近年来，随着细胞组学研究的不断进展，胞质分裂阻滞(cytokinesis-block，CB)分析已成为检测微核(micronuclei，MN)、核质桥(nucleoplasmic bridges，NPB)、核芽、细胞坏死和细胞凋亡等早期染色体损伤生物标志物的综合方法^[1]。研究表明，核质桥有可能成为新的辐射生物剂量计^[2-3]。但不同实验室所采用胞质分裂阻滞法制备核质桥标本的实验流程有所差异，尤其是松胞素B(cytochalasin-B，Cyt-B)终浓度和加入时间不同，可能造成不同分析者、不同实验室之间的分析结果具有一定差异性^[3-5]。为确保核质桥分析的准确性和可重复性，降低分析结果的误差，本研究将探索胞质分裂阻滞分析中，松胞素B终浓度和加入时间对辐射诱导核质桥水平的影响，为核质桥成为快速准确的生物剂量计提供科学依据。

1.研究对象和血样采集：供血者为26岁男性，身体健康、无重大疾病和化学毒物接触史，采样前3个月内未受过电离辐射。在知情同意条件下先后抽取外周血2次，每次约10 ml，并立即注入肝素抗凝管。本研究通过中国疾病预防控制中心辐射防护与核安全医学所伦理委员会的审查。

2.血液样品照射：在室温下用2 Gy ⁶⁰Co γ射线对血样进行照射(设0 Gy对照组)，每个样本设2个平行样。照射源由北京辐照中心提供，放射性活度为130 TBq，照射野为30 cm×30 cm，吸收剂量率为1 Gy/min。样品在受照后置于37℃温箱修复2 h。

3.分组：按照不同松胞素B终浓度分为2、4、6、8和10 μg/ml 5个终浓度组，此外，按照不同松胞素B加入时间分为0、28、40和44 h组4个加入时间组。

4.细胞培养：吸取0.4 ml外周血加入2.0 ml含有20%胎牛血清(美国Hyclone公司)、0.2%植物凝血素(PHA)、100 U/ml青霉素及100 μg/ml链霉素的培养基(美国Sigma公司)。

(1) 不同松胞素B终浓度对核质桥水平的影响：细胞在37℃温箱中培养40 h后，分别加入终浓度为2、4、6、8、10 μg/ml的松胞素B，混匀后继续避光培养28 h，总计培养68 h后收获。

(2) 不同深度松胞素B加入时间对核质桥水平的影响：细胞分别在37℃温箱中培养0、28、40和44 h后，加入终浓度为6 μg/ml的松胞素B，混匀后继续避光培养至68 h收获。

5.收获和制片：弃上清，加入0.075 mol/L KCl低渗液，混匀后静置1 min。再用固定液(甲醇:冰乙酸=3 :1) 固定2~3次，每次20 min，将细胞悬液吸入1.5 ml EP管。每张标本取约100 μl细胞悬液，在用无水乙醇处理过的干玻片上滴片，姬姆萨染色5~10 min，冲洗后室温晾干，将标本随机编号后待用。

6.阅片：在光学显微镜下每个样本分析1 000个分化细胞(×400倍)，计数单核细胞、双核细胞、多核细胞(≥3个细胞核)的数量，计算核分裂指数(nuclear division index, NDI)和双核细胞率，公式分别为：NDI=(M₁+2×M₂+3×M₃+4×M₄)/N；双核细胞率=M₂/N×100%，式中M₁~M₄分别表示具有1~4个细胞核的细胞数量、N表示计数的分化细胞数量。每个样本再分析1 000个双核细胞(×1 000倍)，记录含有核质桥或微核细胞的坐标。单核细胞、双核细胞、多核细胞、核质桥及微核的计数标准参照国际原子能机构(IAEA)提出的标准^[6]。核质桥是双核细胞中两个主核之间连续的桥状核质，核质桥的宽度并不固定，但应小于其主核直径的1/4。

