放射治疗是结肠癌治疗的重要手段^[1]。但结肠癌95%以上为腺癌^[2]，其对射线的敏感性差，尤其是高分化腺癌。另外由于小肠的限制，难以提高结肠癌放射治疗剂量，治疗增益比低。因此，寻找真正低毒有效的放疗增敏剂，成为肿瘤放射医学研究中最为活跃的课题之一。DNA的损伤修复是造成X射线抗拒的重要原因^[3]。Rev1是跨损伤DNA合成通路中的关键基因，同时也是参与同源重组修复的关键基因^[4]。其一方面可维持基因组的完整性，另一方面在双链断裂的修复中也发挥了重要作用。国外研究表明，在细胞水平，Rev1的失调直接导致突变的积累和细胞死亡的抑制^[5]。国内研究表明，Rev1可逆转铂类耐药，能显著提高肿瘤细胞的化疗敏感性^[6]。鉴于此，本研究选择人高分化结肠癌细胞THC8307为研究对象，尝试通过沉默Rev1基因，观察X射线对人高分化结肠癌细胞增殖、凋亡的影响，以期探寻干预结肠癌治疗的新思路。

1.细胞与试剂：人高分化结肠癌细胞株THC8307(宁夏医科大学生育力保持教育部重点实验室保存)，DMEM培养基(美国GIBCO公司)，Rev1抗体、PCNA抗体、γ-H2AX抗体均购自美国Abcam公司，P53抗体、Bcl-2抗体、Bax抗体均购自美国Santa Cruz公司，GAPDH抗体(北京中杉金桥公司)，四甲基偶氮唑盐(MTT)试剂盒(上海贝博公司)，Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒(上海贝博公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG(北京中杉金桥公司)，Rev1干扰序列(上海吉玛基因)，Rev1、GAPDH基因引物(上海生工生物工程有限公司)，R4000 RNA转染试剂(北京英格恩生物科技有限公司)，反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)。

2.Rev1基因干扰siRNA的合成：Rev1 siRNA干扰序列由首都医科大学生命科学学院萧伟教授设计，正义链：5′ AUCGGUGGAAUCGGUUUGGAATT 3′，反义链：5′ UUCCAAACCGAUUCCACCGAUTT 3′。siRNA阴性干扰片段基因序列：5′ UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 3′，反义链：5′ ACGUGACACGUUCGGAGAATT 3′。将Rev1和阴性干扰片段的基因序列信息，送至上海GenePharma公司，完成构建。

3.细胞照射：常规培养THC8307细胞，后分为3组(空白对照组、阴性对照组、Rev1 siRNA组)。用瑞典医科达直线加速器(6 MV X射线，剂量率为200 cGy/min，源靶距100 cm，射野面积30 cm×30 cm，组织补偿物1.5 cm，机架旋转180°)照射上述细胞，然后进行后续实验。

4.Real-time PCR检测细胞中Rev1基因的表达：常规培养THC8307，按照R4000 RNA转染试剂说明操作，将Rev1基因的干扰片段转入THC8307细胞, 其作为实验组(Rev1 siRNA组)，转染阴性干扰片段的细胞为阴性对照组，不作任何处理的细胞为空白对照组。收集上述3组细胞并提取细胞中总的RNA，后反转录合成cDNA。按照Real-time PCR试剂盒说明进行操作，用7500 Fast检测Rev1基因的表达，重复3次实验，通过比较CT值法(2^-△△Ct)进行相对定量分析。

5.Western blot检测细胞中Rev1蛋白的表达：收集各组细胞(空白对照组、阴性对照组、Rev1 siRNA组)，冰上裂解细胞并提取细胞的总蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒测定所提取的蛋白浓度。10% SDS-PAGE凝胶电泳80~120 V、3 h分离蛋白，350 mA湿转至0.2 μm聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，一抗Rev1(1 :1 000)，4℃摇床孵育过夜，磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗膜3次后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1 :10 000)，室温孵育1.5 h，后PBS洗膜3次。用化学发光(ECL)试剂增强反应，机器曝光。每个样本至少重复3次。运用Image Lab图像分析软件计算条带灰度值。蛋白相对表达采用目的蛋白与GAPDH灰度比值来表示。

