鼻咽癌是我国南方地区常见的恶性肿瘤之一，放射治疗是鼻咽癌的主要治疗手段。随着放疗设备的更新、放疗技术的发展以及综合治疗的应用，鼻咽癌的局部和区域控制率得到了提高，但远处转移下降不明显，是目前鼻咽癌治疗失败的主要原因，这在前期研究中均有报道^[1-2]。因此，寻找影响鼻咽癌侵袭转移的分子标志物，对鼻咽癌的预后判断及治疗有重要意义。本课题组前期研究发现，p53凋亡刺激蛋白抑制因子 (inhibitory member of the ASPP family，iASPP) 在鼻咽癌中的阳性表达率与患者的N分期呈正相关性，提示其表达水平有可能与鼻咽癌预后有关^[3]。本研究在此基础上，进一步扩大样本量，探讨iASPP在鼻咽癌中的表达及其与预后的关系，以期为临床个体化综合治疗提供预测因素。

1.临床资料：收集2012年1—12月在广西医科大学第一附属医院接受调强放射治疗 (IMRT) 的初治鼻咽癌患者。入组标准：经病理检查确诊为鼻咽癌，并有保存完好的鼻咽癌石蜡病理标本；尚未进行任何放疗、化疗等抗癌治疗者；年龄18~65岁；PS评分≤2；按照鼻咽癌 (2009 AJCC第7版) 分期为Ⅰ~Ⅳ_B期的患者；放疗前均行全身检查，无远处转移和其他肿瘤病史；放疗前血常规、肝肾功能等各项指标均无异常。排除标准：发生远处转移的患者；患其他恶性肿瘤者；曾接受过放疗或化疗等肿瘤相关治疗；放化疗禁忌证者，包括严重的感染或其他合并证如心肌梗死、严重的心率失常、严重的脑血管病、精神病和不可控制的糖尿病等；怀孕或哺乳期；因病情变化不能完成治疗者。符合纳入排除标准的病例共130例，患者的临床资料列于表 1。

2.放疗方法：所有患者均接受IMRT。具体方案：患者仰卧，用头颈肩热塑面罩固定，CT模拟定位，扫描范围从颅顶至锁骨头下2 cm，层厚3 mm，层距3 mm。CT图像传输到Pinnacle计划系统。根据国际辐射单位与测量委员会 (ICRU) 第50、62号报告，参照MRI在CT上逐层勾画鼻咽大体肿瘤体积 (gross tumor volume of the nasopharynx，GTV_nx)、颈部转移淋巴结 (GTV of the positive cervical lymph node，GTV_nd)、临床靶体积 (CTV) 和计划靶体积 (PTV) 以及周围危及器官 (OAR)。处方剂量：PTV_nx 70~72 Gy，PTV_nd 68~70 Gy，PTV1 62~64 Gy，PTV2 54~56 Gy，分31~33次照射，照射时间6~7周。常规切线野照射下颈和锁骨上区，50 Gy，25次。根据美国放疗肿瘤组织0225号文件要求，设定OAR限制剂量^[4]。

3.化疗方法：Ⅲ~Ⅳ_B期患者均予2~3个周期顺铂单药同步化疗，80~100 mg/m²第1天，第21天重复。

4.检测iASPP表达

(1) 标本来源：上述130例本院病理科存档的鼻咽癌组织蜡块。

(2) 主要试剂：兔抗人iASPP多克隆抗体购于北京博奥森生物技术有限公司 (bs-0284R)。免疫组织化学Supervision即用型二步法检测试剂盒购于上海长岛生物技术有限公司 (ZKSP-10446)。

(3) 检测方法：用免疫组织化学Supervision二步法检测鼻咽癌组织中iASPP的表达。严格按试剂盒说明书操作：蜡块按4 μm厚度切片，常规脱蜡水化。在pH 6.0的0.01 mol/L的柠檬酸盐缓冲液中煮沸热修复抗原，3% H₂O₂室温孵育15 min，非免疫血清封闭40 min，加一抗4℃孵育过夜，加Supervision鼠/兔-HRP广谱检测系统，室温下孵育20 min，DAB显色，苏木精复染，梯度乙醇 (70%、80%、90%、无水乙醇) 脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