7.统计学处理：采用SPSS 19.0软件进行统计学分析。两组间核质桥率、微核率、核分裂指数的比较用U检验，两组间双核细胞率、双核加多核细胞率的比较用χ²检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.不同松胞素B终浓度对核质桥的影响：各终浓度组的核分裂指数、双核细胞比例、双核加多核细胞比例均随松胞素B终浓度的增加而升高(表 1)。照射后，2、4和6 μg/ml组的核分裂指数、双核加多核细胞比例均高于其对照组(核分裂指数：U=3.62、3.18、3.52，P < 0.01；双核加多核细胞比例：χ²=120.00、70.24、62.22，P < 0.01)，8和10 μg/ml组的核分裂指数、双核加多核细胞比例均低于其对照组(核分裂指数：U=-2.24，P < 0.05；U=-1.84，P>0.05。双核加多核细胞比例：χ²=7.16，P < 0.05；χ²=0.12，P>0.05)。双核细胞比例除8 μg/ml组与对照组比较差异无统计学意义(χ²=0.34，P>0.05)，其余4组均高于其对照组(χ²=120.35、67.48、58.20、5.68，P < 0.05)。

表 1(Table 1)

表 1 不同松胞素B终浓度对核分裂指数及双核细胞比例的影响 Table 1 NDI and percentages of binucleated and multinucleated cells induced by different final concentration of Cyt-B 组别 样本数 核分裂指数 双核细胞比例(%) 双核加多核细胞比例(%) 照射组   2 μg/ml 1 000 1.236a 22.7b 23.0c   4 μg/ml 1 000 1.278a 23.9b 25.2c   6 μg/ml 1 000 1.599a 43.4b 48.9c   8 μg/ml 1 000 1.846a 58.2 67.0c   10 μg/ml 1 000 2.080 69.9b 82.6 对照组   2 μg/ml 1 000 1.062 5.6 5.8   4 μg/ml 1 000 1.122 10.1 10.8   6 μg/ml 1 000 1.406 27.1 31.6   8 μg/ml 1 000 1.985 59.5 72.5   10 μg/ml 1 000 2.198 64.9 83.2 注：a与对照组同指标同剂量比较，U=3.62、3.18、3.52、-2.24，P < 0.05；b与对照组双同指标同剂量比较，χ2=120.35、67.48、58.20、5.68，P < 0.05；c与对照组同指标同剂量比较，χ2=120.00、70.24、62.22、7.16，P < 0.01

表 1 不同松胞素B终浓度对核分裂指数及双核细胞比例的影响 Table 1 NDI and percentages of binucleated and multinucleated cells induced by different final concentration of Cyt-B

不同松胞素B终浓度对照射后核质桥率和微核率的影响见表 2。照射后，各终浓度组每个细胞的核质桥率为0.013 0~0.022 5，差异无统计学意义(P>0.05)。各终浓度组微核率具有随松胞素B浓度增加而下降的趋势，与6 μg/ml组相比，8、10 μg/ml组微核率差异有统计学意义(U=-4.29、-5.25，P < 0.05)。

表 2(Table 2)

表 2 不同松胞素B终浓度对照射后核质桥率和微核率的影响(p±sp) Table 2 NPB and MN yields after radiation influenced on different final concentration of Cyt-B 松胞素B终浓度(μg/ml) 分析细胞数 核质桥数 核质桥率(核质桥/细胞) 微核数 微核率(微核/细胞) 2 400 9 0.022 5±0.007 5 244 0.610 0±0.039 1 4 1 000 19 0.019 0±0.004 4 557 0.557 0±0.023 6 6 1 000 18 0.018 0±0.004 2 602 0.602 0±0.024 5 8 1 000 13 0.013 0±0.003 6 462 0.462 0±0.021 5a 10 1 000 18 0.018 0±0.004 2 433 0.433 0±0.020 8a 注：a与6 μg/ml组微核率比较，U=-4.29、-5.25，P < 0.05

表 2 不同松胞素B终浓度对照射后核质桥率和微核率的影响(p±sp) Table 2 NPB and MN yields after radiation influenced on different final concentration of Cyt-B

2.不同松胞素B加入时间对核质桥的影响：各加入时间组的核分裂指数、双核细胞比例、双核加多核细胞比例见表 3。对照组和照射组0 h的核分裂指数、双核细胞比例、双核加多核细胞比例均为最低。28 h组、40 h组和44 h组的核分裂指数、双核细胞比例、双核加多核细胞比例均随松胞素B加入时间的推迟而降低。照射后，0 h组和44 h组的核分裂指数、双核细胞比例、双核加多核细胞比例均高于其对照组(核分裂指数：U=0.69，P>0.05；U=2.56，P < 0.05。双核细胞比例：χ²=9.30、5.00，P < 0.05。双核加多核细胞比例：χ²=7.79、12.97，P < 0.01)，而28 h组和40 h组又低于其对照组(核分裂指数：U=-2.34，P < 0.05；U=-1.34，P>0.05。双核细胞比例：χ²=8.45、19.63，P < 0.01。双核加多核细胞比例：χ²=17.54、17.09，P < 0.01)。