6.MTT法测定X射线对不同实验组细胞增殖的影响：取对数生长期的THC8307细胞，细胞分3组，即空白对照组、阴性对照组、Rev1 siRNA组，后进行相应处理，24 h后分别进行胰酶消化，调整细胞至10⁴/孔(100 μl)，接种到96孔细胞培养板中培养24 h。给予6 Gy X射线照射各组细胞，每组细胞设4个平行孔，同时设置4个空白孔(完全培养基加MTT，无细胞)，照射后继续培养，酶联免疫检测仪上检测照射后的不同时段(0、24、48、72、96 h)的吸光度(A)值，取4个复孔的平均A值，每组重复3次，存活率(%)=(处理组A值/对照组A值)×100%。

7.Western blot检测细胞PCNA、γ-H2AX、P53、Bax、Bcl-2蛋白的表达：0、6 Gy处理各组细胞48 h后，收集各组细胞(空白对照组、阴性对照组、Rev1 siRNA组)，冰上裂解细胞并提取总蛋白，BCA试剂盒测定其浓度。10% SDS-PAGE凝胶电泳80~120 V、1h分离蛋白质，350 mA湿转至0.2 μm PVDF膜，用5%脱脂奶粉室温封闭1.5 h，一抗γ-H2AX、P53、Bax、Bcl-2(1 :1 000)，4℃摇床孵育过夜，PBS洗膜3次后，加入HRP标记的二抗(1 :10 000)，室温孵育1.5 h，PBS洗膜3次。用ECL试剂增强反应，机器曝光。每个样本至少重复3次。运用Image Lab图像分析软件计算条带的灰度值。蛋白相对表达采用目的蛋白与GAPDH灰度比值来表示。

8.流式细胞术检测细胞的凋亡：0、6 Gy处理细胞(空白对照组、阴性对照组、Rev1 siRNA组)，48 h后，收集各组细胞，并依据Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒操作说明并进行染色，迅速用流式细胞仪进行凋亡率的检测，后对结果进行分析。

9.集落形成实验检测细胞存活率：取对数生长期的THC8307细胞，细胞分3组(空白对照组、阴性对照组、Rev1 siRNA组)，24 h后分别进行胰酶消化，调整细胞至2 000/孔接种到6孔板中培养24 h。分别给予0、6 Gy X射线照射各组细胞，每组细胞设3个平行孔，照射后继续培养10~14 d，待肉眼可见克隆时终止培养，弃培养基，PBS洗3遍，甲醇固定30 min，吸去甲醇后晾干，加入0.1%结晶紫染液，染色1 h，后流水冲洗，晾干。将6孔板倒置并覆盖一张带网格的透明胶片，低倍镜下计数≥50个细胞的集落数。根据公式计数集落形成率和细胞存活率。集落形成率(PE，%)=(集落数/接种细胞数)×100%。存活分数(SF)=某剂量照射后的细胞集落数/(该组接种细胞数×PE)。

10.统计学处理：应用SPSS 20.0统计软件进行数据处理，符合正态分布的计量资料以x±s表示，所有实验独立重复≥3次。两组比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.Real-time PCR和Western blot检测Rev1 mRNA及蛋白的表达：结果显示，Rev1干扰片段转染THC8307细胞后，Rev1 siRNA组细胞中Rev1基因mRNA的表达量和Rev1蛋白表达量明显低于空白对照组和阴性对照组(t=24.68、4.93，P < 0.05)。表明在mRNA和蛋白水平上Rev1基因成功被沉默(图 1，表 1)。

图 1 Western blot检测Rev1蛋白的表达 注：1.空白对照组；2.阴性对照组；3. Rev1 siRNA组 Figure 1 Expression of Rev1 protein detected by Western blot

表 1(Table 1)

