根据国家癌症中心统计，我国肺癌患者5年生存率仅为16.1%^[1-2]。放疗是肺癌的常用治疗手段之一，但放疗并没有明显提高患者的5年生存率，且有90%的放疗患者死于恶性肿瘤的侵袭转移。近年来研究显示，一定剂量电离辐射可能有促进恶性肿瘤细胞侵袭转移之疑^[3-5]。

研究发现，miRNA与辐射的敏感性、辐射诱导肿瘤的发生和辐射旁观者效应密切相关^[6-7]。为进一步研究miR-424^*在射线诱导的A549细胞体内、外侵袭能力中的变化，及其在肺癌诊断中的潜在作用，本研究在前期工作基础上，展开了对2、4 Gy X射线照射后A549细胞体内、外miR-424^*的表达变化研究，并建立裸鼠尾静脉注射经X射线照射后的A549细胞转移肺癌模型，通过对注射后不同时间点裸鼠肺组织及血清中mi-424^*的表达变化，及临床肺癌患者血清中该miRNA的表达检测，探讨其在辐射增强A549细胞侵袭转移中的可能作用及作为生物标记物的潜在可能性。

1.细胞与试剂：人肺腺癌A549细胞购自北京协和医学院细胞库。细胞系用含有10%灭活胎牛血清、100 kU/L青霉素和100 kU/L链霉素的DMEM培养液，37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。特级胎牛血清、DMEM培养基购自美国GIBCO公司；microRNA提取试剂盒 (mirVana^TM miRNA Isolation Kit)、microRNA反转录试剂盒 (TaqMan^® MicroRNA Reverse Transcription Kit) 均购自美国ABI公司。

2.细胞照射：取处于对数生长期的A549细胞，常温下以直线加速器 (火箭军总医院放射治疗中心，瑞典Elekta公司Precise型) 进行照射，源靶距为100 cm，X射线能量为6 MV，吸收剂量率为442.89 cGy/min，吸收剂量分别为2和4 Gy，于照射后1、2、12、24及48 h收集细胞进行检测，非照射 (0 Gy) 的A549细胞为对照组。

3.动物样本采集：①血清：取18~22 g体重的BALB/c nu/nu雌性裸鼠，采用简单随机化分组方法分为5组 (0 Gy 3周、0 Gy 6周、0 Gy 10周、2 Gy 10周和4 Gy 10周)，每组6只；于小鼠尾静脉注射不同剂量照射的A549细胞5×10⁶细胞，以未注射A549细胞的裸鼠作为空白对照组，分别于照射后3、6、10周眼球放血，分离血清，分装-20℃冰箱保存，用于后续miRNA检测。②肺组织：眼球放血后的小鼠，快速打开胸腔，分离肺组织，迅速放入液氮中冷冻，然后取出-80℃冰箱保存，用于RNA提取。

4. miRNA提取及RT qPCR检测：①A549细胞RNA提取：用磷酸盐缓冲液 (PBS) 洗培养好的A549细胞，每10²~10⁷细胞内加入600 μl Lysis/Binding Solution，裂解细胞3 min；收集裂解液于1.5 ml EP管中用于RNA提取。②裸鼠肺组织RNA提取：液氮研磨 < 200 mg裸鼠肺组织，转移粉末至1.5 ml EP管中，加入1 000 μl Lysis/Binding Solution裂解细胞。③裸鼠血清miRNA提取：-80℃冰箱取出冻存血清，充分融化后，室温条件下，于625 μl血清中加入等体积的2×Denaturing Solution，立即混匀，冰上孵育5 min；miRNA的提取参照美国ABI公司miRNA Isolation Kit操作手册进行；反转录体系及反应条件参照TaqMan^® MicroRNA Reverse Transcription Kit操作手册；探针和引物参照miRBase，由美国ABI公司合成；qPCR参照美国ABI公司TaqMan Human MicroRNA Assay kit操作手册。以U6表达水平作为miRNA的内参；每个样品3个复孔，细胞实验重复3次，取均值。