表 3(Table 3)

表 3 6 μg/ml松胞素B加入时间后对核分裂指数及双核细胞比例的影响 Table 3 NDI and percentages of binucleated and multinucleated cells induced by 6 μg/ml of Cyt-B 组别 样本数 核分裂指数 双核细胞比例(%) 双核加多核细胞比例(%) 对照组   0 h 1 000 1.100 8.5 9.0   28 h 1 000 1.926 53.3 66.4   40 h 1 000 1.729 52.8 59.5   44 h 1 000 1.456 37.5 40.2 照射组   0 h 1 000 1.133 12.7b 12.9c   28 h 1 000 1.783a 46.8b 57.3c   40 h 1 000 1.651 42.9b 50.3c   44 h 1 000 1.598a 42.4b 48.2c 注：a与对照组核分裂指数比较，U=-2.34、2.56，P < 0.05；b与对照组双核细胞比例比较，χ2=9.30、8.45、19.63、5.00，P < 0.05；c与对照组双核加多核细胞比例比较，χ2=7.79、17.54、17.09、12.97，P < 0.01

表 3 6 μg/ml松胞素B加入时间后对核分裂指数及双核细胞比例的影响 Table 3 NDI and percentages of binucleated and multinucleated cells induced by 6 μg/ml of Cyt-B

不同松胞素B加入时间(终浓度为6 μg/ml)对照射后核质桥及微核率的影响见表 4。由于0 h组双核细胞过少，仅分析200个双核细胞，其余3个加入时间组均分析1 000个双核细胞。照射后，0 h组核质桥率最高，与28 h组和40 h组差异具有统计学意义(U=-2.16，P < 0.05)。各加入时间组微核率在0.433 0~0.530 0/细胞之间，差异无统计学意义(P>0.05)。

表 4(Table 4)

表 4 不同松胞素B加入时间对照射后核质桥率和微核率的影响(p±sp) Table 4 NPB and MN yields after radiation influenced on different adding time of Cyt-B(p±sp) 松胞素B加入时间(h) 分析细胞数 核质桥数 核质桥率(核质桥/细胞) 微核数 微核率(微核/细胞) 0 200 11 0.055 0±0.016 6 106 0.530 0±0.051 5 28 1 000 18 0.018 0±0.004 2a 434 0.434 0±0.020 8 40 1 000 18 0.018 0±0.004 2a 472 0.472 0±0.021 7 44 1 000 25 0.025 0±0.005 0 433 0.433 0±0.021 0 注：a与0 h组核质桥率比较，U=-2.16，P < 0.05

表 4 不同松胞素B加入时间对照射后核质桥率和微核率的影响(p±sp) Table 4 NPB and MN yields after radiation influenced on different adding time of Cyt-B(p±sp)

胞质分裂阻滞分析是检测细胞遗传毒性的经典方法，最初其分析指标只有微核，近年来随着细胞组学研究的不断进展，该方法已成为检测染色体断裂或丢失、染色体不分离、DNA错误修复的综合方法^[7]。

核质桥是细胞组学研究的重要分析指标。继Fenech^[7]的研究后，国际原子能机构(IAEA)在2011年应急准备与反应出版物中也指出，胞质分裂阻滞分析测定双核细胞中核质桥水平也可用作电离辐射生物剂量的估算^[6]。研究表明，双核细胞中核质桥的数量随所受电离辐射剂量的增加而增加；在相同条件培养下，核质桥与双着丝粒染色体和着丝粒环的频率呈正相关^[8]。研究表明核质桥的形成机制来源于双着丝粒染色体^[9]，由于染色体畸变分析是国内外的电离辐射生物剂量估算的“金标准”，因此双核细胞中的核质桥也有可能成为新的辐射生物剂量计。而且，核质桥的自发率很低(低于5×10^-3)^[10-11]，与双着丝粒染色体的自发率接近，远低于微核的自发率(5×10^-3~30×10^-3)^[7]；CB法可培养出大量可供分析的双核细胞，因此核质桥的计数效率相对较高；核质桥的形态直观，容易分析鉴别，有可能实现自动化分析^[12]，这些是核质桥成为辐射生物剂量计的优势条件。本研究用2 Gy ⁶⁰Co γ射线照射正常人离体外周血，探索不同松胞素B终浓度和加入时间对辐射诱导核质桥水平的影响。