表 1 Real-time PCR和Western blot检测Rev1 mRNA及蛋白的相对表达量(x±s) Table 1 Relative expression levels of Rev1 mRNA and protein detected by Real-time PCR and Western blot, respectively(x±s) 组别 样本数 Rev1 mRNA相对表达量 Rev1蛋白相对表达量 空白对照组 3 0.98±0.11 0.58±0.25 阴性对照组 3 0.94±0.09 0.61±0.19 Rev1 siRNA组 3 0.31±0.07a 0.23±0.37a 注：a与空白对照组相比，t=24.68、4.93，P < 0.05

表 1 Real-time PCR和Western blot检测Rev1 mRNA及蛋白的相对表达量(x±s) Table 1 Relative expression levels of Rev1 mRNA and protein detected by Real-time PCR and Western blot, respectively(x±s)

2.MTT检测不同处理组细胞的增殖情况：0、6 Gy X射线处理各组细胞后，MTT检测不同时段(0、24、48、72、96 h)细胞的增殖。结果显示，随着时间的增加，Rev1基因沉默组与空白对照组相比，THC8307细胞增殖的速率明显降低，尤其在72、96 h，与空白对照组和阴性对照组相比，差异具有统计学意义(t=3.55、3.63、4.82、7.53，P < 0.05，图 2)。

图 2 MTT检测THC8307在不同剂量射线照射后细胞的存活率A.0 Gy；B.6 Gy 注：a与同一时间空白对照组相比，t=3.55、3.63、4.82、7.53，P < 0.05 Figure 2 MTT assay of cell viability under different doses of irradiation A. 0 Gy; B. 6 Gy

3.流式细胞仪分析不同处理组细胞的凋亡率：结果显示，在0、6 Gy X射线处理后，与空白对照组和阴性对照组相比，沉默Rev1组凋亡率明显增高。且6 Gy照射各组细胞凋亡率均明显高于0 Gy的相应各组(图 3，表 2)。

图 3 流式细胞仪分析不同剂量照射后3组细胞的凋亡率 Figure 3 The flow cytometry analysis of apoptosis rate of three groups of cells after different doses of irradiation

表 2(Table 2)

表 2 流式细胞仪检测不同射线剂量处理THC8307后细胞的凋亡率(%，x±s) Table 2 The apoptosis rate of THC8307 cells after different doses of irradiation(%, x±s) 组别 样本数 0 Gy 6 Gy t值 P值 空白对照组 3 9.1±0.44 16.4±0.55 8.43 < 0.05 阴性对照组 3 10.0±0.51 16.0±0.68 6.92 < 0.05 Rev1 siRNA组 3 17.3±0.79a 21.4±0.83a 5.49 < 0.05 注：a与同一剂量空白对照组相比，t=7.18、6.23，P < 0.05

表 2 流式细胞仪检测不同射线剂量处理THC8307后细胞的凋亡率(%，x±s) Table 2 The apoptosis rate of THC8307 cells after different doses of irradiation(%, x±s)

4.集落形成实验检测细胞存活率：结果显示，在0、6 Gy X射线照射后，与空白对照组和阴性对照组相比，沉默Rev1组细胞存活分数明显降低。且6 Gy照射各组细胞存活分数均明显低于0 Gy的相应各组(表 3)。

表 3(Table 3)

表 3 0、6 Gy X射线照射下THC8307不同分组的集落形成率及细胞存活率(%，x±s) Table 3 The colony formation and cell survival fraction of different groups of THC8307 cells after 0 and 6 Gy of X-ray radiation(%, x±s) 组别 样本数 0 Gy 6 Gy t值 P值 空白对照组 3 95.89±0.54 32.96±0.16 6.13 < 0.05 阴性对照组 3 96.14±0.13 35.52±0.38 5.78 < 0.05 Rev1 siRNA组 3 52.73±0.47a 12.50±0.71a 8.91 < 0.05 注：a与同一剂量空白对照组相比，t=35.87、21.39，P < 0.05

表 3 0、6 Gy X射线照射下THC8307不同分组的集落形成率及细胞存活率(%，x±s) Table 3 The colony formation and cell survival fraction of different groups of THC8307 cells after 0 and 6 Gy of X-ray radiation(%, x±s)

