2018, Vol. 38
2. 475000 开封, 河南大学淮河医院放疗科;
3. 450000 郑州大学第一附属医院放疗科;
4. 450045 郑州, 河南省人民医院放疗科
2. Department of Radiotherapy, Huaihe Hospital of Henan University, Kaifeng 475000, China;
3. Department of Radiotherapy, The First Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 450000, China;
4. Department of Radiotherapy, Henan Provincial People's Hospital, Zhengzhou 450000, China
结直肠癌是常见的恶性肿瘤，手术切除是临床治疗结肠直癌的主要方式[1-2]。目前临床上为提高结直肠癌患者的5年生存率和局部控制率，经常辅以放、化疗[3-4]。放射治疗过程中，放射敏感性降低是影响治疗效果的主要原因，因此，探究如何提高肿瘤细胞的放射敏感性具有重要意义。有研究表明，miRNA能增加或降低肿瘤细胞的放射敏感性[5-7]。miR-885-3p在多种恶性肿瘤中异常表达，与恶性肿瘤的形成密切相关，如非小细胞肺癌[8]、结肠癌[9]等。但关于miR-885-3p对肿瘤细胞放射敏感性的相关研究较少。本研究探讨miR-885-3p在放射诱导的结直肠癌HT-29细胞中的表达量及其对细胞放射敏感性的影响，并进一步阐明其发挥作用的分子机制，为提高结直肠癌的放射敏感性提供潜在靶点。
材料与方法1.实验主要材料：HT-29细胞购自中国科学院上海细胞库，DMEM培养基、胎牛血清、青-链霉素购自美国Hyclone公司，Lipofectamine 2000购自美国赛默飞世尔有限公司，miR-885-3p模拟物、anti-miR-885-3p、PGCSIL-siAKT1-GFP vector购自广州锐博生物有限公司，聚凝胺购自北京索莱宝科技有限公司，miRNA提取试剂盒购自上海Qiagen公司，反转录试剂盒、荧光定量PCR检测试剂盒购自美国应用生物系统公司，RIPA裂解液、凋亡试剂盒购自上海碧云天生物有限公司，丝苏氨酸蛋白激酶1(serine-threonine kinase1, AKT1)3′-UTR野生型双荧光素酶报告载体购自美国Sigma公司，活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3, Cleaved Caspase-3)抗体、B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/lewkmia-2, Bcl-2)抗体、AKT1抗体购自美国Cellular Signaling Technology公司，辣根过氧化物酶标记二抗购自武汉博士德生物有限公司。
2.细胞的培养：HT-29细胞培养于含10%胎牛血清DMEM培养基，并加入1 000 U/ml的青-链霉素，放入37℃、5%CO2培养箱中，待细胞浓度大于80%，加入胰酶消化、传代。
3.细胞克隆实验：取转染后细胞，分别用0、2、4、6、8 Gy剂量的X射线照射细胞，当细胞培养板中出现明显的细胞克隆，弃去培养液，甲醇固定30 min，结晶紫染色30 min，干燥，光学显微镜下观察大于50的细胞克隆数，计算克隆形成率。利用GraphPad Prism5软件进行单击多靶模型拟合存活曲线，计算放射生物学参数平均致死量(D0)、准闭剂量(Dq)、外推值(N)，计算放射增敏比(SER)。克隆形成率(PE, %)=克隆数/接种细胞数×100%，存活分数(SF)=受照射细胞PE/对照细胞PE。
4.荧光定量PCR(qPCR)检测miR-885-3p表达量：根据miRNA提取试剂盒说明书，提取细胞中总miRNA，使用反转录试剂盒将所提取的miRNA合成cDNA。以cDNA为模板，U6为参照，采用荧光定量PCR检测试剂盒进行qPCR反应。反应条件为95℃ 2 min，95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 8 min，40个循环。miR-885-3p上游引物为5′ CGCGGTATGGCACTGGTAGA 3′，下游引物为5′ AGTGCAGGGTC CGAGGTATTC 3′。实验重复3次，采用罗氏LC480软件计算Ct值，以2-ΔΔCt法计算miR-885-3p的相对表达量。
