近年来，生物靶向治疗代表了肿瘤治疗新的发展方向。其中，溶瘤病毒疗法是利用具有特异性感染肿瘤细胞功能的病毒(多为基因重组病毒)，通过病毒在肿瘤细胞内复制增殖，进而裂解肿瘤细胞或激发机体特异性抗肿瘤免疫反应，达到杀伤肿瘤细胞的目的。溶瘤病毒与放疗相结合的治疗手段，其主要的优势在于，溶瘤病毒可使传统疗法所需的剂量降低，从而减少放化疗不良反应的发生^[1]。本研究通过人重组5型溶瘤病毒H101与射线照射联合作用于人肺腺癌细胞系A549，检测对该细胞凋亡及毒性影响，为腺病毒H101联合放疗用于临床治疗提供实验依据。

1.细胞系及溶瘤病毒：人肺腺癌细胞系A549购于上海生物细胞库，置于37℃、5%CO₂细胞培养箱中培养，用含1%青链霉素和10%血清的RPMI 1640培养液(美国Corning公司)培养，实验细胞均处于对数生长期。重组人5型腺病毒注射液H101(安柯瑞)是删除了腺病毒基因组中E1B-55K和部分E3区域的基因重组腺病毒，购于上海三维生物技术有限公司。

2.细胞照射：射线由美国瓦里安公司生产的6 MV医用直线加速器产生，源靶间距100 cm，等效组织补偿物1.5 cm，吸收剂量率为250 cGy/min，单次剂量为2 Gy。

3.细胞分组和处理：体外培养人肺癌细胞系A549根据预处理分为4组。对照组(PBS)：加入与H101等量的自制磷酸盐缓冲液(PBS)，作为对照；单纯照射组(IR组)：A549用2 Gy射线照射处理；溶瘤病毒组(H101组)：以MOI(复合感染，即每个细胞感染病毒的数量)=100的H101感染A549；照射联合溶瘤病毒组(IR+H101组)：A549先经2 Gy射线照射后24 h加入MOI=100的H101病毒。

4.细胞凋亡检测：各组在上述预处理和相关处理后，继续培养48 h，收集悬浮细胞，用酶消化贴壁细胞，离心半径5 ml, 1 000 r/min离心5 min，弃去上清液，PBS洗涤细胞2次，调节细胞浓度，向细胞悬液中加入AnnexinV-FITC试剂和PI试剂，进行染色。通过检测暴露于细胞外环境中的磷脂酰丝氨酸，间接检测各组之间细胞凋亡比率，检测使用Annexin/PI凋亡试剂盒(日本同仁化工公司)和流式细胞仪(美国BD公司)。AnnexinV-FITC+主要反映早期凋亡，而PI+主要反映晚期凋亡，以早期凋亡(FITC+ PI-)+晚期凋亡(FITC+ PI+)作为总凋亡率。检测后用Flow Jo 7.6分析软件计算细胞的早期凋亡率、晚期凋亡率及总凋亡率。

5.细胞毒性试验：通过乳酸脱氢酶(LDH)释放实验来检测各组的细胞毒性。细胞置于细胞培养板中进行相应的预实验和处理，经过24 h的培养后，各组细胞接受上述各自的预处理。预处理24、48、72和96 h后，使用CytoTox 96^©细胞毒性检测试剂盒(美国Promega公司)检测各组细胞释放出的LDH以检测其细胞毒性。细胞LDH释放百分比=(实验性LDH释放-细胞自发LDH释放)/(细胞最大LDH释放-细胞自发LDH释放)× 100%。

6.病毒复制率检测：通过比较H101组与IR+H101组的腺病毒表面衣壳蛋白Hexon的mRNA表达情况来反映两组间腺病毒的复制情况。H101组与IR+H101组的细胞接受上述预处理，在两组细胞感染病毒后的24、48和72 h后分别检测Hexon的mRNA表达情况。使用RNAiso Plus试剂盒(日本TaKaRa公司)将细胞中的所有RNA提取出来，并用PrimeScript^TMRT反转录试剂盒(日本TaKaRa公司)进行实时荧光定量PCR以测量mRNA表达, 以24 h H101组的Hexon的mRNA表达量为1。

7.统计学处理：计量资料以x±s表示，使用SPSS 21.0统计学软件进行方差分析，采用单因素方差分析用于各组间比较，组间两两比较采用Turkey检验，其中病毒复制实验数据经方差齐性检验后，采用两独立样本t检验的方法进行分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