5.Western blot检测各组细胞γ-H2AX、P53、PCNA、Bax、和Bcl-2的蛋白表达：结果显示，6 Gy X射线处理下，沉默Rev1组细胞的γ-H2AX、P53、Bax蛋白表达水平较空白对照组和阴性对照组均升高，而PCNA、Bcl-2蛋白表达下降(表 4，图 4)。

表 4(Table 4)

表 4 6 Gy剂量照射后各组细胞中γ-H2AX、P53、PCNA、Bax和Bcl-2的蛋白相对表达量(x±s) Table 4 Relative expression levels of γ-H2AX, P53, PCNA, Bax and Bcl-2 in each group of cells after 6 Gy irradiation(x±s) 组别 样本数 剂量(Gy) γ-H2AX P53 PCNA Bax Bcl-2 空白对照组 3 6 1.18±0.25 0.37±0.15 0.38±0.06 0.31±0.12 0.78±0.14 阴性对照组 3 6 1.01±0.18 0.40±0.19 0.41±0.04 0.28±0.08 0.91±0.11 Rev1 siRNA组 3 6 3.31±0.20a 0.71±0.13a 0.03±0.07a 0.87±0.10a 0.06±0.09a 注：a与同一蛋白空白对照组相比，t=5.48、5.09、4.39、3.32、6.13，P < 0.05

表 4 6 Gy剂量照射后各组细胞中γ-H2AX、P53、PCNA、Bax和Bcl-2的蛋白相对表达量(x±s) Table 4 Relative expression levels of γ-H2AX, P53, PCNA, Bax and Bcl-2 in each group of cells after 6 Gy irradiation(x±s)

图 4 3组细胞中γ-H2AX、P53、PCNA、Bax和Bcl-2的蛋白表达 注：1.空白对照组；2.阴性对照组；3. Rev1 siRNA组 Figure 4 The protein expressions of γ-H2AX, P53, PCNA, Bax and Bcl-2 in three groups of cells

本研究采用RNAi技术，成功将人高分化结肠癌细胞系THC8307中Rev1基因沉默。不同时段MTT实验结果显示, 与空白对照组相比，Rev1 siRNA组增殖速率明显缓慢，尤其在48 h后，这种抑制效果更加明显。这也提示沉默Rev1基因可抑制人高分化结肠癌细胞THC8307的增殖。随后采用流式细胞术检测沉默Rev1基因对THC8307凋亡的影响。结果显示, 与对照组相比，Rev1 siRNA组细胞总凋亡率明显增高, 提示沉默Rev1基因可促进THC8307的凋亡。这与文献报道的沉默Rev3(参与跨损伤DNA合成修复的聚合酶)后，促进结肠癌细胞凋亡的结论一致^[7]。采用6 Gy X射线照射3组细胞后, 不同时段MTT实验观察细胞增殖情况，结果显示, 3组细胞在0~72 h增殖速率的增加逐渐减慢，72 h后，增殖速率突然下降；与空白对照组相比，增殖速率增加明显减慢，下降速率明显加快。流式细胞术检测凋亡结果显示，与空白对照组相比，Rev1 siRNA组细胞总凋亡率明显增高。组间比较结果显示，3组细胞分别在0、6 Gy处理后，均表现为抑制增殖，促进凋亡。最后，通过集落形成实验，进一步检测不同射线处理后各组细胞的存活率，发现6 Gy射线处理后，Rev1 siRNA组细胞存活分数明显低于空白对照组。结合MTT实验结果，得出结论，沉默Rev1后，在X射线作用下，可以明显抑制THC8307细胞的短期增殖和长期增殖。以上结果提示，沉默Rev1联合X射线能对肿瘤细胞最大程度地杀伤，同时也说明，在相同剂量的X射线作用下，沉默Rev1可明显增加结肠癌细胞THC8307X的放射敏感性。

