由放疗引起的放射性肺损伤主要分为早期的放射性肺炎和晚期的放射性肺纤维化。而放射性肺纤维化是胸部肿瘤在放疗中的常见并发症，限制了放疗在胸部肿瘤治疗中的发展，影响着患者的寿命及生活质量。

近年来很多实验证实，转化生长因子(TGF)-β1/Smad2通路在放射性肺炎的发生及进展成放射性肺纤维的过程中起着非常重要的作用。LY2109761是一种新型的选择性TGF-β抑制剂，对Smad2的磷酸化过程产生抑制作用^[1]。目前，有关LY2109761治疗放射性肺纤维化的研究少见报道，因此，本实验拟建立放射性肺纤维化模型来观察LY2109761对小鼠放射性肺纤维化的治疗作用，通过检测各组小鼠肺组织内TGF-β1和Smad2的表达水平来探究LY2109761的作用机制，以期为研究LY2109761防治放射性肺纤维化提供理论依据。

1.药物试剂与实验动物：LY2109761购自美国Selleck公司(S2704)，TGF-β1、Smad2单克隆抗体一抗浓缩液购自美国Abcam公司。兔链霉卵白素-生物素法检测试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色液购自北京中杉金桥生物技术有限公司。C57BL/6雌性小鼠40只，8周龄，体重18~22 g，购于辽宁省长生生物技术有限公司，饲养于中国医科大学附属盛京医院实验基地动物中心无特定病原体(SPF)饲养室内，合格证号：No.211002300014115。

2.实验分组及处理：将40只C57BL/6小鼠按随机数表法分为空白对照组、单纯照射组、照射+LY50组和照射+LY100组，每组10只，空白对照组为假照射；单纯照射组给予6 MV X射线12 Gy单次照射全肺；照射+LY50组和照射+LY100组为照射后分别给予50和100 mg/kg LY2109761，分2次灌胃。照射前15 min，用5%水合氯醛(0.6 ml/100 g)将小鼠进行腹腔注射麻醉，使用自制固定装置将小鼠仰卧于治疗床上，铅片屏蔽头部与腹部。采用德国西门子公司Primus Hi 6 MV X射线高能直线加速器，经前胸野单次照射小鼠全胸部，剂量为12 Gy，吸收剂量率300 cGy/min，源皮距100 cm。照射前用射野片确保全肺照射。照射完成后将小鼠放于中国医科大学附属盛京医院动物实验中心进行常规饲养。

3.大鼠肺组织HE染色及阿什克罗夫特(Ashcroft)评分：于照射后第14天处死各组小鼠，留取新鲜肺组织，浸于4%的多聚甲醛内固定，切片厚度3 mm，烤片，常规脱蜡，自来水洗去乙醇，蒸馏水洗，苏木素染色，水洗，伊红染色，水洗2次，脱水，中性树脂胶封盖。于普通显微镜×10下对HE染色切片肺组织进行肺纤维化Ashcroft评分，每个视野按照纤维化程度可评为1~8分：1分为轻微的肺泡间隔或支气管壁增厚；2~3分为肺泡壁或支气管壁中度增厚，但没有肺脏结构的损坏；4~5分为纤维组织增生伴有明显肺脏结构损害或纤维组织团块形成；6~7分为严重的肺脏结构损坏及大片纤维组织形成，蜂窝肺；8分为纤维组织满视野^[2]。

4.大鼠肺组织Masson染色及评分：将上述肺组织切片常规脱蜡至水，用配制好的Weigen铁木素染色液染色；酸性乙醇分化液水洗，Masson蓝化液返蓝，水洗，蒸馏水洗，丽春红品红染色液染色，磷钼酸溶液洗，用配制好的弱酸工作液洗；直接放入苯胺蓝染色液中染色，用配制好的弱酸工作液洗；放入95%乙醇中快速脱水，用无水乙醇进行脱水3次，二甲苯透明3次，中性树脂封片固定。根据黄旭晴等^[3]的Masson染色纤维化评分方法进行评分。

