放射治疗在脑部原发及转移肿瘤的治疗中起着不可替代的作用。因此, 与治疗相关的远期不良反应愈来愈受关注。其中, 颅脑放疗后认知功能障碍的发生率逐年升高, 严重影响了患者的生活质量, 已成为目前研究的重点^[1-3]。研究表明, 大脑海马区神经发生 (neurogenesis) 在改变神经可塑性过程中起关键作用^[4-7]。但是到目前为止, 电离辐射导致神经发生损伤的发病机制仍不清楚。

酪氨酸激酶TrkA作为神经生长因子 (NGF) 的下游信号通路之一, 改变两者的结合信号通路能有效改变神经凋亡及神经发生^[8-9]。而TrkB作为脑源性神经因子 (BDNF) 的下游信号通路之一, 两者结合可有效激活ERK1/2、AKT信号, 发生级联相关反应, 能够改变细胞的存活^[10-12]。因此, 本研究采用高尔基 (Giolgi) 染色、Western blot、RT-PCR技术研究全脑照射对大鼠海马神经发生及TrkA、TrkB蛋白、mRNA表达的影响, 探讨TrkA、TrkB在放射性神经发生损伤中的作用。

1.试剂:兔抗TrkA、兔抗TrkB (英国Abcam公司), FITC标记山羊抗兔IgG (H+)(江苏碧云天生物技术研究所), FD Rapid GolgiStain^TMKit (美国FD NeuroTechnologies公司), 反转录试剂盒 (美国Thermo公司)。

2.动物分组及照射条件:56只21 d龄SPF级健康雄性SD大鼠 (苏州大学动物实验中心提供, 合格证号:No.201507460), 体重 (50±10) g, 按照随机数字表法分为照射组和健康对照组, 每组28只, 实验动物操作均经过苏州大学实验动物伦理委员会通过。照射组大鼠经3.6%水合氯醛 (360 mg/kg) 腹腔麻醉后, 将大鼠俯卧摆位于治疗床上, 并置于2 cm×3.5 cm特制铅模下, 采用德国西门子公司直线加速器产生的4 MeV电子线进行10 Gy单次全脑照射。照射剂量率为210~220 cGy/min, 源皮距为95 cm, 电子线透过铅模照射孔到达大鼠头部, 铅模上有射孔8个, 每次可同时照射大鼠8只。照射野前界为双眼后眦连线, 后界为双耳后连线, 左右露空, 用铅块遮盖照射野内大鼠眼睛及其他部位。健康对照组大鼠经腹腔麻醉后置于相同照射环境下, 给予0 Gy照射。闭路电视监控过程, 照射结束待其苏醒后分笼饲养。

3. Western blot检测:大鼠经3.6%水合氯醛 (360 mg/kg) 腹腔麻醉后, 分离海马组织, 裂解液裂解后12 000×g离心10 min, 取上清, BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度, 变性, -20℃储存, 按每空上样量30 μg进行SDS-PAGE电泳, 300 mA恒流转膜90 min, 5%脱脂奶粉封闭1 h。一抗4℃孵育过夜 (TrkA 1：2 000和TrkB 1：2 000), 用三 (羟甲基) 氨基甲烷-盐酸缓冲盐溶液洗膜15 min ×3次, 加羊抗兔IgG (1：2 000), 37℃孵育1 h后, 用TBST洗膜5 min×3次。ECL显色试剂盒显影。以上实验重复3次。

4.RT-PCR:提取大鼠海马组织RNA, 应用反转录试剂盒反转录合成cDNA, 引物设计由上海生工生物科技有限公司完成 (TrkA:正义CTGACCAATGAGACCATGCGG, 反义AGAAGGAGACAGGGATGGGGT; TrkB:正义TGGAGGAAGGGAAGTCTGTG, 反义CCTGTGTGTGGCTTGTTTCA)。SYBR Green PCR Master Mix进行实时定量RT-PCR扩增, 以GAPDH作为内参参照, 按照下述公式计算不同处理组基因的相对表达量:基因相对表达量=2^{-ΔΔCT_样品-ΔCT_对照}。

5.高尔基染色:照射后1个月, 大鼠经3.6%水合氯醛 (360 mg/kg) 腹腔麻醉后, 分离海马组织, 按试剂盒说明置于室温提前混合好的A液和B液中, 14 d, 移入C液中, 24 h后换液, 2~7 d后行冰冻切片, 将片子用双蒸水洗涤两遍, 后放入D液和E液各5 ml以及15 ml双蒸水, 10~15 min后再用双蒸水洗涤两遍, 后行乙醇梯度脱水, 二甲苯透明, 树胶封片。

