宫颈癌是女性第三大恶性肿瘤^[1]，其放射治疗中存在的放射不敏感，使宫颈癌治疗效果不令人满意，所以寻找宫颈癌放射敏感性靶标是近年来众多学者关注的热点问题。

IER5(immediate early response 5) 是早期反应基因之一，基因芯片结果发现放射损伤诱导其表达^[2], 是放射损伤暴露剂量相关的DNA损伤修复蛋白生物标记物^[3]。本研究组前期经实时定量PCR方法验证放射损伤后IER5基因在mRNA水平上表达发生变化^[4]。有文献报道，IER5在宫颈癌组织中较正常宫颈组织表达增加了89.3倍^[5]。IER5是否可作为宫颈癌治疗新靶标及其作用机制还有待进一步阐明。本研究拟在蛋白水平上验证IER5放射后变化，并筛选出IER5在放射损伤后的相互作用蛋白，为进一步研究放射损伤后的作用机制奠定基础。

1.主要试剂与仪器：ANTI-FLAG M2 Affinity Gel、Flag抗体、0.25%胰蛋白酶 (美国Sigma-aldrich公司)，Lipofectamine2000 (美国Invitrogen公司)，M-PER蛋白裂解液 (美国Thermo公司)，DMEM、胎牛血清 (美国Hyclone公司)，IP裂解液NETN100 (本实验室配置：Tris-HCL pH=8.0, 20 mmol/L，EDTA 1 mmol/L，NaCl 100 mmol/L，NP40 0.5%)，蛋白酶抑制剂混合片剂cocktail (瑞士Roche公司)，IER5多克隆抗体 (美国Abcam公司)，proteinA/G plus-agarose、PARP1抗体、Histone H1抗体 (美国Santa Cruz公司)，GAPDH单克隆抗体、HRP标记的山羊抗鼠二抗、HRP标记的兔抗山羊二抗 (北京中杉金桥公司)，细胞核蛋白与细胞质蛋白抽提试剂盒 (上海碧云天生物技术有限公司)。

2.细胞培养：HeLa细胞及人肾上皮细胞293T (军事医学科学院放射与辐射医学研究所实验室) 使用DMEM培养基培养，含10%胎牛血清，1%青霉素和链霉素，置于5%CO₂，37 ℃恒温培养箱。使用0.25%胰蛋白酶消化分离，进行传代。

3.细胞转染：取对数期293T、HeLa细胞转染，密度70%~90%，转染前换为双无培养基，100 mm培养皿转染8 μg质粒3×Flag\|IER5，质粒与脂质体 (质量：体积=1：2) 分别与双无培养基作用5 min，混合后继续作用20 min，加入培养皿中，十字摇匀，6 h后换正常培养基。转染36~48 h后照射并收集细胞，两种细胞均分别设照射组，将处理后未照射细胞分别设对照组。验证实验使用HeLa细胞。

4.细胞照射：采用军事医学科学院辐射中心⁶⁰Co γ辐射源进行单次照射，照射总剂量4 Gy，吸收剂量率为91.54 cGy/min，源靶距为3 m。

5.免疫共沉淀：293T细胞转染36 h后进行4 Gy照射，照后1 h收集样品。预冷PBS洗2遍，PBS吹落混匀细胞，4 ℃，3 000 r/min，离心半径7 cm, 离心3 min，弃上清，每组加入NETN100裂解液6 ml+100×cocktail 60 μl冰上裂解15 min，4 ℃ 12 000 r/min，离心半径7 cm, 离心10 min，取上清，各留100 μl做细胞总蛋白input；于proteinA/G plus-agarose预吸附混悬1.5 h，4 ℃ 2 000 r/min，离心半径7 cm, 离心1 min，取上清，于anti-flag-beads混悬4 h，4 ℃ 2 000 r/min，离心半径7 cm, 离心1 min，弃上清，NETN100混悬清洗3×8 min，最后加100 μl NETN100，与6×上样缓冲液混匀后沸水煮10 min，-80 ℃保存。