5.大鼠肺组织免疫组织化学及半定量分析：将上述肺组织切片标记后，插入染色架，脱蜡至水；切片架放入去离子水中5 min后放入抗原修复液中，微波炉7 min，待自然冷却后取出，磷酸盐缓冲液(PBS)洗5 min×3次，3%的H₂O₂去离子水阻断内源性过氧化物酶20 min，PBS清洗5 min×3次；生物血清封闭40 min，甩干，不洗；将配置好的一抗30 μl孵育，PBS快速冲1次后，洗5 min×3次，二抗30 μl，孵育20 min，PBS快速冲1次后，PBS洗5 min×3次；辣根过氧化酶(HRP)30 μl孵育20 min，PBS洗5 min×3次；使用DAB显色液进行显色，放入苏木素溶液中复染2 min，然后用自来水进行返蓝；二甲苯透明，中性树脂封片；于显微镜下对各组切片进行观察并拍摄图片。TGF-β1和Smad2阳性结果以棕色显示，因TGF-β1主要在炎症细胞、肺泡上皮细胞、成纤维细胞等的细胞质及肺泡间质内表达，故使用Image pro plus软件利用平均光密度值进行半定量分析。Smad2一般在炎症细胞、肺泡上皮细胞、成纤维细胞等的细胞质及肺泡间质内的细胞核及核膜上表达，故根据文献[4]采用AB值定量记分法。

6.统计学处理：数据用x±s表示。应用SPSS 20.0软件进行分析，计量资料服从正态分布，小鼠各组间比较采用方差分析，差异方差齐时，采用最小显著差异法(LSD)检验；差异方差不齐时，采用Dunnett′s T3检验，同一指标两组间比较，经正态性检验后符合正态分布，采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.小鼠的一般状况：空白对照组及照射+LY100组小鼠精神状态好、食欲良好，毛发平滑柔顺，活动量正常，体重未有下降过程，至观察终点照射后14 d均存活。单纯照射组及照射+LY50组小鼠精神状态差，食欲明显减低，毛发粗糙，活动量减少，体重下降，至照射后3 d一般情况有所改善；至观察终点照射后14 d均存活。

2.小鼠肺组织HE染色结果：小鼠照射2周后，单纯照射组肺泡结构发生变化，成纤维细胞增生，肺泡间隔明显增宽，可见片状的纤维化改变，照射+LY100组小鼠肺组织可见肺泡间隔略增厚，但无肺泡结构破坏，照射+LY50组小鼠肺组织HE染色图可见肺泡结构改变，肺泡间隔明显增厚，局部可见成块纤维化表现，程度较单纯照射组略减轻，单纯照射组Ashcroft的评分4.97±0.96与空白对照组1.32±0.23比较，差异具有统计学意义(t=9.086，P＜0.05)，照射+LY100组与空白对照组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，与单纯照射组比较，纤维化程度明显减轻，两组评分分别为2.62± 0.78和4.97±0.96，差异具有统计学意义(t=4.668，P＜0.01)；照射+LY50组4.15±0.44与单纯照射组4.97±0.96比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。本实验成功构建了放射性肺纤维化模型，同时说明单纯照射组在照射后2周既有了纤维化改变，LY2109761对放射性肺纤维化有抑制作用。

3.小鼠肺组织Masson染色结果：取照射后2周的肺组织进行Masson染色及评分。单纯照射组小鼠照射2周后，Masson染色可见片状蓝色胶原纤维沉积，有肺纤维化改变；照射+LY100组小鼠肺组织结构无破坏，仅见少量蓝色胶原纤维组织在肺泡壁上，未见蓝色胶原纤维沉积，无片状纤维化改变，与单纯照射组比较，蓝色物质明显减少，纤维化程度明显减轻；照射+LY50组小鼠肺组织Masson染色可见肺泡间隔增厚，蓝色胶原纤维沉积，纤维化程度较单纯照射组略减轻。Masson染色评分，单纯照射组3.33±0.37与空白对照组1.33±0.52比较，差异具有统计学意义(t=10.230，P＜0.05)；照射+LY100组1.53±0.45与单纯照射组3.33±0.37比较，差异有统计学意义(t=7.547，P＜0.05)，与空白对照组比较，肺泡壁蓝色胶原纤维稍增多，差异无统计学意义(P＞0.05)；照射+LY50组与单纯照射组比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。上述结果进一步说明照射后2周小鼠有纤维化改变，LY2109761对放射性肺纤维化有抑制作用。