(4) 阳性结果判定：iASPP蛋白阳性定位于细胞质和细胞核，以细胞质或细胞核出现棕黄色显色为iASPP蛋白表达阳性。每张病理切片通过光学显微镜放大400倍，随机选取5个视野进行iASPP阳性细胞结果判定。着色强度的判定：不着色为0分，淡黄色为1分，褐色为2分，深棕色为3分。阳性细胞百分比的判断： < 5%为0分，5%~25%为1分，26%~50%为2分，51%~75%为3分，> 75%为4分。两部分的得分之和为最后的得分 (0~1分为阴性，2分为弱阳性，3~5分为阳性，6~7分为强阳性)。

5.疗效和随访：本研究主要观察指标是无进展生存 (progress-free survival, PFS)，次要观察指标是局部无复发生存 (local recurrence-free survival, LRFS)、区域无复发生存 (regional recurrence-free survival, RRFS)、无远处转移生存 (distant metastasis-free survival, DMFS) 和总生存 (overall survival, OS)。PFS是从诊断第1日到出现疾病进展 (复发或转移) 或死亡或最后一次随访为止；DMFS是从诊断第1日到出现远处转移或最后一次随访为止；OS是从诊断第1日到死亡或最后一次随访为止。治疗结束后3个月记录肿瘤消退情况和急性不良反应情况；治疗结束2年内每3个月随访1次，第3年后每6个月随访1次，随访内容包括完善的体检、血液学检查、胸片、腹部B超和纤维鼻咽镜；每6个月复查1次鼻咽MRI。有局部或颈淋巴结复发者均需病理学诊断。有远处转移可疑者进行胸、腹部CT和骨同位素扫描。急性和晚期不良反应按美国放疗肿瘤组织或欧洲癌症研究与治疗组织标准进行评价。

6.统计学处理：采用SPSS 17.0进行统计分析。计数资料比较用卡方检验，Kaplan-Meier方法计算局部无复发生存率、区域无复发生存率、无远处转移率、无进展生存率和总生存率。单因素分析采用Log-rank法，多因素分析采用Cox回归模型。P < 0.05为差异有统计学意义。

1. iASPP蛋白表达及其与临床病理因素的关系：130例鼻咽癌组织标本中，iASPP阳性表达86例 (66.2%)，见图 1，阴性表达44例 (33.8%)。不同年龄、性别、病理分型和T分期患者的iASPP阳性表达率比较，差异均无统计学意义 (P > 0.05)。不同N分期和临床分期患者的iASPP阳性表达率比较，差异均有统计学意义 (χ²=7.565、4.947，P < 0.05)，见表 1。

图 1 iASPP在鼻咽癌组织中的表达情况免疫组织化学法×400 注：iASPP在鼻咽癌组织的胞核和胞质中均有阳性表达(箭头所示) Figure 1 The expression of iASPP in nasopharyngeal carcinoma tissues immunohistochemistry ×400

表 1(Table 1)

表 1 iASPP表达水平与临床病理因素间的关系 Table 1 Relationship between the expression of iASPP and clinicopathological features 项目 例数 阳性表达 (例) 阴性表达 (例) χ2值 P值 年龄 1.532 0.216   ≤46岁  66  47  19   > 46岁  64  39  25 性别 0.472 0.492   男 105  68  37   女  25  18   7 病理分型 1.589 0.452   Ⅰ   6   4   2   Ⅱ   5   2   3   Ⅲ 119 80 39 T分期 2.769 0.096   T1~2  25  13  12   T3~4 105  73  32 N分期 7.565 0.006   N0~1  39  19  20   N2~3  91  67  24 临床分期 4.947 0.026   Ⅰ~Ⅱ   5   1   4   Ⅲ~Ⅳ 125  85  40

表 1 iASPP表达水平与临床病理因素间的关系 Table 1 Relationship between the expression of iASPP and clinicopathological features

