随着核能和放射技术在工业、医院卫生等领域的广泛应用，人们接触射线的机会越来越多，长期接受电离辐射后会产生乏力、口渴、皮肤干燥、烦躁不安、失眠等症状，甚至诱发肿瘤，从中医学来讲这些均为火邪致病的症状，以肾阴亏虚论治核辐射损伤，常能取得较好效果^[1]。本研究根据前期研究成果，在六味地黄丸的基础上，添加清热解毒中药，形成在研补肾解毒方，拟探讨补肾解毒方对电离辐射小鼠性激素紊乱的防护作用，现报道如下。

1.实验动物：清洁型C57BL/6小鼠72只，雌雄各半，3月龄，体重雄(28±2) g，雌(21±2) g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。许可证号：[SCXK(京)2012-0001]。自由摄食进水，普通颗粒饲料饲养，于北京师范大学生命科学院实验动物中心饲养。

2.药物：补肾解毒方中药颗粒剂(熟地10 g、山茱萸12 g、山药10 g、牡丹皮10 g、茯苓10 g、泽泻10 g、冬虫夏草3 g、白花蛇舌草10 g)由北京康仁堂药业有限公司提供。

3.试剂及仪器：小鼠血清睾酮(T)、雌二醇(E2)、孕激素(P)、黄体生成素(LH)、卵泡雌激素(FSH)酶联免疫试剂盒(北京瑞格博科技发展有限公司，RGB 96T)。⁶⁰Co γ射线辐射装置(北京师范大学化学学院)。

4.造模及给药方法：采用随机数表法分为6组，每组12只。分别为雌、雄性的空白对照组、辐射组、补肾解毒方组。于每日上午8 :00给予空白对照组与辐射组生理盐水0.2 ml灌胃，给予补肾解毒方组中药补肾解毒方剂0.2 ml灌胃，1次/d，连续灌胃10 d，第11天辐射组与补肾解毒方组接受一次性5 Gy ⁶⁰Co γ射线的全身照射，吸收剂量率1 Gy/min，总时长5 min。照射后24 h，各组采用随机数表法抽取6只处死，检测性激素水平；补肾解毒方组继续补肾解毒方灌胃1次/d，共灌胃14 d，空白对照组与辐射组正常饮水饮食饲养，照射后第14天，其余小鼠处死取材，检测性激素水平。补肾解毒方组按照人体给药剂量等比例换算为小鼠给药剂量^[2]，剂量为13.50 g ·kg^-1 ·d^-1，故取20 g补肾解毒方中药颗粒加热溶解，配置成15 ml，浓度为1.38 g/ml的中药汤剂，现配现用。

5.指标测定：分别于γ射线照射后第1、14天摘除眼球采血(1±0.2) ml，4℃，3 000 r/min，离心半径8 cm，离心5 min，分离血清，置于-80℃冰箱保存。采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)测定小鼠血清中性激素水平，其中包括雄性：T、LH、FSH；雌性：E2、P、LH、FSH。ELASA实验步骤：向预先包被了小鼠性激素单克隆抗体的酶标孔中加入相应性激素，加入生物素标记的性激素抗体，再与链霉亲和素-HRP结合，形成免疫复合物，经温育和洗涤后去除未结合的酶，加入底物A、B后产生蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色。最后产生颜色的深浅与样品中性激素浓度呈正相关。

6.统计学处理：计量资料以x ±s表示。采用SPSS 19.0软件进行分析。空白组与各处理组、处理组与处理组之间经正态性检验数据符合正态分布，采用独立样本t检验进行比较。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.各组小鼠一般情况：空白对照组小鼠于饲养过程中饮食量、饮水量、大小便均正常，皮毛完整、光滑，毛色正常，行为活跃。受辐射后小鼠第1至14天出现精神萎靡，食量减少，毛色变暗的现象，个别小鼠出现胡须脱落表现，普遍体重减轻。