4.小鼠肺组织内TGF-β1的免疫组织化学检测结果：免疫组织化学检测图片显示单纯照射组及照射+LY50组的TGF-β1明显升高，通过Image pro plus软件进行半定量分析，支持TGF-β1升高，且与空白对照组比较，差异具有统计学意义(t=13.545，P＜0.05)，说明TGF-β1在放射性肺损伤过程中起关键作用，这与近几年相关实验研究的结果一致^{[1, 5-6]}，但照射+LY50组半定量分析与单纯照射组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，照射+LY100组与单纯照射组比较，棕色物质表达的程度明显减少，半定量分析，照射+LY100组0.016±0.001与单纯照射组0.046±0.005比较，差异具有统计学意义(t=15.263，P＜0.05，表 1)。说明LY2109761对放射性肺损伤有抑制作用，作用机制可能是通过抑制TGF-β1起作用，还需更多相关实验证实。

表 1(Table 1)

表 1 12 Gy照射后小鼠肺内TGF-βl和Smad2的表达(x±s) Table 1 Expression of TGF-βl and Smad2 in the lung after 12 Gy irradiation(x±s) 组别 只数 TGF-βl Smad2 空白对照组 10 0.015±0.003 1.40±0.24 单纯照射组 10 0.046±0.005 a 2.28±0.24a 照射+LY100组 10 0.016±0.001 b 1.45±0.18b   注：a与空白对照组比较，t=13.545、6.418，P＜0.05；b与单纯照射组比较，t=15.263、6.855，P＜0.05

表 1 12 Gy照射后小鼠肺内TGF-βl和Smad2的表达(x±s) Table 1 Expression of TGF-βl and Smad2 in the lung after 12 Gy irradiation(x±s)

5.小鼠肺组织Smad2免疫组织化学检测结果：因上述HE染色、Masson染色及TGF-β1提示照射+LY50组差异无统计学意义(P＞0.05)，故Smad2只做3组，免疫组织化学检测图片显示单纯照射组Smad2在照射2周后在肺组织中炎性细胞、肺泡上皮细胞及成纤维细胞的细胞核中表达明显，空白对照组见极少量Smad2表达，照射+LY100组可见少量表达，其棕色程度及染色的细胞数明显减少，半定量分析照射+LY100组1.45±0.18与单纯照射组2.28±0.24比较，差异有统计学意义(t=6.855，P＜0.05)。与空白对照组1.40±0.24比较，差异无统计学意义(P＞0.05，表 1)。说明LY2109761对Smad2的表达有抑制作用。

本研究选择了C57BL/6小鼠作为放射性肺炎及纤维化模型的实验对象，是因为不同品系的小鼠放射性肺纤维的发生率不同，已有一些研究显示，因C57BL/6小鼠在胸部照射后纤连蛋白及层粘连蛋白出现高表达且成纤维细胞处于活化状态，因此，C57BL/6小鼠较其他类型小鼠更易于发生肺纤维化^[7]。而且C57BL/6小鼠在实验过程中的耐受性较好，病死率较低，故本研究采用C57BL/6小鼠来建立放射性肺损伤动物模型。目前国内外放射性肺损伤模型的建立已相对成熟，但照射剂量大多不一致，本实验经过多次照射梯度实验，证实C57BL/6小鼠单次胸前照射12 Gy既可保证小鼠全部存活到实验终点，同时又能出现肺纤维化。