1.细胞总凋亡率检测: H101组细胞凋亡率(55.37%)与对照组细胞凋亡率(1.03%)比较，差异有统计学意义(t=36.51，P＜0.05)；IR组细胞凋亡率(12.67%)与对照组细胞凋亡率(1.03%)比较差异有统计学意义(t=16.63，P＜0.05)；H101组细胞凋亡率(55.37%)与IR组细胞凋亡率(12.67%)比较差异具有统计学意义(t=25.96，P＜0.05)；IR+H101组细胞凋亡率(93.06%)与对照组(1.03%)、H101组(55.37%)和IR组(12.67%)比较，差异均有统计学意义(t=38.99、13.51、24.14，P＜0.05，表 1)。

表 1(Table 1)

表 1 各处理组细胞凋亡比率(%，x±s) Table 1 Apoptosis induction in each group (%, x±s) 组别 样本数 早期凋亡率 晚期凋亡率 总凋亡率 对照组 24 0.63±0.13 0.40±0.04 1.03±0.16 溶瘤病毒组 24 50.36±4.93 4.99±2.36 55.37±7.29a 单纯照射组 24 1.39±0.56 11.28±2.86 12.67±3.43a 照射联合溶瘤病毒组 24 26.85±5.30 66.21±6.26 93.06±11.56abc   注：a与对照组比较，t=36.51、16.63、38.99，P＜0.05；b与溶瘤病毒组比较，t=13.51，P＜0.05;c与单纯照射组比较，t=24.14, P＜0.05

表 1 各处理组细胞凋亡比率(%，x±s) Table 1 Apoptosis induction in each group (%, x±s)

2.细胞毒性作用检测：与对照组比较，单纯照射组在各个时间段的细胞LDH释放百分比差异有统计学意义(t=25.84、39.38、32.51、78.18，P＜0.05), 溶瘤病毒组在各个时间段的细胞LDH释放百分比差异有统计学意义(t=31.40、2.68、23.43、60.98，P＜0.05)；染毒后24、72和96 h单纯照射组与溶瘤病毒组比较，差异有统计学意义(t=8.12、3.50、9.32，P＜0.05)；照射联合溶瘤病毒组的细胞LDH释放百分比与对照组(t=80.71、119.74、109.8、123.94，P＜0.05)、单纯照射组(t=28.80、54.34、72.34、61.91，P＜0.05) 和溶瘤病毒组比较(t=42.02、57.45、57.01、58.83，P＜0.05) 差异均有统计学意义，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组细胞染毒后不同时间细胞LDH释放百分比(%，x±s) Table 2 LDH releasing percentage in each group(%, x±s) 组别 样本数 24 h 48 h 72 h 96 h 对照组 24 4.65±0.53 5.13±0.66 8.20±0.43 9.52±0.55 单纯照射组 24 20.26±2.10a 24.23±2.30a 29.03±3.11a 32.09±2.86a 溶瘤病毒组 24 15.82±1.66ab 25.43±2.09a 31.63±1.88ab 39.08±2.31ab 照射联合溶瘤病毒组 24 36.83±1.88abc 58.70±2.09abc 69.25±2.69abc 83.20±2.86abc   注：a与对照组比较，t=25.84、39.38、2.51、78.18、31.40、2.68、23.43、60.98、80.71、119.74、109.8、123.94，P＜0.05；b与单纯照射组比较，t=8.12、3.50、9.32、28.80、54.34、72.34、61.91，P＜0.05；c与溶瘤病毒组比较，t=42.02、57.45、57.01、58.83，P＜0.05

表 2 各组细胞染毒后不同时间细胞LDH释放百分比(%，x±s) Table 2 LDH releasing percentage in each group(%, x±s)

3.H101腺病毒复制倍数检测：在H101组，与24 h相比，病毒在48和72 h的复制显著增加，分别增长了7.32和15.66倍，差异具有统计学意义(t=28.49、27.81，P＜0.05)；与H101组相比，IR + H101组的病毒复制在24、48和72 h分别增长了16.26、28.37和39.58倍，均较H101组显著增长，差异具有统计学意义(t=54.50、33.73、29.28，P＜0.05)。

腺病毒的复制周期可以分为两个时期：早期时相(E1~E4) 和晚期时相(L1~L5)，其中，腺病毒E2基因的表达依赖于宿主细胞E2F转录因子的激活，E2F在激活腺病毒E2基因时，也能同时诱导宿主细胞P53凋亡途径的激活。为了使E2F能够诱导腺病毒E2基因的复制而避免P53诱导的细胞凋亡，腺病毒E1B-55K基因编码的蛋白能够与P53结合并将其转运到细胞质中降解，从而避免了宿主细胞的凋亡以利于病毒完成自身的复制^[2]。H101即是删除了腺病毒基因组中E1B-55K和部分E3区域的基因重组腺病毒，理论上，由于H101无法产生降解P53的E1B-55K蛋白，其在正常细胞中的复制将会由于细胞P53途径的激活而终止，而P53缺失的肿瘤细胞却能完成正常的复制过程，此即H101在肿瘤细胞中选择性复制的理论基础。并且，H101同时删除了E3区域中编码腺病毒死亡蛋白(adenovirus death protein, ADP)的基因片段，进一步增强了其安全性^[3]。