2. iASPP蛋白表达对近期疗效的影响：治疗后3个月，130例鼻咽癌患者总体有效率100%，其中完全缓解 (CR) 117例 (90.0%)，部分缓解 (PR) 13例 (10.0%)。iASPP阳性表达者鼻咽部病灶CR率90.7%，阴性表达者CR率为88.6%，两者差异无统计学意义 (P > 0.05)。iASPP阳性表达者颈部淋巴结CR率84.9%，阴性表达者CR率为84.1%，两者差异无统计学意义 (P > 0.05)，见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 iASPP不同表达水平近期疗效比较 Table 2 Short-term effects of patients with different expression of iASPP iASPP 鼻咽部病灶 颈部淋巴结 CR PR CR PR 阳性表达 78 8 73 13 阴性表达 39 5 37 7   注：CR.完全缓解；PR.部分缓解

表 2 iASPP不同表达水平近期疗效比较 Table 2 Short-term effects of patients with different expression of iASPP

3. iASPP蛋白表达的预后价值：随访至2016年3月1日，中位随访时间41.4个月 (14~49个月)，随访率93.1%。以性别、年龄、病理分型、T分期、N分期、临床分期和iASPP表达水平等为因素进行预后分析。单因素分析显示，iASPP阳性表达患者3年DMFS和PFS均低于iASPP阴性表达者，分别为82.6%、95.4% (χ²=4.335，P=0.037) 和74.4%、93.1% (χ²=6.64，P=0.010)。iASPP表达水平不同者3年LRFS、RRFS和OS差异均无统计学意义，分别为89.3% vs. 97.7% (P=0.091)、91.6% vs. 100% (P=0.051) 和84.9% vs. 95.5% ( P > 0.05)。此外，N_2~3患者3年DMFS、PFS和OS均低于N_0~1患者 (P < 0.05)，见表 3。进一步行多因素分析发现，iASPP表达水平及N分期是影响PFS的独立预后因素 (表 4，图 2，3)。

表 3(Table 3)

表 3 患者治疗后3年单因素预后分析结果 (%) Table 3 Effect of prognostic factors on 3-year survival in univariate analysis (%) 因素 LRFS RRFS DMFS PFS OS 性别   男  91.3  94.2  86.9  79.4  88.8   女  92.4  95.7  87.0  87.0  87.0 年龄   ≤46  93.8  96.9  89.4  83.3  92.4   >46  90.5  92.1  84.4  78.1  84.4 病理分型   Ⅰ 100.0 100.0  80.0  80.0 100.0   Ⅱ 100.0 100.0  83.3  83.3  83.3   Ⅲ  91.5  94.0  87.4  80.6  88.2 T分期   T1~2 100.0 100.0  84.0  84.0  92.0   T3~4  90.4  93.2  87.6  79.9  87.6 N分期   N0~1  97.4 100.0 100.0a  97.4c 100.0e   N2~3  89.9  92.0  81.3a  73.5c  83.5e 临床分期   Ⅰ~Ⅱ 100.0 100.0  83.3  83.3 100.0   Ⅲ~Ⅳ  91.9  94.3  87.1  80.6  88.0 iASPP表达   阳性  89.3  91.6  82.6b  74.4d  84.9   阴性  97.7 100.0  95.4b  93.1d  95.5   注：LRFS.局部无复发生存；RRFS.区域无复发生存；DMFS.无远处转移生存；PFS.无进展生存；OS.总生存。同一指标两亚组间比较，aχ2=8.058，P< 0.05；bχ2=4.335，P< 0.05；cχ2=9.554，P< 0.05；dχ2=6.64，P< 0.05；eχ2=6.987，P< 0.05

表 3 患者治疗后3年单因素预后分析结果 (%) Table 3 Effect of prognostic factors on 3-year survival in univariate analysis (%)

表 4(Table 4)

表 4 多因素预后分析结果 Table 4 Results of multivariate prognostic analysis 终检值 预后因素 B值 SE值 χ2值 P值 无进展生存 iASPP表达 1.301 0.625 4.336 0.037 N分期 2.401 1.050 5.228 0.022

表 4 多因素预后分析结果 Table 4 Results of multivariate prognostic analysis

图 2 iASPP表达水平不同者3年无进展生存率比较 Figure 2 The 3 year-PFS of patients with different expression of iASPP