6.免疫荧光染色:照射后1个月, 大鼠经3.6%水合氯醛 (360 mg/kg) 腹腔麻醉后, 相继用磷酸盐缓冲液 (PBS)、4%多聚甲醛溶液行心脏灌注。取出脑组织, 置入4%多聚甲醛溶液中进行固定, 再经15%、30%蔗糖溶液梯度脱水后冷冻, 切片, 厚度为30 μm。每6张连续的脑片中选取1张进行免疫荧光染色, 切片经PBS漂洗3次, 胎牛血清封闭2 h, 一抗孵育。24 h后脑片经PBS漂洗3次, 二抗孵育1 h后贴片观察。所用一抗为兔抗DCX, 二抗为Alexa Flour 488山羊抗兔。

7.图像采集与分析:使用正置显微镜观察 (德国Leica公司DM500型) 采集照片。采集的照片用Image J进行树突棘形态以及数量的观察。

8.统计学处理:数据以x±s表示, 用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析。经正态性检验符合正态分布, 同一时间点两组间比较采用独立样本t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

1.全脑照射后神经元增殖变化:全脑照射后神经元增殖变化情况见图 1。全脑照射后1个月, 照射组与健康对照组相比, 双皮质素 (DCX) 数量明显减少 (t=6.49, P < 0.05)。

图 1 全脑照射后照射组 (10 Gy) 与健康对照组 (0 Gy) 神经元增殖的变化情况  免疫荧光染色×40 Figure 1 The proliferation of neurons between irradiation group (10 Gy) and control group (0 Gy) Immunostaining image ×40

2.全脑照射后树突棘变化:全脑照射后树突棘变化情况见图 2。全脑照射后1个月, 照射组与健康对照组相比树突棘数量明显减少, 树突棘形态明显变小。

图 2 全脑照射后照射组 (10 Gy) 与健康对照组 (0 Gy)  树突棘变化对比×100 Figure 2 Morphological changes of dendritic spines between irradiation group (10 Gy) and control group (0 Gy) after whole brain irradiation Image ×100

3.TrkA蛋白及mRNA变化情况:全脑照射后各时间点TrkA蛋白水平检测见图 3。全脑照射后1、3 d, 2周、1个月, 照射组与对照组相比, 蛋白水平分别增加了34%、32%、31%、28%, 差异均有统计学意义 (t=2.64、3.06、4.80、2.64, P < 0.05), 见表 1。全脑照射后1、3 d, 2周、1个月, 照射组与健康对照组相比mRNA水平分别增加了40%、27%、47%、28%, 差异均有统计学意义 (t=4.57、3.06、5.39、5.86, P < 0.05), 见表 1。

图 3 全脑照射后不同时间两组大鼠海马组织TrkA蛋白表达 Figure 3 Expressions of TrkA protein in hippocampus at different time after whole brain irradiation

表 1(Table 1)

表 1 全脑照射后不同时间大鼠海马组织TrkA、TrkB蛋白及mRNA的表达 (x±s) Table 1 Expressions of TrkA and TrkB proteins and mRNAs in hippocampus at different time after whole brain irradiation (x±s) 组别 只数 时间 TrkA蛋白 TrkA-mRNA TrkB蛋白 TrkB-mRNA 健康对照组 20 1 d 0.97±0.16 1.00±0.00 1.26±0.08 1.00±0.00 3 d 1.23±0.15 1.00±0.00 1.79±0.56 1.00±0.00 2周 0.65±0.07 1.00±0.00 0.94±0.17 1.00±0.00 1个月 0.89±0.06 1.00±0.00 1.38±0.15 1.00±0.00 照射组 20 1 d 1.30±0.03a 1.40±0.15a 0.95±0.11a 0.38±0.07a 3 d 1.62±0.42b 1.27±0.16b 1.03±0.06b 0.64±0.06b 2周 0.86±0.07c 1.48±0.15c 0.66±0.11c 0.67±0.12c 1个月 1.14±0.22d 1.28±0.08d 0.79±0.27d 0.74±0.28   注:与健康对照组照射后同时间比较, at=2.64、4.57、4.59、14.87, P < 0.05;bt=3.06、3.06、3.06、11.69, P < 0.05;ct=4.80、5.39、2.81、4.98, P < 0.05;dt=2.64、5.86、2.57, P < 0.05