H101溶瘤病毒于2005年通过中国食品药品监督管理局(FDA)批准用于鼻咽癌的治疗^[4-5]。H101具有可靠的安全性，相关的临床试验未发现严重的不良反应，仅仅表现为流感样症状或注射部位疼痛等局部症状^[6]。一般认为，射线通过直接损伤肿瘤细胞的DNA以及诱导肿瘤细胞内氧自由基、活性氮的形成等机制杀伤肿瘤细胞，而溶瘤病毒则是通过选择性在肿瘤细胞内复制以及诱导机体抗肿瘤免疫反应等机制杀伤肿瘤细胞^[7-8]。关于溶瘤病毒与射线之间协同作用机制的研究，主要集中于病毒干扰肿瘤细胞DNA的损伤修复机制。有研究应用删除了野生型HSV-1γ_134.5基因片段的重组单纯疱疹病毒NV1066与放疗联合，在体外以及肺癌动物模型中，均观察到两者之间明显的协同作用，并进一步证明了此种协同作用的产生，是由于射线所引起的肿瘤细胞内生长抑制与DNA损伤修复基因(growth arrest and DNA damage induced genes 34，GADD34) 表达上调所致^[9]。射线会造成细胞DNA双链断裂，细胞通过DNA修复方式维持自身基因组的稳定，避免基因转录与翻译错误，这也是肿瘤细胞对射线产生耐受的原因之一。腺病毒E4基因编码蛋白产物能够干扰细胞的损伤修复^[10-11]、诱导凋亡^[12]，从而增强射线对肿瘤细胞的杀伤作用。溶瘤病毒同时也会诱导机体产生抗肿瘤免疫反应，并且此种抗肿瘤免疫反应在治疗肿瘤的疗效上，可能较其直接的裂解细胞作用更为显著^[13]。另外，肿瘤组织微环境也会显著影响溶瘤病毒的疗效^[14]。

本研究提示照射联合溶瘤病毒H101诱导肿瘤细胞凋亡率明显比其他组增高，说明溶瘤病毒H101与射线联合作用能够起到相互协同的增敏作用，分析可能原因是肿瘤细胞经射线照射后，溶瘤病毒更容易通过肿瘤细胞壁进入细胞内复制。同样结论提示照射联合溶瘤病毒对肿瘤细胞的细胞毒性也较其他组明显增强，表明二者的联合不仅增加凋亡率，也可以增强细胞毒性，进而诱导凋亡。Lei等^[15]对溶瘤病毒H101进行了体内和体外的研究，也证实了H101的诱导凋亡作用，以及病毒的感染、复制可以产生强有力的细胞毒性。溶瘤病毒H101感染肿瘤细胞后，与24 h相比，病毒在48和72 h的复制显著增加，说明溶瘤病毒H101能够有效感染人肺癌细胞系A549，而且其感染复制能力随着时间的延长而增强。而在溶瘤病毒与放疗联合后，病毒的复制较单纯溶瘤病毒明显增强，说明经过射线照射之后的人肺癌细胞更有利于病毒的感染及复制，这或许是照射与药物联合组较单药组杀伤肿瘤细胞作用增强的原因之一。Liu等^[16]利用基因重组的人腺病毒在体外细胞中进行试验，也证明了射线能够增强病毒的复制，以及病毒的活跃复制是细胞毒性作用增强的原因之一。

虽然有许多研究结果支持溶瘤病毒的疗效，然而，也有不少研究发现，经过射线照射之后的肿瘤细胞内病毒的复制并无增强^[17-18]，甚至有研究表明射线会影响病毒DNA复制^[19]。提示病毒种类、细胞类型、照射的时间、顺序、射线剂量等因素都会影响到联合疗法的疗效，在将溶瘤病毒与传统疗法联合应用于临床时，需综合考虑各个相关因素，以达到最大的临床效益。

综上，本研究结果表明，溶瘤病毒H101与射线联合作用于肿瘤细胞，能够起到相互协同的治疗作用。溶瘤病毒H101与射线联合作用能够诱导肺癌细胞凋亡以及增强细胞毒性作用，从而使肺癌细胞对射线的敏感性增加，同时射线能够增强病毒的复制活性，进而增强溶瘤病毒H101的溶瘤作用。说明溶瘤病毒H101与照射的联合疗法不只是两者之间效果的简单累加，因为这种联合能够增强肿瘤的局部控制，减少射线或者病毒所需的剂量，降低相关不良反应的发生。本研究提供一种新兴的肺癌治疗新模式，为溶瘤病毒H101及放射治疗开辟新的思路，两者相互协同作用机制还有待进一步研究。