2018, Vol. 38
2. 030000 太原, 山西大医院放疗科
2. Department of Radiation Oncology, Shanxi Dayi Hospital, Taiyuan 030000, China
近年来，结肠癌的发病率和死亡率呈现上升的趋势[1-2]。越来越多的研究证实，长链非编码RNA(long chain non-coding RNA, lncRNA)参与组织的癌变、转移、细胞的增殖等过程，不同肿瘤组织中具有不同的转录因子，在肿瘤的发生、发展中扮演重要的调控角色[3-5]。长链非编码RNA生长特异抑制物5(lncRNA of growth arrest-specific 5, lncRNA GAS5)最初发现于肿瘤抑制基因cDNA消减文库，可作为肿瘤潜在的抑制基因。lncRNA GAS5在胚胎和机体成熟组织中广泛表达，但在结肠癌中的作用以及分子机制尚不十分清楚。本研究通过检测lncRNA GAS5在结肠癌细胞中的表达量以及调控结肠癌细胞放射敏感性，研究lncRNA GAS5在结肠癌中的生物学作用以及相关作用机制，为降低结肠癌细胞辐射抵抗、改善临床结肠癌放疗效果提供可靠的理论基础。
材料与方法1.实验试剂及仪器：结肠癌SW480、SW620、LOVO、HT-29细胞购自中国科学院上海细胞生物研究所，DMEM培养基、DMEM/F12培养基、胎牛血清、反转录试剂盒购自美国Thermo公司；胰蛋白酶、青霉素、链霉素、磷酸盐缓冲液(PBS)购自上海碧云天生物技术研究所；姬姆萨染色液、甲醇购自美国Sigma公司；Lipofectamine 2000、TRIzol试剂购自北京天根生化科技有限公司；膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物公司；碘化丙啶(PI)购自上海生工生物有限公司；双荧光素酶报告基因由上海翰宇生物科技有限公司合成；pRL-TK海肾萤光素酶报告基因载体购自美国Promega公司；pcDNA-GAS5、siRNA-GAS5、miR-223 mimics、anti-miR-223购自上海吉玛生物有限公司。细胞培养箱购自美国Thermo公司，流式细胞仪购自美国Beckman公司，7500荧光定量PCR仪(Applied Biosystems)购自美国ABI公司
2.细胞的培养：SW480、SW620、LOVO细胞培养于DMEM培养基中，HT-29培养于DMEM/F12培养基中，均加入10%胎牛血清和1%的青-链霉素，培养条件为37℃、5% CO2，显微镜下观察到细胞浓度达到80%左右，加入0.25%胰酶消化，采用完全培养基终止消化，1 000 r/min，离心半径10 cm, 离心2 min，弃去上清液，按照1 :3或1 :4的比例进行传代。
3.荧光定量PCR(qPCR)：收集5×105结肠癌细胞，PBS冲洗3次，加入1 ml TRIzol冰上裂解5 min，提取细胞中总RNA，超纯水溶解RNA，-80℃保存。吸取2 μg总RNA，加入12 μl超纯水，70℃孵育5 min，冷却后置于冰上，加入1 μl(200 μ/μl)反转录酶，42℃孵育60 min，70℃加热10 min，保存于-20℃。基因引物由上海生工生物有限公司合成，lncRNA GAS5引物上游序列为5′ AAGCCATT GGCACACAGGCATTAG 3′，下游序列为5′ AGAACCATTAAGCTGGTCCAGGCA 3′；miR-223上游序列为5′ GGGGGTGTCAGTTTGTCAAAT 3′，下游序列为5′ CAGTGCAG GGTCCGAGGTAT 3′；GAPDH引物上游序列为5′ ACCAGCCCCAGCAAGAGCACAAG 3′，下游序列为5′ TTTGCTTGAAGTTTCACTGGCATC 3′。反应条件为95℃ 2 min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，72℃ 5 min，35个循环。实验重复3次，2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。
4.细胞的转染:结肠癌细胞常规培养于DMEM培养基中，细胞融合度达到50%~80%将pcDNA-GAS5、siRNA-GAS5、miR-223 mimics、anti-miR-223以及相应的阴性对照转染入细胞。将培养基更换为Opti-MEM，加入250 μl Opti-MEM分别稀释RNA序列和Lipofectamine 2000，室温孵育5 min后，将二者充分混合，室温下孵育20 min，形成转染复合物；吸取生长培养基，每孔细胞中加入上述转染复合物，十字形轻轻晃动混匀，37℃培养6 h，弃去转染液，更换为完全培养基继续培养。各转染片段序列如下所示：siRNA-GAS5: 5′ AGCTGGAAGTTGAAATGG 3′，5′ GTTCGGCTGAGAGGTATGG 3′；miR-223：5′ UGUCAGUUUGUCAAAUACCCCA 3′；anti-miR-223：5′ UGGGGUAUUUGACAAACUGACA 3′。