5. miRNA相对表达量计算方法：分别以对照组中U6 miRNA的表达量为1，△△Ct法计算各组miRNA-424^*表达量的倍数^[1-2]。公式为：2^-△△Ct=2^{-(△Ct实验组-△Ct对照组)}；△Ct=Ct_待测样品-Ct_内参。

6.肺癌患者入组标准：依据2009年7月国际肺癌研究学会 (IASLC) 制定的第7版肺癌TNM分期标准，纳入本次研究者均经病理细胞学确诊。所有入选人员均签署知情同意书，所有对象的病例资料记录完整，均经临床体检、纤维支气管镜检查，以及胸部、头部、腹部CT或腹部B超、全身骨扫描等检查，且所选病例无妊娠、无糖尿病、无肝肾功能不全、无充血性心力衰竭和高血压等并发症。本研究得到本院伦理委员会批准。排除标准：术后大体病理仍无法确认的；术前有放射治疗或化学治疗史的；肺穿刺标本不作为研究对象。转移组与非转移组患者在年龄、一般情况、卡氏评分等差异无统计学意义。

7.肺癌患者样本采集：①肺癌病理组织：11例甲醛固定-石蜡包埋的肺癌患者肺组织样本来自于原北京军区总医院2014年1月至10月的住院手术患者，病理诊断为5例腺癌，6例鳞癌，其中8例为Ⅰ期，2例为Ⅱ期，1例为Ⅳ期。同时取无肺癌细胞的肺组织作为对照。②血清样本：84例肺癌患者血清样本来自火箭军总医院2014年1月至2016年5月期间的住院患者。84例患者中46例为腺癌，38例为鳞状细胞癌，绝大多数为Ⅳ期患者。选取2014年3月在火箭军总医院体检中心的10例健康体检者作为健康对照组。抽取患者外周血4 ml，待凝固后离心半径7.5 cm，5 000 r/min，离心6 min，用无RNA酶的枪头吸取血清样本于1.5 ml无RNA酶的EP管中，每位患者3~4管，置-80℃冰箱冻存，备用。所有关于人体样本的试验已经本院伦理委员会批准，相应批件号为2015036。

8.统计学处理：数据以x±s表示，采用SPSS 19.0软件进行数据分析。满足正态分布与方差齐性的数据，不同剂量组与对照组之间采用单因素k水平方差分析，实验组与对照组之间采用独立样本t检验；其余采用非参数检验；不同病理类型及放疗与否样本阳性检出率采用χ²检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

1. X射线对A549细胞miRNA-424^*的表达影响：结果见表 1。与对照组相比，2 Gy X射线照射后1、2、12、24及48 h，miR-424^*表达均显著升高，为对照组的2.41、1.27、3.13、1.49及2.56倍，(t=-45.886、-8.429、-6.93、-9.139、-6.709，P < 0.05)；4 Gy X射线照射后1、2、12及48 h，miR-424^*表达亦均显著升高，为2.33、1.98、2.38及2.42倍 (t=-7.979、-29.087、-21.749、-7.833，P < 0.01)；尽管与对照组相比，4 Gy X射线照射后24 h，miR-424^*表达差异无统计学意义 (P > 0.05)，但整个观察期，miR-424^*表达的总体水平显著升高，为2.33、1.98、2.38及2.42倍 (t=-7.979、-29.087、-21.749、-7.833, P < 0.01);尽管与对照组相比, 4 Gy X射线照射后24 h, miR-424*表达差异无统计学意义 (P > 0.05), 但整个观察期, miR-424*表达的总体水平显著升高, 平均升高2.004倍。4 Gy X射线照射后2 h，A549细胞miR-424^*的表达水平显著高于2 Gy组 (t=-15.208，P < 0.01)；而照射后24 h，4 Gy照射组其miR-424^*表达水平显著低于2 Gy组 (t=10.446，P < 0.01)。提示miR-424^*可能参与了2、4 Gy X射线照射诱发的细胞生物学行为变化的调节。

表 1(Table 1)

