒，可以建立放射抗拒性肿瘤细胞株。目前各类文献报道，构建放射抗拒性肿瘤细胞株方法不同，其生物学特性也存在一定差异，最优选方法并不明确，如何合理、高效地构建放射抗拒性肿瘤细胞株至关重要。
一、放射线诱导肿瘤细胞放射抗拒性方法多数文献选择指数期作为照射时机，此时细胞活力最强，状态最好，干预措施能达到较好效果。早期研究常见的照射源是60Co、139Cs，随着直线加速器的普及，6 MV X射线成为主流。在照射方法上，不同研究差异较大，庄喜兵等[5]构建放射抗拒Lewis肺癌细胞株时采取了如下照射方法：6 MV X射线，照射野7 cm×7 cm，源靶距100 cm；培养瓶口上盖1.0 cm固体水模板。姚元虎等[6]选择6孔板作为细胞载体，在板底覆盖1.5 cm厚的组织等效填充物并自下予以照射：6 MV X射线，吸收剂量率300 cGy/min，源皮距100 cm。也有研究在吸尽培养液后，使培养瓶底朝上，上盖1.5 cm补偿层[7]。由于肿瘤细胞长时间脱离培养液，可能造成细胞损伤甚至死亡，因此需严格把控操作时间；同时残留的培养液可能流至培养瓶口，增加污染风险，因此该方案鲜见采用。而前两者方案中肿瘤细胞不脱离培养液，无溢液风险，可操作性更强，因此更为合理。
二、构建放射抗拒性细胞株的照射模式根据分割剂量、照射次数及不同分割剂量组合方式等因素的不同，可以分为4种照射模式：常规照射模式；反复照射模式；梯度照射模式；其他照射模式。
1.常规照射模式：2 Gy/次，每周连续照射5 d。在该照射模式下，Michna等[8]对头颈部鳞癌细胞株CAL-33-RP给予20 Gy照射构建放射抗拒性细胞株，并通过克隆形成实验验证。常规照射模式的实施与临床相同，生物学特性可能更贴近临床实践。
2.反复照射模式：以相等的分割剂量照射，胰酶消化传代，待细胞恢复到指数期再次照射。分割剂量可以是常规剂量(1.8~2.0 Gy/次)、亚致死剂量或经验性剂量。Luo等[9]和Yang等[10]反复照射乳腺癌(MCF-7、T-47D)和宫颈癌细胞株C33 A(1.8 Gy×24次＝43.2 Gy、2 Gy×30次＝60 Gy)构建放射抗拒性细胞株，虽然分割剂量同于常规照射模式，区别在于细胞恢复至指数期后开始再次照射。相同的照射模式也用于构建鼻咽癌(60 Gy)[11]、头颈部肿瘤(70、90 Gy)[12-13]、胰腺癌(20 Gy)[14]、前列腺癌(60 Gy)[15]和直肠癌(80 Gy)[16]等放射抗拒性细胞株。亚致死剂量是导致50%细胞死亡的照射剂量，往往高于常规剂量。Guo等[17]对肺癌细胞NCI-H520细胞株给予累计8次的亚致死剂量(10 Gy)，并通过克隆形成实验、四甲基偶氮唑盐(MTT)实验验证NCI-H520R具有强放射抗拒性。一些文献未指明分割剂量的设定依据，Shapiro等[18]构建尤文肉瘤放射抗拒性细胞株，给予24 Gy(4 Gy×6次)照射。庄喜兵等[5]构建肺癌放射抗拒细胞株R-LLC时给予30 Gy(5 Gy×6次)的照射。这些研究可能参考既往文献，或根据肿瘤细胞株特性及实验条件经验性选择。
3.梯度照射模式：在构建初期，无论内源性或获得性放射抗拒细胞占比通常较低。在照射过程中，放射敏感细胞死亡，内源性放射抗拒细胞增殖，获得性放射抗拒细胞累积，逐步提高分割剂量不会导致细胞过多死亡，这是梯度照射模式的理论依据。Wang等[19]对肺癌细胞株A549给予(2 Gy+4 Gy×2次+6 Gy×2次＝22 Gy)和(2 Gy+4 Gy×2次+6 Gy×2次+8 Gy＝30 Gy)照射，稳定传代5代后，放射抗拒性高于亲本细胞株。Yao等[20]则照射(2 Gy×2次+4 Gy×2次+6 Gy×2次+8 Gy×2次＝60 Gy)构建了A549R和H1299R肺癌放射抗拒性细胞株。梯度照射模式还应用于构建食管癌(37、60或120 Gy)[21-22]、直肠癌(21 Gy)[23]和脑胶质瘤(62 Gy)[24]等放射抗拒性细胞株。