2.辐射后各组雄鼠T值比较：结果见表 1。由表 1可知，辐射后1 d，辐射组、补肾解毒方组与空白对照组相比有一定程度升高，但差异无统计学意义(P>0.05)；辐射后14 d，各实验组均有不同程度降低，其中辐射组与辐射后1 d相比明显下降(t=-5.086，P < 0.05)，并低于辐射后14 d空白对照组(t=-3.742，P < 0.05)，补肾解毒方组与辐射后1 d相比，呈降低趋势(t=-3.250，P < 0.05)，但接近于辐射后14 d空白对照组水平。

表 1(Table 1)

表 1 不同处理组辐射后不同时间雄鼠睾酮的变化(nmol/L，x ±s) Table 1 Alteration of testosterone in male rats after radiation(nmol/L, x ±s) 组别 只数 1 d 14 d 空白对照组 6 5.17±0.81 4.96±0.80 辐射组 6 5.89±1.04 3.66±0.29ab 补肾解毒方组 6 5.86±1.10 4.11±0.73a 注：a与辐射后1 d同组比较，t=-5.086、-3.250，P < 0.05；b与同时间点空白对照组比较，t=-3.742，P < 0.05

表 1 不同处理组辐射后不同时间雄鼠睾酮的变化(nmol/L，x ±s) Table 1 Alteration of testosterone in male rats after radiation(nmol/L, x ±s)

3.辐射后各组雌鼠E2比较：结果见表 2。由表 2可知，辐射后第1天，补肾解毒方组E2升高，与辐射组相比，差异有统计学意义(t=2.686，P < 0.01)；辐射后第14天，辐射组、补肾解毒方组E2下降，明显低于空白对照组(t=-5.424、-3.178，P < 0.01)。

表 2(Table 2)

表 2 不同处理组辐射后不同时间对雌鼠雌二醇的影响(ng/L，x ±s) Table 2 Alteration of estrogen in female rats after radiation(ng/L, x ±s) 组别 只数 第1天 第14天 空白对照组 6 51.56±3.58 54.89±1.34 辐射组 6 49.14±2.49 49.31±2.13b 补肾解毒方组 6 54.00±3.67a 50.27±3.30b 注：a与同时间点辐射组比较，t=2.686，P < 0.01；b与同时间点空白对照组比较，t=-5.424、-3.178，P < 0.01

表 2 不同处理组辐射后不同时间对雌鼠雌二醇的影响(ng/L，x ±s) Table 2 Alteration of estrogen in female rats after radiation(ng/L, x ±s)

4.辐射后各组雌鼠P值比较：结果见表 3。由表 3可知，辐射后第1天3组差异无统计学意义(P>0.05)；辐射后第14天辐射组、补肾解毒方组与辐射后较第1天下降(t=-2.690、-3.215，P < 0.05)，且低于同时间点的空白对照组(t=-3.591、-3.923，P < 0.01)，与E2变化趋势一致。

表 3(Table 3)

表 3 不同处理组辐射后不同时间对雌鼠孕激素的影响(ng/ml，x ±s) Table 3 Alteration of progesterone in female rats after radiation(ng/ml, x ±s) 组别 只数 第1天 第14天 空白对照组 6 14.21±0.39 15.57±0.91 辐射组 6 14.76±0.77 12.80±1.62ab 补肾解毒方组 6 14.88±0.72 12.30±1.83ab 注：a与相同处理组辐射后第1天比较，t=-2.690、-3.215，P < 0.05；b与同时间点空白对照组比较，t=-3.591、-3.923，P < 0.01

表 3 不同处理组辐射后不同时间对雌鼠孕激素的影响(ng/ml，x ±s) Table 3 Alteration of progesterone in female rats after radiation(ng/ml, x ±s)

5.辐射后雄、雌鼠FSH值比较：结果见表 4。由表 4可知，辐射后第1天，雌、雄鼠辐射组FSH水平与空白对照组相比均明显升高(t=4.305、-3.905，P < 0.01)，且均高于补肾解毒方组(t=-4.904、-3.244，P < 0.01)，而补肾解毒方组与空白对照组相比无明显变化；辐射后第14天，雄、雌鼠辐射组均明显低于辐射后第1天的水平(t=-3.841、-5.048，P < 0.01)，且均与空白对照组有差别(t=4.642、-2.812，P < 0.05)，雄鼠补肾解毒方组与辐射组存在差别(t=-3.905，P < 0.01)，且比较接近空白对照组水平。