5.细胞的转染：根据Lipofectamine 2000试剂说明书将表达miR-NC、miR-885-3p、anti-miR-NC、anti-miR-885-3p、Scrambled、shAKT1和AKT1及其对照的慢病毒载体转入293T细胞进行慢病毒包装。HT-29细胞常规培养于DMEM培养基中，稳定传代后进行转染。转染前24 h，将细胞调整为1×105/ml，加入6孔板中，待细胞密度大于30%开始转染。在慢病毒感染过程中，取适量上述包装的慢病毒与500 μl DMEM培养基混合均匀，加入5 μg/ml聚凝胺，室温孵育30 min，置于6孔板中感染细胞并继续培养，12 h后更换为完全培养基，于37℃、5%CO2培养箱培养，用于后续实验。根据感染慢病毒不同，分别记为miR-NC组、miR-885-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-885-3p组、Scrambled组、shAKT1组。取miR-NC组、miR-885-3p组、anti-miR-NC组、anti-miR-885-3p组、Scrambled组、shAKT1组细胞，分别接受4 Gy剂量射线照射后，记为miR-NC+照射组、miR-885-3p+照射组、anti-miR-NC+照射组、anti-miR-885-3p+照射组、Scrambled+照射组、shAKT1+照射组。另取miR-885-3p组细胞分别感染过表达对照和AKT1的慢病毒，记为miR-885-3p+对照组和miR-885-3p+AKT1组。
6.细胞凋亡实验：收集转染后细胞，根据照射条件：源靶距(SSD)为100 cm，照射野10 cm×10 cm，照射剂量4 Gy，剂量率5 Gy/min，射野覆盖全细胞培养板。根据凋亡试剂盒所示，检测细胞的凋亡率。
7.蛋白质印迹法(Western blot)：收集处理后24 h的细胞，吸取10 μl放射免疫沉淀法(radio-immunoprecipitation assay, RIPA)裂解液，37℃孵育10 min，提取蛋白并进行浓度测定。将适量上样缓冲液与蛋白样品混合均匀，沸水变性10 min；吸取50 μg总蛋白进行10%的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后转移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜中，用5%的脱脂奶粉溶液封闭1 h；加入相应一抗，4℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育2 h，曝光、拍照，分析蛋白质相对表达量。
8.双荧光素酶报告基因：通过TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_71/)生物信息学预测软件预测miR-885-3p与AKT1的3′-端非编码区域(3′-UTR)碱基是否存在互补现象。分别构建AKT1 3′-UTR野生型双荧光素酶报告载体，并分别共转染miR-885-3p模拟物或anti-miR-885-3p，37℃、5%CO2培养箱中培养48 h，收集细胞，测定双荧光素酶的活性。
9.统计学处理：采用SPSS 22.0软件进行统计处理。所有计量数据经正态性检验均符合正态分布，结果以x±s表示。两组间数据的比较采用独立样本t检验，多组数据间的比较经方差齐性检验采用单因素方差分析，组间多重比较使用SNK-q检验。P < 0.05为差异具有统计学意义。
结果1.放射诱导HT-29细胞中miR-885-3p表达增加：qPCR检测经不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)照射后结直肠癌HT-29细胞中miR-885-3p表达增加，其表达量分别为1.00±0.06、1.87±0.19、2.95±0.30、3.25±0.33和3.54±0.35，2、4、6、8 Gy与0 Gy比较，差异均具有统计学意义(F=46.64，P < 0.05)；与2 Gy比较，4、6、8 Gy明显诱导细胞中miR-885-3p表达增加，差异具有统计学意义(F=17.85，P < 0.05)；与4 Gy比较，6和8 Gy照射后细胞中miR-885-3p表达差异无统计学意义(P>0.05)，故选择4 Gy进行后续实验研究。
2. miR-885-3p增强HT-29细胞放射敏感性：结果见图 1、表 1。qPCR检测结果显示，转染miR-885-3p模拟物后HT-29细胞中miR-885-3p的表达量明显升高，差异具有统计学意义(t=16.11，P < 0.05)；上调miR-885-3p可抑制HT-29细胞的存活分数，促进细胞凋亡，与miR-NC比较差异有统计学意义(t=12.33, P < 0.05)，见图 1A、B，表 1，转染miR-885-3p增加了Cleaved Caspase-3蛋白水平，降低了Bcl-2蛋白表达量，与转染miR-NC组比较, 差异具有统计学意义(F=56.27、54.44，P < 0.05)，见图 1C、表 2。
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图 1 miR-885-3p对照射后HT-29细胞存活和凋亡的影响A.单击多靶模型拟合细胞存活曲线；B.流式细胞仪检测细胞的凋亡率；C.Western blot检测细胞中Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白水平 注：1.miR-NC组；2.miR-885-3p组；3.miR-NC+照射组；4.miR-885-3p+照射组 Figure 1 The effect of miR-885-3p on survival and apoptosis of HT-29 cells after radiation A. Cell survival curve fitted by the single-hit multi-target model; B. Cell apoptosis rate detected by flow cytometry; C. Protein expressions of Cleaved Caspase-3 and Bcl-2 in the cells detected by Western blot |