4.其他照射模式：根据特定研究目的，或受限于实验条件，可采用某些特别的照射模式。Nakajima等[25]认为，肿瘤细胞对放射线的生物反应不仅与放射线种类及照射剂量有关，还与放射线的剂量率及持续照射时间相关，因此作者设计如下照射模式：细胞株M059 K和U2OS，1.85 PBq 60Co γ射线，53.6 mGy/h持续照射，每周传代2次。
三、照射总剂量和构建周期不同文献研究的肿瘤细胞株及采取的照射模式不同，给予的总照射剂量和构建周期亦不同。在常规照射模式下，肿瘤细胞每次照射2 Gy，每周连续照射5 d。Michna等[8]构建头颈部鳞癌CAL-33-RP(20 Gy)放射抗拒性细胞株，构建周期为2周。You等[26]通过反复照射模式(2 Gy×40次＝80 Gy)构建A549-IRR等肺癌放射抗拒性细胞株，为时5个月。同样的照射模式在Yang等[10]的研究中，虽然总照射剂量仅60 Gy，但构建周期长达12个月。庄喜兵等[5]构建放射抗拒肺癌细胞株R-LLC(5 Gy×6次＝30 Gy)，耗时约4个月。在梯度照射模式下，Jin等[21]构建食管癌放射抗拒性细胞株(37 Gy)，周期约2个月。Khoshinani等[23]对直肠癌细胞株HCT 116给予21 Gy照射, 构建RR1和RR2细胞株，需要3个月。Zhou等[22]构建食管癌放射抗拒性细胞株TE13R120和ECA109R60，照射60或120 Gy，耗时超过4个月。Yang等[24]照射(1 Gy×2次+2 Gy+4 Gy+6 Gy+8 Gy+10 Gy×2次＝60 Gy)构建脑胶质瘤放射抗拒细胞株，周期为5个月。
采取其他照射模式的研究往往有特定的实验目的。Nakajima等[25]以细胞株M059 K和U2OS研究放射抗拒性与放射线的剂量率及持续照射时间的相关性，通过持续性照射，总照射剂量达286 Gy，时间达222 d。Kuwahara等[27]以0.5 Gy×2次/d，累计照射1 600 Gy，耗时超过6年，构建放射抗拒性肝癌细胞株。
四、不同照射模式下肿瘤细胞生物学特性在不同照射模式下，肿瘤细胞的生物学特性存在差异，多次照射较单次照射，梯度照射较反复照射更能激活肿瘤细胞基因差异化表达。Ahn等[28]通过梯度照射模式(55 Gy)和反复照射模式(28 Gy)构建放射抗拒性肺癌细胞株A549-G和H1650-G，分别有72和655个基因发生改变，且在不同的照射模式下基因变化差异明显。不同照射模式下肿瘤免疫反应不同[29]。Dewan等[30]在小鼠模型上发现，虽然多次/单次照射均可抑制肿瘤生长，但联合CTLA-R抗体时，多次照射(8 Gy×3次或6 Gy×5次)较单次照射(20 Gy)更能导致远隔效应。Stankevicius等[31]对Lewis肺癌细胞给予(2 Gy×1次、10 Gy×1次、2 Gy×5次)照射，与未照射细胞相比，分别有422、1 258和1 465个基因表达发生变化，数目上呈现照射剂量依赖性，而且在3种照射下，发生表达变化的基因多数是不同的。Aryankalayil等[32]以1 Gy×10次和10 Gy×1次照射前列腺癌细胞株，多次照射较单次照射更强地激活IFI27在内的多种免疫应答基因。Kulzer等[33]通过照射肠癌细胞株SW480发现，与单次照射(15 Gy)相比，多次照射(5 Gy×3次、3 Gy×5次)使细胞因子IL-12p70、IL-8、IL-6和TNFα水平更高，更能促进树突状细胞(DC)成熟和活化。这项研究同时说明，相同的照射模式不同的分割剂量也可导致不同的生物学效应。