表 1 2、4 Gy X射线照射后不同时间A549细胞miR-424*表达变化 (x±s) Table 1 The relative expression of miR-424* in A549 cells at different time-points after 2 and 4 Gy X-ray irradiation (x±s) 照射剂量 (Gy) 样本数 1 h 2 h 12 h 24 h 48 h 0 4 1.00 1.00 1.00 1.00 1.00 2 4 2.41±0.06a 1.27±0.06a 3.13±0.61a 1.49±0.11a 2.56±0.46a 4 4 2.33±0.33b 1.98±0.07bc 2.38±0.13b 0.92±0.02c 2.42±0.36b 注：a与0 Gy组比较，t=-45.886、-8.429、-6.93、-9.139、-6.709，P < 0.05；b与0 Gy组比较，t=-7.979、-29.087、-21.749、-7.833，P < 0.01；c与4 Gy组比较，t=-15.208、10.446，P < 0.01

表 1 2、4 Gy X射线照射后不同时间A549细胞miR-424*表达变化 (x±s) Table 1 The relative expression of miR-424* in A549 cells at different time-points after 2 and 4 Gy X-ray irradiation (x±s)

2. 2、4 Gy X射线对肺转移癌裸鼠血清及肺组织中miR-424^*表达影响：如图 1A所示，分别将0、2、4 Gy照射后的A549细胞注射裸鼠尾静脉后3、6周，肺中无肉眼可见的肿瘤灶，肺组织中miR-424^*的表达与对照组相比，差异无统计学意义 (P > 0.05)。注射后10周，裸鼠肺中可见散在的肿瘤灶，3组裸鼠肺中均可检测到miR-424^*表达显著升高，为空白对照组的9.72、8.58及4.7倍 (t=-13.243、-12.409、-9.833，P < 0.05)，且0 Gy组与2 Gy组显著高于4 Gy组 (t=7.156、5.617，P < 0.01)。裸鼠血清检测结果如图 1所示，注射后3、6周，与对照组相比，裸鼠血清miR-424^*表达显著升高 (t=-4.142、-2.884，P < 0.05)；注射后10周，3组裸鼠血清中均可检测到miR-424^*表达显著升高，分别为对照组的11.93、9.22及8.99倍 (t=-6.436、-3.052、-3.609，P < 0.05)，各剂量组间差异无统计学意义 (P > 0.05)。

图 1 X射线对肺转移癌裸鼠血清及肺组织中miR-424*表达影响A. 2、4 Gy A549细胞照射后不同时间点裸鼠肺及血清中miR-424*的表达变化；B.不同剂量射线照射后A549细胞裸鼠尾静脉注射10周肺及血清中miR-424*的表达变化 注：a与肺组织空白对照组比较，A：t=-13.243，P < 0.05；B：t=-13.243、-12.409、-9.833，P < 0.05；b与血清空白对照组比较，A：t=-4.142、-2.884、-6.436，P < 0.01；B：t=-6.436、-3.052、-3.069，P < 0.01；A. 3个不同时间点比较，F肺=1.255，P < 0.05，F血清=3.163，P < 0.01；B. 3个不同剂量组间比较，F肺=45.966，P < 0.01 Figure 1 Influence of X-ray irradiation on the expression of miR-424* in lung tissue and serum of nude mice with injection of A549 cells A. The dynamic expression of miR-424* in lung tissue and serum of nude mice at different time-point after A549 cell injection; B. The expression of miR-424* in lung and serum of nude mice at 10 weeks after 0, 2, 4 Gy X-ray irradiated A549 cells injection

3. miR-424^*在临床肺癌标本及血清中的表达：11例肺癌患者病理标本与相邻无肺癌细胞的肺组织相比，有6例miR-424^*表达升高 (升高1.95~7.26倍)，见图 2。其中5例腺癌中检出4例；6例鳞癌标本中2例，两者之间差异无统计学意义 (P > 0.05)。

图 2 miR-424*在不同病理类型肺癌组织中的相对表达 注：虚线代表miR-424*相对表达为健康对照组的1.8倍；+、○表示相应病理类型患者肺癌组织中miR-424*表达水平；“—”表示均值 Figure 2 The expression of miR-424* in the tissue of lung cancer