6.免疫印迹 (Western blot)：HeLa细胞照后1、2、4、6、8、12、24、48 h收集细胞于离心管中，加入蛋白裂解液100 μl，冰上裂解10 min，4 ℃ 12 000 r/min，离心半径7 cm，离心10 min，取上清并测浓度；另取受照后0.5、2、8 h细胞，抽取细胞核内蛋白，方法参照试剂盒说明书。根据蛋白浓度电泳上样100 μg；质谱样品细胞总蛋白input及IP各取8 μl上样。10%SDS-PAGE胶恒压电泳，100 V电转膜90 min，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，孵育，PARP1抗体、Flag抗体、IER5抗体、GAPDH抗体、Histone H1抗体4 ℃过夜，TBST洗一抗，10 min×3次，室温孵育相应二抗1 h，TBST洗10 min×3次，化学发光法显影。

7.数据处理：蛋白定量分析使用Image J软件进行分析，所有实验独立重复至少3次，质谱鉴定的蛋白质用在线分析软件DAVID进行功能注释和分析。

1. HeLa细胞受照后IER5蛋白表达量的变化：结果显示，细胞受照后，IER5蛋白表达上调，于照后4 h蛋白水平开始增加，12 h蛋白水平至高峰，蛋白表达增至2倍，并持续至48 h，见图 1。受照后，核内IER5蛋白有增多趋势，照后0.5 h核内IER5蛋白即有升高，见图 2。

图 1 Western blot检测HeLa细胞4 Gy照射后不同时间点IER5蛋白的表达 Figure 1 Western blot analysis of IER5 protein expression in Hela cells after 4 Gy irradiation

图 2 Western blot检测HeLa细胞4 Gy照射后不同时间点细胞核内IER5蛋白表达 Figure 2 Western blot analysis of IER5 protein in the nucleus of HeLa cells after 4 Gy irradiation

2. Western blot检测转染3×Flag-IER5融合蛋白的表达：使用p-CMV载体构建3×Flag-IER5融合表达质粒，瞬时转染至HeLa细胞，48 h后Western blot检测结果见图 3，3×Flag-IER5载体成功表达，标签抗体及目的抗体均能识别。

图 3 Western blot检测HeLa细胞3×Flag-IER5融合蛋白表达 Figure 3 Western blot analysis of 3×Flag-IER5 protein

3.质谱结果及筛选：免疫共沉淀复合物SDS-PAGE分离并染色后，条带切胶送质谱分析。分析质谱得出数据，照射组检测出374个蛋白，对照组检测出256个蛋白，两组间比较，匹配肽链数≥2的差异蛋白有41个。使用DAVID在线工具进行蛋白功能分类，照射组中与DNA结合、代谢、损伤修复相关的蛋白包括10个，见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 质谱分析联合DAVID在线分析软件筛选出与IER5相互作用蛋白 Table 1 MS and DAVID online datebase analysis of IER5 interacting proteins 蛋白质编号 蛋白质名称 相对分子质量 得分 匹配肽链数目 gi|7582386 B淋巴细胞瘤2相关转录因子 100 270 435 17 gi|1806048 DNA解旋酶Ⅱ 142 100 433 18 gi|178152 聚ADP核糖基化聚合酶  64 289 103  3 gi|460771 核内不均一核糖核蛋白E1  38 015  84  3 gi|4503841 X射线交叉互补修复蛋白6  70 084  78  3 gi|31645 3-磷酸甘油醛脱氢酶  36 202  68  3 gi|35053 尿嘧啶DNA糖基化酶  35 698  63  3 gi|1575536 无义转录稳定调节因子 124 351  51  2 gi|5881961 外切核酸酶2 109 437  48  2 gi|386772 组蛋白H3 15 352  36  2

表 1 质谱分析联合DAVID在线分析软件筛选出与IER5相互作用蛋白 Table 1 MS and DAVID online datebase analysis of IER5 interacting proteins