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表 1 转染miR-885-3p对HT-29细胞单击多靶模型参数、miR-885-3p表达及凋亡率的影响(x±s) Table 1 Effect of transfecting miR-885-3p on the parameters of single-hit multi-target model, the expression of miR-885-3p and apoptosis in HT-29 cells(x±s) |
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表 2 转染miR-885-3p后HT-29细胞中凋亡相关蛋白的表达(x±s) Table 2 The expressions of apoptosis-related proteins in HT-29 cells after transfecting miR-885-3p(x±s) |
3. anti-miR-885-3p促进HT-29细胞放射抵抗：qPCR检测结果显示，转染anti-miR-885-3p模拟物后HT-29细胞中miR-885-3p的表达量明显降低，差异具有统计学意义(t=11.43，P < 0.05)，见表 3；anti-miR-885-3p可促进HT-29细胞的存活，抑制细胞凋亡，与anti-miR-NC比较，差异有统计学意义(t=11.94，P < 0.05)，见图 2A、B，表 3，转染anti-miR-885-3p降低了Cleaved Caspase-3蛋白水平，增加了Bcl-2蛋白表达量，与转染anti-miR-NC组比较，差异具有统计学意义(F=68.45、61.580，P < 0.05)，见图 2C、表 4。
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图 2 anti-miR-885-3p对照射后HT-29细胞存活和凋亡的影响A.单击多靶模型拟合细胞存活曲线；B.流式细胞仪检测细胞的凋亡率；C.Western blot检测细胞中Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白水平 注：1. anti-miR-NC组；2. anti-miR-885-3p组；3. anti-miR-NC+照射组；4. anti-miR-885-3p+照射组；GAPDH作为内参 Figure 2 The effect of anti-miR-885-3p on survival and apoptosis of HT-29 cells after radiation A. Cell survival curve fitted by the single-hit multi-target model; B. Cell apoptosis rate detected by flow cytometry; C. Protein expressions of Cleaved Caspase-3 and Bcl-2 in the cells detected by Western blot |
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表 3 转染anti-miR-885-3p对HT-29细胞单击多靶模型参数、miR-885-3p表达及凋亡的影响(x±s) Table 3 Effect of transfecting anti-miR-885-3p on the parameters of single-hit multi-target model, the expression of miR-885-3p and apoptosis in HT-29 cells(x±s) |
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表 4 转染anti-miR-885-3p后各组HT-29细胞中相关蛋白的表达(x±s) Table 4 The expressions of apoptosis-related proteins in HT-29 cells after transfecting anti-miR-885-3p(x±s) |
4. AKT1是miR-885-3p的靶基因：TargetScan数据库预测显示miR-885-3p与AKT1 3′UTR部分碱基互补配对，推测miR-885-3p可能对AKT1有一定的调控作用(图 3A)。双荧光素酶报告基因检测结果显示，当共转染miR-885-3p模拟物或anti-miR-885-3p进入293T细胞后，野生型AKT1 3′UTR 3′UTR报告基因的荧光素酶相对活性明显受到抑制或促进，差异具有统计学意义(F=76.05，P < 0.05)，见表 5；Western blot结果显示，转染miR-885-3p模拟物或anti-miR-885-3p对AKT1蛋白水平具有明显的调控作用，差异具有统计学意义(F=44.87，P < 0.05)，见图 3B、表 5。