5.细胞克隆实验：取生长状态良好的细胞，根据不同的照射剂量(0、2、4、6、8 Gy)，源靶距(SSD) 100 cm，照射野10 cm×10 cm，剂量率5 Gy/min，射野覆盖全细胞培养板，接种不同浓度细胞至6孔板中，加入培养基至3 ml，放入37℃、5%CO2的培养箱中培养。显微镜下每2天观察1次，7 d左右出现肉眼可见的克隆团，即可终止培养，加入PBS清洗3次，甲醇固定20 min，姬姆萨染色40 min，自来水清洗数分钟，显微镜下计算有效克隆数(≥50细胞数)。细胞的克隆形成率=有效克隆数/接种细胞数×100%。
6.细胞凋亡实验：取生长状态良好的细胞，调整其浓度为1×106/ml，培养24 h后，弃去培养基，制成单细胞悬液，每孔加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，混合均匀，避光静置10 min，流式细胞仪分析凋亡率。
7.靶基因的预测：使用生物信息学数据库starBase对靶基因进行预测，进行后续研究。
8.双荧光素酶报告基因法：将293T细胞接种于24孔板中，待细胞汇合度达到80%左右，将1 μg报告基因、50 ng内参pRL-TK共转染293T细胞，置于细胞培养箱中培养24 h，加入miR-223 mimics、anti-miR-223或者正常细胞对照转染细胞，24 h加入60 μl细胞裂解液，摇床中振荡20 min，加入底物，分析荧光素酶的活性。
9 统计学处理：采用SPSS 22.0软件进行分析。结果以x±s表示。两组间数据的比较经正态性检验符合正态分布采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
结果1. lncRNA GAS5在结直肠癌细胞内相对低表达：qPCR检测结果如图 1所示，与人正常结肠上皮细胞(NCM460)相比，lncRNA GAS5在结肠癌细胞系SW480、LOVO、HT-29、SW620中的表达量显著降低，差异有统计学意义(t=15.25、8.69、14.42、11.62，P < 0.05)，其中lncRNA GAS5在结肠癌SW480表达量最低，因此选取SW480细胞进行后续实验。
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图 1 LncRNA GAS5在结肠癌细胞系中的表达水平 注：a与人正常结肠上皮细胞相比，t=15.25、8.69、14.42、11.62，P < 0.05 Figure 1 Expression levels of lncRNA GAS5 in different colon cancer cell lines |
2.过表达lncRNA GAS5增强结直肠癌细胞放射敏感性：结果如图 2A所示，结肠癌SW480细胞转染后，经qPCR检测结果显示，与转染携带无意序列的pcDNA相比，lncRNA GAS5在转染携带目的序列pcDNA的细胞中表达量显著增加，差异有统计学意义(t=12.23，P < 0.05)；上调lncRNA GAS5在结肠癌SW480细胞中的表达量显著降低细胞的存活分数、促进凋亡，增加结肠癌细胞放疗敏感性(图 2B-F)，其中lncRNA GAS5放射增敏比为2.155(表 1)。
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图 2 上调lncRNA GAS5对SW480细胞存活曲线、凋亡的影响A. qPCR检测转染pcDNA 3.1-GAS5后SW480细胞中lncRNA GAS5的表达量；B~C.细胞克隆实验检测过表达lncRNA GAS5对SW480细胞存活分数的影响；D~F.流式细胞术检测过表达lncRNA GAS5对SW480细胞凋亡的影响 注：a与pcDNA组相比，t=12.23、8.96、9.85、13.51、8.30，P < 0.05 Figure 2 Up-regulation of lncRNA GAS5 on survival and apoptosis induction of SW480 cells A. qPCR was used to detect the expression of lncRNA GAS5 in SW480 cells transfected with pcDNA 3.1-GAS5; B-C. Cell clone assay was used to detect the effect of overexpression of lncRNA GAS5 on the survival fraction of SW480 cells; D-F. Flow cytometry was used to detect the effect of expression of lncRNA GAS5 on apoptosis of SW480 cells |
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表 1 过表达lncRNA GAS5对细胞存活率及其单击多靶模型拟合参数的影响 Table 1 Influences of overexpression of lncRNA GAS5 on cell survival curve and the fitting parameters using the single-hit multi-target model |