表 1 全脑照射后不同时间大鼠海马组织TrkA、TrkB蛋白及mRNA的表达 (x±s) Table 1 Expressions of TrkA and TrkB proteins and mRNAs in hippocampus at different time after whole brain irradiation (x±s)

4.TrkB蛋白及mRNA变化情况:全脑照射后各时间点TrkB蛋白水平检测见图 4。全脑照射后1、3 d, 2周、1个月, 照射组和对照组相比蛋白水平分别降低了25%、43%、30%、38%, 差异均有统计学意义 (t=4.59、3.06、2.81、2.57, P < 0.05), 见表 1。全脑照射后1、3 d、2周, 照射组与健康对照组相比mRNA水平分别下降了62%、36%、33%, 差异均有统计学意义 (t=14.87、11.69、4.98, P < 0.05), 照射后1个月, 照射组与对照组相比mRNA水平下降了26%, 但差异无统计学意义 (P > 0.05), 见表 1。

图 4 全脑照射后不同时间大鼠海马组织TrkB蛋白表达水平 Figure 4 Expressions of TrkB protein level in hippocampus at different time after whole brain irradiation

TrkA, 即跨膜络氨酸激酶A, 作为NGF下游信号通路分子, 与细胞存活密切相关, NGF通过TrkA影响其下游PI3K/AKT及MEK/ERK, 产生级联反应, 干预神经元凋亡, 影响神经发生^[9]。TrkB, 即原肌球蛋白受体激酶B, 作为BDNF下游信号通路分子, 与轴突再生密切相关, 研究表明, TrkB基因敲除大鼠, 其树突再生明显受损, 从而影响认知及学习功能^[13]。本实验通过给予SD大鼠10 Gy全脑照射, 成功建立放射脑损伤模型。全脑照射导致海马齿状回神经发生减弱在许多研究中得以证实^[14]。神经发生主要发生在侧脑室下区 (SVZ) 和海马齿状回颗粒细胞下层 (SGZ)^[15]。DCX是脑组织特异性微管相关蛋白, 其功能促进微管蛋白的聚合, 主要表达在处于迁移状态神经元前体细胞及年幼的神经元, 海马齿状回DCX阳性细胞数目与细胞增殖水平具有一定的相关性, DCX可以作为正常或疾病状态下定量研究神经发生水平的合适指标^[16]。高尔基染色是研究神经元正常和非正常形态的最有效方法之一, 能够发现神经树突和树突棘微小的改变。

本研究通过对NGF以及BDNF下游的TrkA、TrkB进行蛋白以及mRNA水平研究, 探讨全脑照射后TrkA/TrkB在大鼠海马神经发生障碍中的作用机制。本组的前期研究中, 发现BDNF/TrkB信号通路在全脑照射后认知功能的改变中起重要作用, 提高BDNF/TrkB的表达能够有效改善认知以及学习功能^[17]。在TrkA/TrkB之前的研究中, 发现其在阿尔茨海默病中扮演重要的角色, TrkA的改变代表上游NGF以及NGF前体的改变, 从而影响胆碱能神经元的退行性改变, 引起认知和学习记忆功能的改变^[9,18]。

本研究发现在全脑照射后的1个月内, TrkA呈现明显的上升趋势, 而TrkB呈现明显的下降趋势, 在照后1个月时, TrkB的蛋白水平明显下降, 而mRNA水平也下降, 但差异无统计学意义, 可能与mRNA与蛋白变化不同步有关, 转录与翻译的水平不一致, 但整体上都呈下降趋势, 树突棘的形态数量与对照组明显改变, 推测两者在全脑照射后急性期海马的神经发生中存在着某种联系, 共同对全脑照射后海马神经发生障碍产生作用, 但其具体的机制仍需进一步研究。有报道证实, 通过小分子蛋白影响TrkA/TrkB受体的表达, 能够改善神经凋亡以及认知功能障碍, 可能通过BDNF/TrkB以及NGF/TrkA信号通路影响神经元的退行性改变^[9,19-20]。

综上所述, 本研究发现了TrkA/TrkB在全脑照射后的不同变化情况, 为全脑照射导致的认知以及学习功能障碍研究提供了新的依据, 但仍有许多问题有待进一步研究, 包括如何干预TrkA/TrkB的表达, 从而改变认知和学习功能, 为临床研究提供实验基础。尽管如此, 该实验发现了TrkA/TrkB在全脑照射后的不同变化情况, 为以后的研究提供了参考。