骨髓是对电离辐射最敏感的组织，电离辐射引起的骨髓损伤是肿瘤放疗患者最常见的不良反应之一。电离辐射引起的骨髓损伤主要是由于骨髓中造血干祖细胞 (hematopoietic stem and progenitor cells，HSPCs) 数量减少、自我更新及重建能力下降、细胞凋亡增加，从而引起持久的骨髓抑制^[1]。研究发现，活性氧 (reactive oxygen species，ROS) 在电离辐射诱导的组织损伤中发挥了重要作用。而H₂是一种有效的抗氧化剂，对电离辐射引起心脏、皮肤、睾丸等组织的损伤具有保护作用^[2]。本研究以富氢水为原料，探讨其对电离辐射诱导的HSPCs损伤的保护作用。

1.实验动物：SPF级别C57BL/6雄性小鼠 (CD45.2)32只，6~8周龄，体重19~21 g，购自北京华阜康生物科技有限公司，许可证号：SCXK (京)2014-0004。SPF级别C57BL/6雄性小鼠 (CD45.1)32只，6~8周龄，体重范围19~21 g，购自中国医学科学院血液学研究所血液病医院，许可证号：SYXK (津)2014-0002。

2.试剂与仪器：FITC-CD34抗体、APC-c-kit抗体、PE-Sca1抗体购自美国eBioscience公司；生物素-Gr1、CD11b、Ter119、CD4、CD8、B220偶联抗体，PerCP-生物素-链霉亲和素偶联抗体购自美国Biolegend公司；抗APC磁珠、MACS分选柱、MACS分选器购自德国Miltenyi Biotec公司。Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒 (美国BD Biosciences公司)、活性氧检测试剂盒 (江苏碧云天生物技术有限公司)、甲基纤维素半固体培养基 (美国Stem Cell公司)。氢气发生器 (山东赛克赛斯氢能源有限公司，型号：SHC-300)，溶解氢测试仪 (日本TRUSTLEX公司，型号：ENH-1000)、流式细胞仪 (美国BD Biosciences公司，型号：Accuri C6)、¹³⁷Cs γ射线照射源 (加拿大原子能有限公司，型号：USD Autocell40，吸收剂量率为0.99 Gy/min)。

3.富氢水的制备：取500 ml蒸馏水注入氢气发生器，20 min后得到富氢水，用溶解氢测试仪检测水中溶解氢的浓度。实验中富氢水均为新鲜制备，并保证水中溶解氢的浓度大于0.8×10^-6 /L。

4.实验分组及照射：根据小鼠体重分层，随机区组法分为4组，每组8只小鼠 (CD45.2)。健康对照组：照射前5 min至照后7 d，每天灌胃给予0.5 ml蒸馏水；富氢水组：照射前5 min至照后7 d，每天灌胃给予0.5 ml富氢水；照射组：接受2 Gy全身照射，照射前5 min至照后7 d，每天灌胃给予0.5 ml蒸馏水；照射+富氢水组：接受2 Gy全身照射，照射前5min至照后7 d，每天灌胃给予0.5 ml富氢水。

5.小鼠骨髓造血干祖细胞比例的检测：照后15 d，颈椎脱臼处死小鼠，无菌分离双侧股骨和胫骨，用磷酸缓冲盐溶液 (PBS) 冲出骨髓，过滤、混匀得到骨髓细胞悬液。每组取5只小鼠 (CD45.2)，每只小鼠取5×10⁶骨髓细胞，加入生物素-Gr1、CD11b、Ter119、CD4、CD8、B220偶联混合抗体 (Lineage)2.5 μl，4℃避光孵育30 min，PBS洗去多余抗体，依次加入PerCP-生物素-链霉亲和素偶联抗体2 ml、PE-sca1抗体0.5 ml、APC-c-kit抗体0.5 ml、FITC-CD34抗体2 ml，4℃避光孵育1 h，PBS洗去多余抗体，流式细胞仪检测。

6.小鼠骨髓细胞克隆形成能力 (CFU-GM) 的检测：未照射组取2×10⁴骨髓细胞，照射组取2×10⁵骨髓细胞，分别加入2 ml甲基纤维素培养基，每组设置6个平行样。置于37℃、5% CO₂培养箱中培养，第5天低倍镜下观察集落形成情况，计数细胞数≥30的集落数目。

7.竞争性骨髓移植实验 (competitive bone marrow transplantation, cBMT) 及受体小鼠嵌合率的检测：照后第15天每组取3只小鼠作为供体，3只健康小鼠作为竞争者。移植前4 h受体小鼠 (CD45.1) 接受8 Gy的¹³⁷Cs γ射线全身照射，吸收剂量率为0.99 Gy/min。分别从供体小鼠 (CD45.2) 和竞争者小鼠 (CD45.1/45.2) 取1×10⁶骨髓细胞，混合后自内眦静脉注入受体小鼠，每组受体小鼠8只。移植后16周取受体小鼠外周血检测供体嵌合率 (CD45.2细胞的比例)。