放射性肺损伤的过程大致可分为潜在期、急性肺炎期、慢性肺纤维化期。潜在期常常发生在放疗后数小时至数天内，可无任何阳性表现，但电镜下可看到Ⅰ型、Ⅱ型肺泡上皮细胞及表皮细胞的损伤。临床上急性肺炎期一般发生在放疗后2周至数月内，肺泡损伤是急性肺炎期的主要表现，表现为间质水肿渗出、炎性细胞浸润、肺泡间隔增宽、肺泡结构紊乱。晚期则以肺纤维化为特点，最终将导致广泛的肺泡闭塞甚至实变^[8]。本实验成功建立了放射性损伤C57BL/6小鼠模型，通过组织病理学HE染色方法观察发现：放疗后2周小鼠出现了典型肺损伤表现，发生肺泡结构改变，同时肺纤维化也开始出现。目前，肺纤维化评价方式多种多样，其中通过病理切片来观察肺纤维化的方法在评价纤维化程度方面占据主导地位^[9-10]。Ashcroft半定量评分标准能够客观地反映肺纤维化的病变程度，且操作简便，稳定性高，适用于放射性肺纤维化的病理评价^[1]。因此，本研究采用此种方法进行评分并进行统计学分析。Masson染色也证明了肺纤维化小鼠模型是成功的，同时Masson染色评分的统计学分析也说明LY2109761对放射性肺纤维化具有抑制作用。

TGF-β1是一个具有多种功能的多肽类生长因子超家族，在放射性肺损伤的早期是重要的炎症启动因子，在放射性肺损伤晚期则是重要的纤维化形成因子，TGF-β1可以诱导人或实验动物的成纤维细胞和肺泡上皮细胞向肌成纤维细胞转化^[11-14]。研究表明，TGF-β1作用于放射性肺损伤的整个过程^[15]。国内外许多研究发现，放疗前后血浆中TGF-β1水平的变化可以用来预测放射性肺损伤^[15-16]。Rube等^[17]研究表明，小鼠肺组织中TGF-β1水平在照射后2和4周达到高峰，且TGF-β1主要表达于肺组织中炎性细胞、肺泡上皮细胞及成纤维细胞的细胞质中。本实验得到相似的结果。近几年，国外许多实验发现，TGF-β1/Smad2信号通路是放射性肺纤维化发生的关键通路，小鼠受到照射后肺组织发生肺纤维化的同时，伴随有TGF-β1和Smad2水平的升高，通过应用TGF-β1受体的拮抗剂来阻断TGF-β1的信号向细胞内传导，可以明显减轻放射性肺损伤的程度^{[5, 18]}。目前，临床上对于放射性肺纤维化除应用糖皮质激素外尚无有效的治疗手段，且采用抗菌治疗无改善^[6]。LY2109761是一种新型的选择性TGF-β抑制剂，对Smad2的磷酸化过程有抑制作用^[1]。目前，检索国内尚无LY2109761治疗放射性肺纤维化的文章发表。故本实验建立放射性肺纤维化模型来观察LY2109761对小鼠放射性肺纤维化的治疗作用，通过检测小鼠肺组织TGF-β1和Smad2的表达水平来探究其作用机制，能为放射性肺纤维化的治疗提供新的思路。本实验结果表明，LY2109761可以抑制放疗引起的肺组织纤维化的形成, 其机制可能是通过TGF-β1/Smad2通路实现。

综上所述，成功建立了C57BL/6小鼠放射性肺纤维化模型，初步证明LY2109761对放射性肺纤维化有治疗作用且可能具有剂量依赖性，LY2109761治疗放射性纤维化的机制是通过抑制TGF-β1/Smad2通路来实现的。当然，本实验只从病理及免疫组织化学蛋白水平证明了LY2109761对放射性肺纤维化的治疗作用，还需要进一步进行各个位点相关指标的基因水平的研究，探讨LY2109761对放射性肺纤维化治疗作用的机制。