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图 3 miR-885-3p对HT-29细胞中AKT1的靶向调控作用A. TargetScan数据库预测miR-885-3p对AKT1的调控关系；B. Western blot检测上调或下调miR-885-3p对AKT1蛋白表达的影响 注：1. miR-NC组；2. miR-885-3p组；3. anti-miR-NC组；4. anti-miR-885-3p组 Figure 3 The targeting regulation effect of miR-885-3p on AKT1 in HT-29 cells A. the regulation between miR-885-3p and AKT1 was predicted by TargetScan database; B. the effect of up- or down-regulating miR-885-3p on AKT1 protein expression was measured by Western blot |
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表 5 miR-885-3p或anti-miR-885-3p对野生型报告质粒荧光素酶相对活性及细胞中AKT1蛋白表达的影响(x±s) Table 5 Effects of miR-885-3p or anti-miR-885-3p on the relative luciferase activity of wild-type reporter plasmids and the expression of AKT1 protein in cells(x±s) |
5.敲减AKT1增强HT-29的放射敏感性：Western blot检测结果显示慢病毒转染后细胞中AKT1的表达量明显降低(t=13.630，P < 0.05)(图 4A、表 6)；敲减AKT1的表达量抑制HT-29细胞的存活分数，促进细胞的凋亡(t=12.95，P < 0.05)，升高Cleaved Caspase-3蛋白水平(F=50.39，P < 0.05)，降低Bcl-2蛋白表达量(F=45.08，P < 0.05)，差异具有统计学意义(图 4B、图 4C、表 6、表 7)。
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图 4 敲减AKT1对受照射HT-29细胞存活的影响A. Western blot检测慢病毒转染后细胞中AKT1的表达量；B.单击多靶模型拟合细胞存活曲线；C. Western blot检测细胞中Cleaved Caspase-3和Bcl-2蛋白水平 注：1.Scrambled组；2.shAKT1组；3.Scrambled+照射组；4.shAKT1+照射组 Figure 4 Effect of knockdown of AKT1 on the survival of HT-29 cells after radiation A. The expression of AKT1 in lentivirus transfected cells was detected by Western blot; B. Cell survival curve fitted by the single-hit multi-target model; C. The protein levels of Cleaved Caspase-3 and Bcl-2 in cells were measured by Western blot |
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表 6 敲减AKT1对HT-29细胞单击多靶模型参数、AKT1表达及细胞凋亡的影响(x±s) Table 6 Effect of knockdown of AKT1 on the parameters of single-hit multi-target model, the expression of AKT1 and cell apoptosis in HT-29 cells(x±s) |
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表 7 敲减AKT1后各组HT-29细胞中相关蛋白的表达(x±s) Table 7 The expressions of apoptosis-related proteins in HT-29 cells after knocking down AKT1(x±s) |
6.过表达AKT1逆转了miR-885-3p增强HT-29放射敏感性的作用：与miR-885-3p+Control相比，AKT1和miR-885-3p模拟物共转染入HT-29细胞显著增加细胞的存活分数，降低细胞的凋亡率，促进AKT1、Bcl-2蛋白表达，降低Cleaved Caspase 3蛋白水平，与转染前比较，差异均具有统计学意义(t=7.669、12.180、7.746、9.317，P < 0.05)，见图 5、表 8。