84例肺癌患者血清中miR-424^*表达升高的占51.20%(43/84)，与健康志愿者血清水平相比，升高1.97~17.71倍，见图 3。其中，46例腺癌患者血清的检出率为39.1%(18/46)，38例鳞癌患者血清检出率为65.8%(25/38)，两种病理类型中的检出率差异有统计学意义 (χ²=5.919，P < 0.05)。此外，84例肺癌患者中，miR-424^*在未接受放疗的患者血清的阳性检出率为41.5%(22/53)，显著低于接受放疗的患者血清的阳性检出率67.7%(21/31)(χ²=5.387，P < 0.05)。提示miR-424^*有可能作为肺癌分型诊断新的潜在标志物，其表达升高与放疗与否相关。

图 3 肺癌患者血清中miR-424*的相对表达 A.两种病理类型中表达；B.在放疗与非放疗患者中的表达 注：虚线代表miR-424*相对表达为健康对照组1.8倍；+、○表示患者血清中miR-424*的表达水平；“—”表示均值 Figure 3 The relative expression level of miR-424* in serum sample of lung cancer patients. A. The expression of miR-424* in serum sample of lung cancer patients with two pathological type; B. The expression of miR-424* in serum sample of lung cancer patients with and without radiotherapy

放疗是肺癌治疗的重要手段之一，然而，近来研究发现，对小鼠原发肿瘤进行放疗能加速恶性肿瘤的侵袭转移能力^[8]。前期研究发现，2、4 Gy X射线可增强人肺腺癌A549细胞的体外侵袭能力，其机制与调节血管内皮生长因子 (VEGF) 及CCR-7 mRNA的表达有关，并进一步采用Taq^MAN微流体芯片技术初步筛选了2、4 Gy X射线照射A549细胞后差异表达的miRNAs，发现miR-424^*表达显著升高^[9]。本研究在前期工作基础上，进一步研究2、4 Gy X射线照射后A549细胞miR-424^*的表达变化，并探讨其在辐射增强A549细胞侵袭转移中的作用。

miRNAs是一类长度为22个左右核苷酸的小分子非编码RNA，参与基因转录后水平的调控，具有高度的保守性和组织特异性，其通过与目标mRNA特定结合部位的完全互补来降解mRNA或部分互补来抑制mRNA转录后表达，从而发挥其生物学功能。超过50%的miRNAs位于肿瘤相关区域或脆性区域，与肿瘤的发生、发展及侵袭转移密切相关^[10-13]。Yanaihara等^[14]鉴定了6种miRNAs在肺腺癌和肺鳞癌中的表达，发现miR-99b和miR-102在肺腺癌患者血清中的表达水平显著高于肺鳞癌患者。Landi等^[15]研究报道了肺腺癌与肺鳞癌患者外周血miRNA的表达与预后密切相关，如miR-155及miR-146b在鳞癌患者血清中高表达与预后整体生存率低密切相关。另有研究亦报道，miRNAs表达谱在肺腺癌与肺鳞癌患者中显著不同^[16-17]。

目前，有关miR-424^*在肺癌，特别是非小细胞肺癌发生发展中的研究鲜有报道。本研究首次观察了人肺腺癌A549细胞在0、2与4 Gy X射线照射后miR-424^*的体内、外表达变化，结果发现体外2、4 Gy X射线照射A549细胞后1、2、12、48 h miR-424^*表达均有不同程度升高，且4 Gy照射后2、24 h miR-424^*表达水平较2 Gy组显著升高。研究显示，辐射能在不同的组织和细胞中诱导miRNA的表达，且其表达与特定的细胞类型、辐射剂量及照射时间均有密切关系，部分miRNA呈现出剂量及时间变化的不同反应^[18-19]。本研究中，2、4 Gy X射线照射后，miR-424^*的表达变化亦呈现随时间变化的不同趋势，与芯片筛选的结果一致^[9]。研究进一步将2、4 Gy X射线照射后的A549细胞经尾静脉注射裸鼠，发现注射后10周，裸鼠肺中可见散在的肿瘤灶形成，裸鼠肺组织中miR-424^*表达水平亦显著升高，提示miR-424^*可能参与了2、4 Gy X射线照射所诱发的A549细胞侵袭转移过程，且裸鼠血清中miR-424^*表达水平升高可能为肺癌诊断提供了新的肿瘤标志物。