8.小鼠骨髓LSK细胞内ROS水平和细胞凋亡的检测：1×10⁶骨髓细胞加入Lineage、sca1、c-kit抗体染色 (具体见材料与方法5)，再加入500 ml活性氧检测探针 (DCFHDA与PBS缓冲溶液比例为1:3 000)，37℃水浴20 min，PBS洗去未结合的DCFHDA，每组设置4个平行样，流式细胞仪检测DCFHDA的平均荧光强度。1×10⁶骨髓细胞经Lineage、sca1、c-kit抗体染色后加入100 ml binding buffer和5 ml Annexin V-FITC，混匀后避光室温孵育15 min，上机前加入100 ml binding buffer，每组设置4个平行样，流式细胞仪检测细胞凋亡。

9.统计学处理：数据用x±s表示。采用SPSS 19.0软件进行分析。数据服从正态分布, 两组间均数的比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

1.富氢水对受照小鼠骨髓造血干祖细胞比例的影响：与健康对照组相比，富氢水组小鼠骨髓造血祖细胞 (lineage-sca1^-c-kit⁺ hematopoietic progenitor cells，HPC)、LSK细胞 (lineage-sca1⁺c-kit⁺)、CD34-LSK和CD34+LSK细胞的比例无显著变化；与健康对照组相比，照射组小鼠骨髓HPC、LSK、CD34+LSK细胞的比例明显下降，CD34-LSK细胞比例显著增加；而与照射组相比，照射+富氢水组小鼠骨髓HPC、LSK、CD34+LSK细胞的比例显著升高，CD34-LSK细胞比例显著下降 (表 1，图 1)。

表 1(Table 1)

表 1 富氢水对HSPCs辐射损伤的保护作用 (x±s) Table 1 The protection effect of hydrogen-rich water on radiation-induced HSPCs injury (x±s) 组别 只数 HPC (%) LSK (%) CD34-LSK (%) CD34+LSK (%) CFU-GM数目 (×105) 嵌合率 (%) ROS (平均荧光强度) 健康对照组 8 21.03±3.47 3.64±1.33 5.77±3.34 94.23±3.34 633.33±61.54 25.40±2.76 20 678±2 323 富氢水组 8 18.80±2.88 5.70±1.62 5.59±1.32 94.41±1.32 656.67±53.91 22.81±4.11 19 416±5 129 照射组 8 12.76±1.89a 1.27±0.21a 16.94±4.34a 83.06±3.34a 125.83±17.73a 4.43±1.34a 56 422±7 669a 照射+富氢水组 8 19.93±2.64b 2.81±0.38b 6.41±2.05b 93.59±2.05b 222.50±39.34b 14.28±1.73b 35 097±6 001b 注：a与健康对照组相比，t=4.685、3.916、-4.558、4.558、19.412、19.374、-8.922，P＜0.05；b与照射组相比，t=-4.935、-7.898、4.907、-4.907-5.488、-12.769、4.380，P＜0.05

表 1 富氢水对HSPCs辐射损伤的保护作用 (x±s) Table 1 The protection effect of hydrogen-rich water on radiation-induced HSPCs injury (x±s)

图 1 富氢水对受照骨髓造血干祖细胞比例的影响 Figure 1 The effect of hydrogen-rich water on the percentage of irradiated hematopoietic stem and progenitor cells

2.富氢水对受照小鼠骨髓细胞克隆形成能力的影响：与健康对照组相比，富氢水组小鼠骨髓细胞CFU-GM数目无显著变化；与健康对照组相比，照射组小鼠骨髓细胞CFU-GM数目明显下降；而与照射组相比，照射+富氢水组小鼠骨髓细胞CFU-GM数目显著增加 (表 1)。

3.富氢水对受照小鼠骨髓细胞移植后重建能力的影响：移植后16周，健康对照组和富氢水组受体小鼠的供体嵌合率分别为25.40%和22.81%，差异无统计学意义 (P > 0.05)。照射组和照射+富氢水组受体小鼠的供体嵌合率分别为4.43%和14.28%，照射组受体小鼠的供体嵌合率明显低于健康对照组，而照射+富氢水组受体小鼠的供体嵌合率显著高于照射组 (表 1，图 2)。

图 2 富氢水改善受照骨髓造血干祖细胞的移植后重建能力 Figure 2 The improvement in reconstruction capacity of irradiated hematopoietic stem and progenitor cells after competitive bone marrow transplantation made by hydrogen-rich water

4.富氢水对受照小鼠骨髓LSK细胞ROS水平的影响：与健康对照组相比，富氢水组小鼠骨髓LSK细胞的ROS水平明显下降，而照射组小鼠骨髓LSK细胞ROS水平明显升高；与照射组相比，照射+富氢水组小鼠骨髓LSK细胞ROS水平显著降低 (表 1)。