图 3 N0-1和N2-3患者3年无进展生存率比较 Figure 3 The 3 year-PFS of patients with N0-1 and with N2-3

iASPP是2003年发现的一个重要的蛋白质家族ASPP (ankyrin-repeat, SH3-domain and proline rich domain protein) 即p53凋亡刺激蛋白 (apoptosis stimulating protein of p53) 家族中的成员之一，由PPP1R13L基因编码，全长由828个氨基酸组成，存在于细胞质和细胞核。与其他两个家族成员 (ASPPl和ASPP2) 不同的是，iASPP能竞争性地与p53结合，抑制p53基因诱导的细胞凋亡，是ASPP家族中唯一的抑制蛋白，被认为是一种新的癌基因。

iASPP在多种恶性肿瘤中均呈现高表达，而在正常组织中低表达或不表达。例如在急性白血病患者细胞中，iASPP表达水平明显高于完全缓解期患者和健康人^[5]。Liu等^[6]在对109例头颈鳞癌标本进行检测后发现iASPP蛋白和mRNA在头颈鳞癌组织中的表达显著高于癌旁黏膜组织。Kong等^[7]研究显示，在FIGO Ⅰ_A2~Ⅱ_A宫颈腺癌中iASPP蛋白表达较癌旁正常组织高2.45倍，mRNA高2.62倍。同样，在食管癌^[8]、乳腺癌^[9]、子宫内膜癌^[10]等组织中均显示iASPP高表达。但在鼻咽癌组织中的表达及作用如何，还不清楚。本研究发现在大部分鼻咽癌患者中 (86/130例，66.2%) iASPP蛋白呈阳性表达，并且随着N分期和临床分期的增高，iASPP蛋白阳性表达越多，提示iASPP阳性表达可能在鼻咽癌的发生及进展中发挥着非常重要的作用，与上述研究结果相似。

iASPP作为一种新的癌基因蛋白可促进肿瘤细胞增殖，抑制细胞凋亡，并与肿瘤的浸润转移等密切相关，从而影响预后。Chen等^[11]研究发现，口腔舌鳞癌细胞中iASPP表达升高与肿瘤分化差及淋巴结转移有关，而降低iASPP的表达可导致癌细胞G₀/G₁期阻滞，细胞凋亡减少，增殖能力下降。Liu等^[10]用免疫组织化学法检测发现子宫内膜腺癌中iASPP表达明显增加，并与肿瘤浸润及淋巴结转移密切相关。Cao等^[12]分析149例早期宫颈鳞癌 (FIGO Ⅰ_B1~Ⅱ_A期) 中iASPP的表达及其与临床病理因素间的关系，结果显示iASPP在宫颈鳞癌中表达升高，并与肿瘤分期、深间质浸润、盆腔淋巴结转移等密切相关，iASPP高表达者5年OS和DFS明显低于iASPP低表达者，分别为73% vs. 96% (P=0.019) 和62% vs. 86% (P=0.022)，进一步行多因素分析显示，iASPP表达是宫颈癌总生存率的独立预后因素。Kong等^[7]研究显示，在早期宫颈腺癌组织中iASPP高表达者5年OS和DFS明显低于iASPP低表达者 (OS：54.3% vs. 95.0%，P=0.019；DFS：40.0% vs. 85.0%，P < 0.001)。进一步行多因素分析也同样证实了iASPP表达是影响早期宫颈腺癌生存的独立预后因素。本研究结果显示，鼻咽癌患者的近期疗效与iASPP表达水平无关，然而iASPP阳性表达者3年DMFS和PFS均明显低于iASPP阴性表达者，进一步行多因素分析发现iASPP表达是影响PFS的独立预后因素。

综上所述，iASPP在鼻咽癌组织中的表达水平与患者的N分期和临床分期有关，它有可能成为鼻咽癌预后的一个预测指标。本研究仍存在一些不足之处：入选的病例数不够多；随访时间仅3年，而文献大多报道5年的随访结果；免疫组织化学检测存在人为因素的影响，使研究结果存在一定的偏倚。因此，iASPP对鼻咽癌预后的影响仍有待进一步深入研究。