表 4(Table 4)

表 4 各处理组辐射后雄、雌鼠卵泡雌激素的变化(mIU/ml，x ±s) Table 4 Alteration of FSH in male and female rats after radiation(mIU/ml, x ±s) 组别 雄性 雌性 只数 辐射后第1天 辐射后第14天 只数 辐射后第1天 辐射后第14天 空白对照组 6 10.08±2.13 8.47±1.04 6 11.26±0.40 11.87±0.64 辐射组 6 14.95±1.77a 11.80±0.95ac 6 13.80±1.28a 10.68±0.80ac 补肾解毒方组 6 10.79±1.09b 9.21±1.32b 6 11.33±1.35b 9.89±2.94 注：a与相同时间点空白对照组比较，t=4.305、4.642、-3.905、-2.812，P < 0.05；b与同时间点辐射组比较，t=-4.904、-3.905、-3.244，P < 0.01；c与相同处理组辐射后第1天比较，t=-3.841、-5.048，P < 0.01

表 4 各处理组辐射后雄、雌鼠卵泡雌激素的变化(mIU/ml，x ±s) Table 4 Alteration of FSH in male and female rats after radiation(mIU/ml, x ±s)

6.辐射后雄、雌鼠LH值比较：结果见表 5。由表 5可知，辐射后第1天，辐射组、补肾解毒方组雄鼠LH水平升高，与空白对照组相比，差异有统计学意义(t=4.537、2.336，P < 0.01)；辐射后第14天，补肾解毒方组恢复至正常水平，与辐射后第1天相比，差异有统计学意义(t=-5.624，P < 0.01)，辐射组LH较辐射后第1天有所下降(t=-4.093，P < 0.01)，但仍明显高于空白对照组、补肾解毒方组(t=2.963、4.044，P < 0.01)。辐射后第1、14天雌鼠各组间LH差异无统计学意义(P>0.05)。

表 5(Table 5)

表 5 雄、雌鼠辐射后不同时间黄体生成素的变化(mIU/ml，x ±s) Table 5 Alteration of LH in male and female rats after radiation(mIU/ml, x ±s) 组别 雄性 雌性 只数 辐射后第1天 辐射后第14天 只数 辐射后第1天 辐射后第14天 空白对照组 6 7.32±1.27 5.99±0.55 6 9.47±0.26 10.09±0.86 辐射组 6 10.97±1.51a 7.67±1.28ab 6 10.10±0.42 10.04±0.51 补肾解毒方组 6 9.26±1.60a 5.34±0.61bc 6 10.40±0.86 9.10±1.50 注：a与同时间点空白对照组比较，t=4.537、2.336、2.963，P < 0.01；b与相同处理组辐射后第1天比较，t=-4.093、-5.624，P < 0.01；c与同时间点辐射组比较，t=-4.044，P < 0.01

表 5 雄、雌鼠辐射后不同时间黄体生成素的变化(mIU/ml，x ±s) Table 5 Alteration of LH in male and female rats after radiation(mIU/ml, x ±s)

针对放射工作人员的防护，中外研究人员均在积极研发抗辐射生物制剂，并取得了一定成果，但现有各种制剂仍存在一定缺陷，需要开发具有高效低毒且容易给药的新型辐射防护药物^[3]。中草药在我国分布范围广泛，简单易得，含有大量可抗辐射的活性成分，而且有效剂量毒性较化学合成药物低，是较理想的抗辐射药物。石鹏展等^[4]从火邪伤阴耗气、热扰心神、易致肿疡3个方面论述了辐射后出现的临床症状与火邪致病的关系。杨云霜等^[5]发现上述辐射所致病症，从肾论治，“壮水之主，以制阳光”，应用六味地黄丸加减方常能取得较好疗效。六味地黄丸临床多用于由肾阴亏虚所引起的头晕耳鸣、腰膝酸软、遗精盗汗、消渴等症；经加减还可针对性用于前列腺增生，泌尿系统感染等疾病。本研究用方以六味地黄丸为基础，考虑辐射后脾胃腐熟水谷、消化吸收功能减弱，而熟地滋腻碍胃，故减少熟地剂量至10 g；加白花蛇舌草取其清热解毒、消痈散结之效^[6]，再入冬虫夏草补肺益肾，同时能够调节免疫^[7]，上述方药拟成补肾解毒方，扶正驱邪、标本兼治。本研究前期实验中分别应用5、6、7 Gy进行照射，其中6 Gy单纯照射30 d，死亡率达71.9%，本实验旨在观察电离辐射对生殖系统的作用，需较高存活率，故选用5 Gy，照射后观察时间仅14 d，时间较短，剂量较小，故实验中未有因电离辐射所致死亡情况。