为进一步验证上述发现，本研究收集并检测了11例肺癌患者肺癌组织病理标本和84例肺癌患者血清标本。结果发现在11例肺癌组织中有6例高表达miR-424^*，其中5例腺癌中有4例检测出miR-424^*，6例鳞癌标本中miR-424^*检出2例，两者之间差异无统计学意义，其原因可能是由于研究中所收集的肺癌样本数量过少，在今后的研究中要继续收集肺癌组织进行验证。在84例肺癌患者血清中miR-424^*表达升高的占51.20%(43/84)，与健康志愿者血清水平相比，升高1.97~17.71倍，其中46例腺癌患者血清的检出率为39.1%(18/46)，38例鳞癌患者血清检出率为65.8%(25/38)，两种病理类型中的检出率差异显著；此外，84例肺癌患者中，miR-424^*在未接受放疗的肺癌患者血清中的阳性检出率为41.5%(22/53)，显著低于接受放疗的肺癌患者血清的阳性检出率67.7%(21/31)。上述结果说明miR-424^*在不同病理类型肺癌患者血清中的表达水平是有差异的，其中肺鳞癌患者血清检出率要高于肺腺癌患者，提示miR-424^*有可能作为肺癌分型诊断新的潜在标志物，且其表达升高与放疗与否相关。

文献报道，miR-424在多种癌症中异常表达，如胰腺癌、肾透明细胞癌、舌鳞状细胞癌中表达上调；宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌中表达下调^[20-23]。部分研究证明，miR-424与肿瘤侵袭转移密切相关，在不同的癌组织中其侵袭转移的作用机制不尽相同。Wu等^[24]利用胰腺癌细胞进行体外实验并发现，抑制细胞中miR-424表达，其侵袭转移能力降低。Xu等^[25]发现宫颈癌细胞中miR-424过表达，细胞侵袭转移能力减弱；反之，宫颈癌细胞中低表达，则细胞侵袭转移能力增强。miR-424^*与miR-424共同位于染色体Xq26.3，Xq26区域，是同一前体的两个不同分子亚型 (miR-424-3p为miR-424^*，miR-424-5p为miR-424)。目前，关于miR-424^*的功能特别是在肺癌中的研究报道极少。研究显示，尽管两个miRNA分子亚型来源于同一前体miRNA，但miR-424与miR-424^*的功能不尽相同，甚至完全相反^[26-27]。miR-424可以逆转肝癌上皮细胞的间充质转化，进而抑制肝癌细胞的侵袭过程^[26]，这一效应与miR-424-3p完全相反。另有研究显示，胰腺癌中miR-424-5p的表达上调可以增强胰腺癌细胞的增殖、侵袭及转移^[27]。Zhang等^[28]研究发现，miR-424^*表达下调与NSCLC的进展及整体预后密切相关，且miR-424^*与miR-424均可通过靶向YAP1基因显著抑制NSCLC细胞的增殖、迁移及侵袭；此外，miR-424^*通过靶向YAP1基因增强NSCLC细胞的化疗敏感性，证实了miR-424^*在肿瘤的化疗抵抗与侵袭中发挥肿瘤抑制因子的作用。本研究发现，84例肺癌患者超过50%的血清样本中miR-424^*表达升高，且在放疗组患者中miR-424^*检出率显著高于非放疗组患者，该结果与文献报道^[28]并不完全一致，一方面在于两个研究的目的及研究对象状态不同：本研究的目的是研究不同剂量射线对细胞miRNA的表达影响，而文献中的研究对象为无处理或经化疗药处理的细胞，化疗对细胞miRNA表达的影响尚未见报道，而辐射诱导细胞miRNA表达改变已有报道^[18-19]；另一方面，肿瘤细胞生物学特性相关的靶基因不同：本研究主要探讨射线诱导A549细胞表达变化的miRNA及其下游影响的相关靶基因，而文献报道研究的是与化疗敏感的靶基因，因此其作用机制及作用结果不尽相同。此外，本研究发现的miR-424^*参与2、4 Gy X射线照射所诱导的A549细胞侵袭转移过程的机制有待进一步研究。