国内外研究表明，细胞内的30多亿的碱基对中，仅需几个DNA双链断裂即可激活共济失调-毛细血管扩张症突变基因(ATM)蛋白激酶信号通路^[8]。电离辐射(如X射线)损伤DNA双链后，激活了ATM，激活后的ATM随即作用下游信号分子，如H2AX，促进其磷酸化，变为γ-H2AX^[9]。此时的γ-H2AX在断裂的DNA双链处聚集，形成“核灶”，起到固定DNA双链断裂的作用，同时招募大量修复相关因子参与损伤修复。H2AX磷酸化的“核灶”几乎与DNA双链断裂是1:1的数量关系，这也让其成为检验DNA双链断裂的“金标准”^[10]。本研究中，Western blot结果显示，6 Gy处理3组细胞后，沉默Rev1组比对照组的γ-H2AX表达量明显升高，提示Rev1基因沉默后，加剧了DNA双链断裂的积累。考虑到同源重组是修复DNA双链断裂的重要通路，Rev1蛋白又是参与同源重组修复的重要因子，所以认为在6 Gy X射线作用后，γ-H2AX的升高是由于沉默了Rev1，进而抑制了同源重组修复，使得修复DNA双链断裂的效率降低，断裂的DNA双链积累，造成了γ-H2AX的增加。

P53蛋白是一个众所周知的转录因子，与细胞的增殖、凋亡、周期等均有密切的关系^[11]。本研究中Western blot结果显示, 6 Gy X射线照射下，沉默Rev1基因后，Rev1 siRNA组与对照组相比，P53表达升高。其下游促凋亡蛋白Bax表达升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表达降低。同时增殖细胞核抗原(PCNA)表达降低。这提示P53可能在参与细胞凋亡中起到了关键作用。国外研究表明，Rev1是肿瘤抑制因子P53的新型结合伴侣并调节其活性。在饥饿状态下促进Rev1的类泛素化(SUMO)化，使得其与P53分离，减轻了P53反式激活的Rev1依赖性抑制^[12]。由此推测，P53的增高可能来自以下两方面的因素。第一，X射线作用细胞DNA产生了DNA双链断裂，沉默Rev1抑制了同源重组修复，DNA双链断裂修复亦受到抑制，这种“致命”的双链断裂损伤持续存在，增加了复制压力，机体便启动P53依赖的细胞凋亡模式；第二，Rev1对P53的反式激活作用。以上两种情况增加了P53的表达，同时作用于其下游基因Bax、Bcl-2，使得细胞凋亡增加。在6 Gy X射线作用后，沉默Rev1使得PCNA的表达量下降，这与观察到的细胞增殖减慢的现象一致。

近年来，放射治疗在肿瘤治疗中的地位日益凸显，放射治疗的核心问题是肿瘤的放射敏感性^[13]。因此，预测个体肿瘤放射敏感性被认为是放射治疗中的“圣杯”。本研究发现，通过沉默Rev1基因可以提高结肠癌细胞系THC8307对X射线的敏感性。这与国外研究沉默Rev1提高HeLa细胞紫外辐射敏感性的结果一致^[14]。也有文献表明，不同组织中Rev1表达量不同，如在睾丸、乳房中高表达，在胸腺、小肠中低表达，但总体表达量很低^[15]。近来研究发现，Rev1单核苷酸多态性与宫颈癌预后有关^[16]。人脑胶质瘤中，也发现了Rev1的高表达。Rev1与放、化疗的增敏均有关联，这些重要信息都意味着Rev1是一种肿瘤治疗及肿瘤预测的理想靶标。本研究发现，沉默Rev1提高了结肠癌细胞THC8307对X射线的放射敏感性，对临床治疗结肠癌也有了新的提示。其机制可能是沉默Rev1后，抑制了同源重组修复，增加了复制压力，激活抑癌基因P53，P53通过激活促凋亡蛋白Bax、抑凋亡蛋白Bcl-2促进细胞凋亡。另外抑制了增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，抑制了细胞的增殖。当然，沉默Rev1后促进结肠癌细胞凋亡的更加具体的机制需后续不断地深入研究。