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图 5 过表达AKT1逆转miR-885-3p对HT-29细胞存活、凋亡及凋亡蛋白表达的影响A.单击多靶模型拟合细胞存活曲线；B.Western blot检测细胞中AKT1、Cleaved Caspase-3、Bcl-2蛋白水平 注：1. miR-NC组；2. miR-885-3p组；3. miR-885-3p+对照组；4. miR-885-3p+AKT1组 Figure 5 Overexpression of AKT1 reversed the effects of miR-885-3p on cell survival, apoptosis and the expressions of apoptotic proteins in HT-29 cells A. Cell survival curve fitted by the single-hit multi-target model; B. The protein levels of AKT1, Cleaved Caspase-3 and Bcl-2 in cells were detected by Western blot |
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表 8 过表达AKT1逆转miR-885-3p对HT-29细胞中单击多靶模型参数、凋亡及凋亡蛋白表达的影响(x±s) Table 8 Overexpression of AKT1 reverses the effects of miR-885-3p on the multipile target model parameters, apoptosis and expression of apoptotic protein in HT-29 cells(x±s) |
讨论
结直肠癌是最常见的恶性肿瘤，其发病率和死亡率位居全球恶性肿瘤的前列。目前对于结直肠癌的发病机制尚不完全清楚，结直肠癌的诊断和治疗仍是临床研究面临的挑战之一。尽管手术和放疗的治疗方法得到了巨大的发展，明显提高了结直肠癌患者的长期生存率和预后，但肿瘤细胞对放疗抵抗已成为临床进一步提高放疗效果的巨大挑战。放疗抵抗包括细胞中DNA的损伤、修复以及某些基因或者信号通路的异常激活，是一个复杂的生物学过程[10-11]。放疗抵抗是导致结直肠癌患者死亡的主要原因[12]。因此，深入研究结直肠癌放射敏感性的机制，寻找与其密切相关的基因，才有望逆转放疗抵抗并进一步提高患者预后。
miRNA是一类非编码单链小分子RNA，在细胞的生长、凋亡等生物学过程中发挥重要作用[13-15]。越来越多的研究证实，miRNA不仅在肿瘤细胞的侵袭、迁移等恶性生物学过程起重要作用，而且与肿瘤细胞的放射敏感性密切相关。目前已发现，miR-124[16]、miR-133a[17]、miR-451a[18]等多种miRNA能够调控结直肠癌细胞的增殖、凋亡等生物学过程，从而调节细胞的放射敏感性。然而miR-885-3p对结肠直癌细胞放射敏感性的相关影响暂不明确。在本研究中发现，在不同剂量(0、2、4、6、8 Gy)放射诱导的HT-29细胞中，miR-885-3p的表达量逐渐增加，差异具有统计学意义，其中4 Gy剂量增加幅度较高。过表达miR-885-3p可以抑制HT-29细胞增殖、诱导其凋亡，从而增强结直肠癌细胞的放射敏感性。
近年来的研究表明，磷酸化的AKT能够激活下游多种作用底物参与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、迁移过程，提高细胞的缺氧耐受性，增加机体血管的生成，促进细胞的放射抗性和化疗药物耐受性[19-22]。AKT在多种肿瘤组织中异常表达和磷酸化。AKT1是AKT的重要亚型之一，有研究发现，AKT1在结直肠癌中的表达量显著增加，在胃癌中也发现AKT1过度表达和活化，并在胃癌细胞的放射敏感性中发挥重要作用[23-24]。本研究通过生物信息学预测以及双荧光素酶报告基因实验表明AKT1是miR-885-3p功能性靶基因；上调和下调miR-885-3p可显著调节结直肠癌细胞中AKT1蛋白的表达量，进一步证实AKT1是miR-885-3p的直接靶基因；敲减AKT1抑制HT-29细胞的增殖、促进其凋亡，从而增强HT-29的放射敏感性；过表达AKT1逆转了miR-885-3p抑制放射诱导的细胞增殖、促进细胞凋亡作用，表明AKT1是miR-885-3p调节结直肠癌细胞放射敏感性的功能性靶基因。
综上所述，本实验结果发现，miR-885-3p通过调控AKT1增强结直肠癌HT-29细胞的放射敏感性，为临床提高结直肠癌放射敏感性提供了一个重要的实验依据和靶点。
利益冲突 全体作者无利益冲突，排名无争议，未因进行该研究而接受任何不正当的职务和财务利益作者贡献声明 李全营、吴大鹏设计研究方案、收集数据后统计并起草论文；顾浩、贺志宽、汪洋、葛政协助完成实验；秦长江、王伟指导、监督实验进行，修改论文
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