4.质谱结果验证：根据质谱分析的结果，选择PARP1蛋白进行质谱样品验证，图 4结果显示，PARP1与IER5在细胞发生放射损伤后存在明显的相互作用关系，对照组也同样检测到PARP1(考虑可能对照组PARP1蛋白量少而质谱未能检测出)，照射后相互作用蛋白增多。同时, 本实验也采用HeLa细胞重复了上述实验，验证了此结果，见图 5。

图 4 Western blot检测IER5免疫共沉淀复合物中的PARP1蛋白 Figure 4 Western blot analysis of IER5 and PARP1 interaction

图 5 HeLa细胞验证IER5免疫共沉淀复合物中的PARP1蛋白 Figure 5 Analysis of IER5 and PARP1 interaction in HeLa cells

早期研究提示，IER5基因可能在肿瘤增殖或患者预后、细胞代谢、细胞有丝分裂中发挥重要的作用^[6-8]。近年来的研究进一步表明，IER5基因作为DNA损伤相关基因，可作为接受放射损伤后剂量评估的生物标记物，但其参与的机制却未阐明。

本研究组前期通过RT-PCR方法验证了放射损伤后IER5基因在HeLa、AHH-1细胞mRNA水平随剂量、时间变化而波动，本实验以HeLa细胞作为研究对象，验证了IER5在蛋白水平上放射损伤后表达变化，其表达于照后4 h开始增加，12 h出现高峰，并持续至48 h，结果与前期研究结果一致。目前，DNA是公认的电离辐射主要靶目标，细胞受照后的大部分生物学改变理论上是与DNA损伤相关，通过一系列信号传导而进行DNA损伤修复、周期调控或者凋亡^[4]。有研究显示，IER5蛋白于细胞质和细胞核内均有分布^[9]，而本研究结果观察到，在放射损伤后IER5蛋白在细胞核内有增加趋势，所以推测放射损伤后细胞核内IER5蛋白发生变化，可能参与DNA损伤修复的某一过程，同时也指引了今后深入研究的方向。

本实验进一步采用免疫共沉淀方法富集到IER5相互作用蛋白，通过质谱分析及DAVID在线蛋白质功能注释，共筛选出10个与DNA代谢、损伤修复相关功能蛋白，比如B淋巴细胞瘤2相关转录因子参与Bcl-2家族蛋白转录调控^[10]，DNA解旋酶Ⅱ参与DNA解螺旋过程^[11]，核内不均一核糖核蛋白E1在DNA复制及调控转录翻译都有作用^[12]，X射线交叉互补修复蛋白6，即KU70蛋白，是DNA双链断裂非同源末端连接修复通路中的重要因子^[13]，尿嘧啶DNA糖基化酶和3-磷酸甘油醛脱氢酶在细胞核内起尿嘧啶糖基化酶的作用^[14]，无义转录稳定调节因子和外切核酸酶2主要参与mRNA的调控^[15]，组蛋白H3是维持染色体结构重要的核蛋白^[16]。其中，最感兴趣的是PARP1蛋白，有研究证实，PARP1是催化多聚ADP核糖化的蛋白酶，在基因转录、DNA损伤修复、细胞凋亡等中起着重要的作用^[17]。更为通俗的理解是PARP1参与到细胞众多的应激应答过程中，在DNA损伤修复方面，PARP1主要在DNA单链断裂修复或碱基切除修复途径中发挥作用，但PARP1活性被抑制后会因DNA单链损伤未修复而后发生DNA复制，造成DNA双链损伤。尤其在BRCA1突变的肿瘤中更加明显，因无法对DNA双链断裂进行修复，其对PARP1抑制剂更为敏感，DNA损伤程度累积及异常的DNA末端连接，而导致细胞生长阻滞及凋亡^[18]。在女性恶性肿瘤前两位的乳腺癌及卵巢癌的治疗中，PARP1的抑制剂已成功用于临床^[19-20]。本研究通过质谱分析并已初步验证IER5与PARP1存在相互作用，而且放射损伤后两者相互作用增强，因此，设想在宫颈癌中高表达的IER5与PARP1存在相互作用，能否在宫颈癌的治疗中有新的治疗突破点。接下来将继续验证两者相互作用方式、时效关系及功能影响等，争取有更深一层的研究突破和进展。