五、照射模式的优化选择多数研究借助临床放疗设备完成构建，常规、反复及梯度等照射模式基本均可开展。不同的文献采取的照射模式不同，总照射剂量和构建周期均存在较大差异。常规照射模式总剂量偏低，构建周期相对短。反复和梯度照射模式给予的照射总剂量通常在60~80 Gy之间，构建周期一般不超过12个月；其他照射模式因特定的实验目的，照射总剂量和构建周期差异明显。
总体而言，总照射剂量越高，分割剂量越低，照射次数越多，构建周期越长。在相同的总照射剂量下，常规照射模式下由于分割剂量低，照射次数多，污染风险大，构建周期相对更长。而采取亚致死/较高剂量的反复照射模式由于在构建初期即给予较高照射剂量，此时肿瘤细胞的放射抗拒性较低，在接受下一次照射前增殖恢复至指数期需更长时间。梯度照射模式随着细胞株放射抗拒性增强而逐步提高分割剂量，较好地平衡了分割剂量和照射后细胞恢复至指数期时间，照射次数较常规照射模式少，因此更具优势，这一论断得到了姚元虎等[6]和邱祥南等[34]的研究证实。
不同的照射模式下，肿瘤细胞的生物学特性存在差异。因此采取不同照射模式的文献，研究结果、结论可供参考，但可比性存疑，在构建放射抗拒性肿瘤细胞株时应予重视。构建临床相关放射抗拒性细胞株(clinically relevant radioresistant，CRR)旨在解决这一问题，目的在于保持放射抗拒/亲本细胞株基因型相同或类似。Kuwahara等[27]通过不同的照射模式开展了持续研究。其对HepG2-A、HepG-400和HepG2-89细胞给予0.5 Gy/次，12 h 1次，总照射剂量超过1 600 Gy，照射时间超过5年。这些细胞继续给予2 Gy/次、连续30 d的照射，结果HepG2-A和HepG-400丧失增殖能力，仅有少量HepG2-89细胞存活，具有明确的强放射抗拒性，经培养增殖后命名为HepG2-89-R。这是第1个CRR肿瘤细胞株，并且继续以2 Gy/24 h照射超过1年，细胞基因型未发生变化。2017年，Kuwahara等[35]改而采用梯度照射模式[0.5 Gy×5次+1.0 Gy×10次+1.5 Gy×15次+2.0 Gy×(>30次)]先后构建了20株不同的CRR肿瘤细胞株。与前研究相比，在保证获得明确的强放射抗拒性的前提下，总照射剂量下降，照射次数减少，构建周期缩短，且分割剂量不高于2 Gy，贴合临床实践。
综上所述，相对于常规、反复及其他照射模式，梯度照射模式较好地平衡了总照射剂量、照射次数及构建周期，更具优势。不同的照射模式下构建的放射抗拒性肿瘤细胞株生物学特性存在差异，采取梯度照射模式构建的CRR肿瘤细胞株，具有与亲本细胞株相同的基因型，是肿瘤放射抗拒性研究的重要方向。
利益冲突 本研究还接受台州市科技计划项目(15yw02-5、1701KY33、1801ky41)资助，本人与其他作者以及基金无任何利益冲突作者贡献声明 吴波、王勇负责本文构思、文献筛选、甄别及论文修改；朱杰、应申鹏负责论文检索；吕佳铭、熊华才、负责论文撰写；胡洁负责论文校对；胡炜负责论文指导
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