3. lncRNA GAS5与miR-223的靶向验证：经过starBase软件预测结果显示(图 3A)，lncRNA GAS5和miR-223之间有相似的结合位点，推测lncRNA GAS5可能对miR-223有一定的调控作用。双荧光素酶报告基因法检测结果显示(图 3B、C)，当上调miR-223表达量，野生型的lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性显著受到抑制(t=26.36，P < 0.05)，相比之下，突变型lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性无显著变化(P>0.05)；下调miR-223表达量时，野生型的lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性显著升高(t=15.09，P < 0.05)，突变型lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性仍无显著变化(P>0.05)。
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图 3 双荧光素酶实验检测lncRNA GAS5和miR-223之间的调控关系A. starBase软件预测lncRNA GAS5和miR-223 3′UTR的结合位点；B.双荧光素酶报告基因实验检测过表达miR-223对荧光素酶活性的影响；C.双荧光素酶报告基因实验检测抑制miR-223对荧光素酶活性的影响 注：a与miR-NC组相比，t=15.01，P < 0.05；b与anti-miR-NC组相比，t=12.93，P < 0.05 Figure 3 Dual luciferase reporter assay was used to detect the relationship of lncRNA GAS5 and miR-223. A. The binding sites predicted by starBase software for lncRNA GAS5 and miR-223 3′-UTR; B. Dual luciferase reporter assay was used to detect the influence of miR-223 on luciferase activity; C. Dual luciferase reporter assay was used to detect the influence of anti-miR-223 on luciferase activity |
4. anti-miR-223增强结直肠癌细胞放射敏感性：qPCR检测miR-223在结直肠癌各细胞系中的表达量，结果如图 4A 所示，与人正常结肠上皮细胞相比，miR-223在结肠癌SW480、LOVO、HT-29、SW620细胞系中的表达量显著增加，差异有统计学意义(t=10.35、7.56、7.67、6.76, P < 0.05)，其中在SW480细胞中的表达量显著最高；转染anti-miR-223载体进入SW480细胞，显著降低细胞中miR-223的表达量(图 4B)；下调miR-223的表达量显著抑制SW480细胞存活分数、促进凋亡，增加结肠癌细胞放疗敏感性(图 4C-G)，其中anti-miR-223放射增敏比为2.345(表 2)。
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图 4 下调miR-223对SW480细胞存活曲线、凋亡的影响A.qPCR检测miR-223在结肠癌细胞系(SW480、LOVO、HT-29、SW620)中的表达量；B.qPCR检测转染anti-miR-223后SW480细胞中miR-223的表达量；C~D.细胞克隆实验检测抑制miR-223对SW480细胞存活分数的影响；E~G.流式细胞术检测抑制miR-223对SW480细胞凋亡率的影响 注：a与NCM460相比，t=12.07、9.41、11.68、8.07，P < 0.05；b与anti-miR-NC组相比，t=12.78、11.76、11.92、14.93、7.32，P < 0.05 Figure 4 Influence of downregulation of miR-223 on survival and apoptosis of SW480 cells. A. qPCR was used to detect miR-223 expression in colon cancer cell lines (SW480, LOVO, HT-29, SW620); B. qPCR was used to detect the expression of miR-223 in SW480 cells after anti-miR-223; C-D. Cell clone assay was used to detect the effect of miR-223 on the survival of SW480 cells; E-G. Flow cytometry was used to detect the effect of anti-miR-223 on apoptosis of SW480 cells |
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表 2 Anti-miR-223对细胞存活率及单击多靶模型拟合参数的影响 Table 2 Influences of anti-miR-223 on cell survival curve and the fitting parameters using the single-hit multi-target model |