不同松胞素B终浓度对核质桥水平影响的研究中，参考IAEA在2001年出版物^[6]推荐的标准，血样在受照修复2 h后，在37℃温箱中培养40 h后加入不同终浓度的松胞素B，总计培养68 h收获。各终浓度组的核分裂指数、双核细胞比例在2~ 10 μg/ml范围内随松胞素B终浓度的增加而升高，其中，2 μg/ml组的双核细胞比例仅为22.7%，因此只分析了400个双核细胞，10 μg/ml组的双核细胞比例接近70%。因此，适当提高松胞素B终浓度，可获得更多可供分析的双核细胞。大量研究表明^[6-7]，采用胞质分裂阻滞法制备微核标本时，建议的松胞素B终浓度为6 μg/ml，由于核质桥要与微核同步制片，且选择2、4、8、10 μg/ml的松胞素B终浓度对辐射诱导核质桥率无明显差异，因此，采用胞质分裂阻滞法制备核质桥标本时，同样建议松胞素B终浓度为6 μg/ml。但松胞素B价格较为昂贵，各实验室可根据各自情况在4~10 μg/ml的范围内选择适当的松胞素B终浓度。本研究未设立10 μg/ml以上的终浓度组，在下一步研究中仍需探索。

不同松胞素B加入时间对核质桥水平影响的研究中，在上述研究的基础上，保持其他实验条件不变，在0~44 h不同时间点加入终浓度为6 μg/ml的松胞素B，总计培养68 h收获。除0 h组外，其余各终浓度组的核分裂指数、双核细胞比例在28~44 h范围内随加入松胞素B加入时间的推迟而降低。因此，为获得更多可供分析的双核细胞，可适当提前加入松胞素B的时间。培养开始加入松胞素B(0 h组)，其双核细胞比例仅为12.7%，可供分析的双核细胞数太少，因此只分析了200个双核细胞。研究表明，在进行人外周血淋巴细胞染色体培养时，在培养开始时加入秋水仙素的终浓度要远低于细胞收获前数小时加入秋水仙素的终浓度^[13]，因此，双核细胞比例低是否与在培养开始时加入松胞素B的终浓度有关，还需进一步研究。

照射后，各终浓度组核质桥率差异无统计学意义，微核率具有随松胞素B浓度的增加而下降的趋势，提示不同分析者及实验室间比较微核分析结果时应考虑松胞素B终浓度的影响。0 h组核质桥率显著高于28和40 h组，0 h组微核率也高于28、40和44 h组，但差异无统计学意义，可能由于松胞素B的细胞毒性作用造成，因此，在28 h前加入松胞素B对辐射诱导核质桥水平的影响也应做进一步研究。本研究先后两次实验中，6 μg/ml组与40 h组的实验条件相同，照射后，核质桥率均为0.018 0/细胞，而微核率分别为0.602 0/细胞和0.472 0/细胞。提示在分析1 000个双核细胞的情况下，核质桥的变动范围较小，而微核的变动范围相对较大。

综上所述，正常人离体外周血在受到2 Gy ⁶⁰Co γ射线照射后，采用胞质分裂阻滞法制备核质桥标本，不同松胞素B终浓度和加入时间可使辐射诱导的核质桥率在一定范围内变化，但差异无统计学意义(除0 h组外)；微核率具有随松胞素B终浓度的增加而下降的趋势，不同分析人员或实验室间在进行微核分析结果比较时，应考虑松胞素B终浓度对结果的影响。适当增加松胞素B终浓度、提前加入时间可提高双核细胞比例，有助于提高分析效率。然而，除松胞素B外，其他因素亦有可能对核质桥分析结果产生影响，如细胞收获时间等，尚需对其做进一步研究。