生殖系统对辐射极其敏感，易受到辐射损伤，造成不孕不育、流产等现象。体内性激素水平的变化能较清晰地反映出机体生殖系统功能状态，可作为评价生殖系统损伤的指标之一。

男性不育多是由于精子形成及排出障碍引起，生殖系统对于辐射具有高敏感性，辐射常引起精子生成障碍，精子质量降低，进而造成暂时或永久性不育^[8]。T由睾丸间质细胞分泌，辐射除造成间质细胞损伤外，常伴有睾丸支持细胞损伤。支持细胞可分泌雄激素结合蛋白，与雄激素结合提高间质细胞外环境雄激素水平，促进精子形成。此外，支持细胞还能分泌抑制素(Inhibin β)可有效调节垂体FSH分泌，人体内Inhibin β大部分均来自支持细胞^[9]。有研究显示辐射后出现间质细胞损伤，T合成与分泌减少^[10]。另有研究显示辐射后支持细胞损伤，Inhibin β分泌减少，对FSH抑制作用减弱，导致FSH升高，同时LH升高提示睾丸生殖功能的减退^[11]，本研究所得结果与其相一致，同时本实验补肾解毒方组T值减少及FSH、LH升高程度均较辐射组小，表明补肾解毒方能够减轻辐射对支持细胞和间质细胞损伤，并对其恢复起到促进作用。而本研究结果中，辐射后1 d，T水平变化不明显，可能为雄激素结合蛋白的减少导致雄激素扩散至血液，这与间质细胞分泌T减少形成抵消所致。

女性不育多因卵子成熟、排出障碍，以及子宫接受性差引起。垂体分泌FSH与LH通过血液循环作用于卵巢，一方面作用于卵泡，促进卵泡发育、分裂与成熟，另一方面促进卵巢分泌性腺类固醇，共同调节女子生殖功能。李冬春等^[12]将大鼠卵巢摘除制造绝经大鼠模型，给予滋肾填精、大补真阴之补肾健骨汤治疗，治疗组E2水平出现明显升高，说明补肾阴类中药具有促进E2合成与分泌的功效。本研究辐射后1 d补肾解毒方组出现E2水平升高，可能为辐射前给予补肾解毒方所致。辐射后14 d辐射组与补肾解毒方组E2均出现降低，考虑为辐射导致卵巢颗粒细胞损伤，分泌雌激素能力减弱，辐射组P水平辐射后第14天出现降低，进一步证明了卵巢损伤的理论，这与潘晓燕等^[13]的研究结果一致。本研究辐射后血清中FSH水平升高，为卵巢早衰或卵巢不敏感综合征的表现^[14]，可引起卵泡进行无排卵性消耗，进而导致女性不孕。补肾解毒方组小鼠E2降低水平与FSH波动均较小，说明补肾解毒方对电离辐射致小鼠生殖系统损伤具有防治作用。

综上所述，补肾解毒方可减轻辐射致雄鼠支持细胞与间质细胞损伤，并对其恢复起促进作用；对于雌鼠，可减轻辐射致卵巢功能减退并促进卵巢性腺类固醇分泌能力。同时，由于其高效低毒的特性，为防治辐射致生殖损伤的较理想防护剂，但因其成分复杂，故作用机制与靶点还需进一步研究。