5. lncRNA GAS5调控miR-223的表达量：qPCR检测结果显示(图 5)，过表达lncRNA GAS5显著降低miR-223的表达量，与对照组相比，差异具有统计学意义(t=8.35，P < 0.05)；下调lncRNA GAS5的表达量促进SW480细胞中miR-223的表达量，与对照组相比，差异具有统计学意义(t=8.59，P < 0.05)。
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图 5 lncRNA GAS5表达量对miR-223水平的调控作用 注：a与pcDNA组相比，t=8.35，P < 0.05；b与si-NC组相比，t=8.59，P < 0.05 Figure 5 Regulation of the overexpression of lncRNA GAS5 on the level of miR-223 |
讨论
研究发现，lncRNAs与多种肿瘤细胞的分化、增殖、凋亡和发展过程密切相关，为肿瘤的临床治疗提供了新的研究方向[6-7]。lncRNA在肿瘤组织中的表达量异常，对肿瘤的发生、发展起着抑制或者促进作用[8-10]。研究证实，lncRNA MALAT1可靶向调控胰腺癌细胞中miR-204的表达水平从而影响细胞的恶性生物学特性，对胰腺癌的进展起重要调控作用[11]。在结肠癌中，lncRNAs可通过抑制或促进肿瘤细胞的增殖、分化、侵袭等生物学特性参与结肠癌的进展。近年来的研究表明，lncRNAs与肿瘤的放射敏感性也具有显著相关性，如HOTAIR可显著抑制p21的表达量，从而降低宫颈癌HeLa细胞放射敏感性[12]。lncRNAs也可通过促进肿瘤细胞的凋亡率，从而增加放射敏感性，如lncRNA ANRIL显著促进鼻咽癌细胞的凋亡从而增加细胞的放射敏感性[13]，提示可通过研究lncRNAs的在肿瘤中的作用机制，提高细胞的放射敏感性，增强放射治疗的效果。
lncRNA GAS5含有630个碱基，参与机体许多生命活动。研究表明，在肿瘤的发生、发展过程中，lncRNA GAS5可作为一种肿瘤抑制因子发挥重要作用。研究证实，lncRNA GAS5在多种肿瘤组织中的表达量显著降低，如乳腺癌[14]、胃癌[15]、非小细胞肺癌[16]以及前列腺癌[17]，且与细胞的生长、凋亡密切相关。目前，lncRNA GAS5在结肠癌细胞的表达以及与细胞放射敏感性的相关研究较少。本研究通过qPCR实验检测lncRNA GAS5在多种结肠癌细胞系中的表达量，结果显示，与前人研究结果一致，lncRNA GAS5在结肠癌细胞系中的表达水平较正常结肠上皮细胞显著降低；过表达lncRNA GAS5显著抑制SW480细胞的存活分数，诱导细胞凋亡，增强SW480细胞的放射敏感性。
lncRNAs可通过多种途径参与肿瘤的发生、发展[18-19]。研究表明，miRNA可与lncRNAs相互作用从而发挥调控肿瘤细胞生物学行为、放射敏感性的作用，如miR-145的表达量与DNMT3具有负相关性，可通过负反馈影响前列腺癌细胞的放射敏感性[20]。众多研究表明，miR-223在结肠癌组织以及血清中的表达量异常，与结肠癌细胞的恶性生物学特性、肿瘤的转移以及预后密切相关[21-22]。为探明lncRNA GAS5在结肠癌中的相关作用机制，本研究通过starBase软件预测发现，lncRNA GAS5和miR-223之间部分碱基通过互补配对结合，推测lncRNA GAS5可能对miR-223有一定的调控作用；进一步通过双荧光素酶报告基因法检测发现，无论上调或下调miR-223的表达量，野生型的lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性均发生相应变化，而突变型的lncRNA GAS5 3′UTR报告基因的相对荧光素酶活性均无明显变化，表明lncRNA GAS5可以结合miR-223的3′UTR处序列抑制其表达量；下调miR-223的表达量显著抑制SW480细胞的存活分数，诱导细胞凋亡，增强SW480细胞的放射敏感性，与过表达lncRNA GAS5结果相似；上调或下调lncRNA GAS5的表达显著调节SW480细胞中miR-223的表达量，表明miR-223和lncRNA GAS5形成一个负调控，并通过该负反馈通路调控结肠癌细胞的放射敏感性，以上均说明lncRNA GAS5可直接调控miR-223表达及活性影响结肠癌细胞的放射敏感性。
综上所述，本研究通过qPCR检测了lncRNA GAS5在结肠癌细胞系中的表达量以及对细胞放射敏感性的影响，结果发现lncRNA GAS5在多种结肠癌细胞系中的表达量下调，可能通过靶向作用与miR-223调控结肠癌细胞放射敏感性。但本研究只在体外探讨了lncRNA GAS5对结肠癌细胞放射敏感性的作用，并没有在体内进行验证，后续会在体内进行进一步探讨。
利益冲突 第一作者对全文负责，所有作者承诺实验、文章没有利益冲突作者贡献声明 李孝敏参与实验设计、数据整理、论文撰写；赵浩亮参与实验设计及数据的统计学处理；马鹏负责实验验收；王晋喜负责论文校对；郭修栋负责实验实施和数据统计
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