5.富氢水对受照小鼠骨髓LSK细胞凋亡影响：健康对照组和富氢水组小鼠骨髓LSK细胞分别有6.20%和5.94%发生凋亡，但差异无统计学意义 (P > 0.05)。照射组小鼠骨髓LSK细胞的凋亡率为20.68%，显著高于健康对照组 (t=-5.111，P＜0.05)。照射+富氢水组小鼠骨髓LSK细胞的凋亡率为9.35%，显著高于照射组 (t=3.954，P＜0.05)，见图 3。

图 3 富氢水抑制辐射诱导的骨髓LSK细胞的凋亡 Figure 3 The anti-apoptosis effect of hydrogen-rich water on irradiated LSK cells

H₂主要通过清除羟自由基发挥抗氧化活性，可抑制电离辐射引起的ROS水平的升高，对受照细胞、心血管组织、生殖系统、血液系统、肺组织、小肠组织及整体动物均有显著地辐射防护作用^[3-8]。Chuai等^[4]发现，富H₂溶液使受照小鼠外周血白细胞、脾结节及骨髓细胞克隆形成数量增加；而秦秀军等^[9]发现富氢水改善了受照小鼠的脾脏指数、胸腺指数和骨髓有核细胞数量，提示富氢水可缓解电离辐射引起的损伤。本研究证实富氢水对电离辐射诱导的HSPCs损伤具有保护作用。

Liu等^[10]发现大鼠口服富氢水后5 min，H₂在血液、肝脏、肾脏、心脏、脾脏、肠道、肌肉、脑组织中的浓度达到最大并缓慢下降。因此，本研究在照射前5 min为小鼠灌喂富氢水。本研究将所有LSK和HPC均认为是HSPCs，而LSK有CD34-LSK和CD34+LSK两种类型，CD34+LSK主要负责辐射后短期的重建造血^[1]。HSPCs具有自我更新和定向分化潜能，作为储备可防止各种应激下造血系统的耗竭。电离辐射可刺激HSPCs进行增殖和分化以维持造血稳态，但是也会引起HSPCs自我更新和分化能力的损伤，导致持久性的骨髓损伤^[1]。本研究中，2 Gy的全身照射使小鼠骨髓中HPC和LSK细胞数量明显下降，而富氢水使受照小鼠骨髓中HPC、LSK、CD34+LSK细胞数量显著升高，抑制了HSPCs的耗竭。CFU-GM是评价HSPCs体外增殖能力的一个指标，全身照射使小鼠骨髓细胞CFU-GM数量减少，而富氢水提高了受照小鼠HSPCs的增殖能力，结果与文献报道一致^[4]。另外，本研究首次发现富氢水可以明显提高骨髓移植后受体小鼠的嵌合率，增强受照HSPCs的移植重建能力，提示富氢水也可改善电离辐射诱导的长期骨髓损伤。

为探索富氢水保护HSPCs的机制，本研究检测了骨髓LSK细胞的ROS水平和细胞凋亡情况。电离辐射可引起水的解离，产生过量的ROS，如羟自由基、超氧阴离子、过氧化氢。研究已发现电离辐射会导致HSPCs的慢性氧化应激，其原因可能是电离辐射持续抑制细胞内SOD2、GPX1等抗氧化酶的表达^[11]，而造血微环境的改变可能也是辐射15 d后HSPCs内ROS持续偏高的原因之一^[1]。ROS在电离辐射诱导的HSPCs损伤中起着重要的作用，可诱导细胞DNA损伤、细胞凋亡和衰老，有研究报道，ROS还与电离辐射诱导的HSPCs的耗竭和自我更新能力的损伤有关^[11-13]。本研究中，全身照射使小鼠骨髓LSK细胞凋亡增加，而富氢水抑制了受照的LSK细胞的凋亡，可能有利于HSPCs数量和功能的恢复。全身照射还使小鼠骨髓LSK细胞ROS水平升高，富氢水有助于清除受照LSK细胞内的ROS，从而减少氧化应激、抑制ROS对HSPCs的损伤。富氢水的ROS清除作用可能与其抑制HSPCs的凋亡、促进HSPCs自我更新和移植重建能力的恢复有关。除了清除HSPCs内的ROS，富氢水可能还通过调节Keap1-Nrf2信号通路及细胞内抗氧化酶的活性等保护受照的HSPCs^[14]。目前本实验室正在对其分子机制进行深入研究中。

总之，本研究证实了富氢水对电离辐射诱导的HSPCs损伤具有保护作用，为其成为辐射防护剂提供了新的实验证据。本研究从富氢水对电离辐射诱导HSPCs损伤的角度说明其具有辐射防护作用，但这种保护作用的分子机制及其对骨髓微环境等其他方面的作用，尚需更深入的研究。