随着核电发展及核恐怖袭击可能性增加，核事故应急工作日益得到重视，大规模辐射事件发生时的快速、高通量剂量评估是核事故医学应急工作首先需要解决的问题之一。双着丝粒 (dic) 染色体分析是生物剂量估算的金标准，但极其耗费人工。20世纪90年代，随着电动显微镜、计算机图像分析技术的进步，出现商品化的可以进行染色体中期分裂相自动寻找、拍摄、dic自动分析的遗传工作站。Vaurijoux等^[1]报道了通过建立以遗传工作站对dic认知能力为基础的“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”，实现了dic染色体分析生物剂量估算自动化。Gruel等^[2]报道dic染色体自动分析法可用于大规模核辐射事件发生时的快速、高通量剂量评估及人员分流。本研究试图基于遗传工作站，探讨建立“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”，实现dic染色体分析生物剂量估算自动化，进而实现大规模核辐射事件发生时的快速、高通量剂量评估及人员分流。该项研究国内尚未见报道。

1.对象与血样采集：取3名健康志愿者外周血，肝素锂抗凝，用于剂量-效应曲线制备；另取20名健康志愿者外周血，肝素锂抗凝，用于剂量-效应曲线验证。

2.照射条件：外周血在37℃±0.5℃水浴条件下进行离体⁶⁰Co照射 (上海计量测试技术研究院)，制备剂量-效应曲线设0、0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、3、4、5 Gy共10个剂量点。剂量-效应曲线验证设0.25、0.5、2、4共4个剂量点。吸收剂量率0.39 Gy/min。

3.细胞培养与染色体标本制备：照后血样在37℃±0.5℃放置2 h，采用0 h加秋水仙素法进行细胞培养。淋巴细胞培养液 (青岛莱佛生物工程研究所) 含RPMI 1640、胎牛血清、植物血凝素 (PHA)、双抗。秋水仙素终浓度为0.04 μg/ml。每瓶5 ml淋巴细胞培养液加0.5 ml肝素锂抗凝血，37℃恒温箱培养50 h。使用HANABI PIII (美国Transgenomic公司) 染色体 (微核) 收获系统制备细胞悬液，Chromprep AS全自动染色体滴片系统 (上海乐辰生物科技有限公司) 制片，姬姆萨染色。

4. Dic分析及软件参数设置

(1) 使用Metafer 4(Ⅴ.3.11.6) 染色体扫描分析系统 (德国MetaSystems公司) 进行全玻片自动中期分裂相寻找及全玻片高倍图像采集。对采集的高倍数字图像，使用DCScore软件 (德国MetaSystems公司) 进行dic自动分析 (图 1)，对软件检测到的所有的dic，由人工根据经验或使用Ikaros软件 (德国MetaSystems公司) 进行核型分析确认。剔除假阳性dic后，记录经过人工确认的dic数及软件给出的分析细胞数。

图 1 DCScore软件自动分析的dic 注：a.真阳性；b.假阳性 Figure 1 Automatic analysis of dic using DCScore software

(2) DCScore软件的参数设置及数据处理：参数列于表 1。使用CABAS 2.0软件进行“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”拟合及剂量估算^[3]。

表 1(Table 1)

表 1 DCScore软件的参数设置 Table 1 Parameter setting of DCScore software 参数 设定值 染色体选择 最小宽度 (像素) 14 最大宽度 (像素) 32 最小长度 (像素) 16 最小区域 (像素) 200 最大区域 (像素) 3 000 最小纵横比 126/100 最小面积比 229/100 最小染色体数 9 最大染色体数 100 使用染色体组自动分离 否 3色荧光模式 否 结果显示延迟时间 (s) 0 等待按键 否 测量参数 最大饱和区域 (像素) 0 宽度阈值2(%) 25 宽度阈值3(%) 50 宽度变化率极限 (%) 27 中间轴极限 (%) 10 着丝粒质量   最大着丝粒宽度 (%) 100   包括排名对象 11~20   最低着丝粒质量 700 长度标准化   包括排序对象 6~38   标准化长度 (像素) 57 测量范围   谷区区域 (%) 91   中间区域 (%) 56   最小区域 (%) 50 筛选器1   染色体组拒绝阈值   染色体组拒绝系数 -6.920 000/-4.440 000/-9.900 000 筛选器2   第二着丝粒检测阈值 171.422 763   第二着丝粒检测系数 -0.069 914/0.010 405/1.830 569 筛选器3   第二着丝粒分析阈值 -292.557 191   第二着丝粒分析系数 -0.278 561/0.159 703/0.183 462/-0.008 362/-5.030 007/0.771 859 筛选器4   着丝粒相似度校对阈值 -186.096 983   着丝粒相似度校对系数 -0.569 141/0.298 659/1.054 783/-0.083 399/-1.683 618

表 1 DCScore软件的参数设置 Table 1 Parameter setting of DCScore software

5.统计学处理：使用Excel软件对剂量估算值与实际照射值进行相关性分析。

6.剂量-效应曲线准确性验证：将20名健康志愿者外周血分4组，分别离体照射0.25、0.5、2、4 Gy，照射条件及标本制备、dic分析方法同前述。使用新拟合的“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”进行剂量估算。

1.拟合dic染色体自动分析剂量-效应曲线：根据遗传工作站DCScore软件自动分析、人工确认的dic畸变率拟合的“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”为Y=0.018 06D²+0.012 79D+0.000 489 1。其中，Y为软件自动分析并人工确认的每细胞dic数；D为吸收剂量，Gy。估算剂量范围0.5~5 Gy，吸收剂量率0.39 Gy/min。各剂量点分析细胞数及dic数见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 拟合dic染色体自动分析剂量-效应曲线各剂量点分析细胞数及dic数 Table 1 Number of cells used for automatic scoring of dicentric chromosome for different radiation doses 吸收剂量 (Gy) 分析细胞数 (个) 自动dic数 (个) dic/细胞 (p±Sp) 5 12 532 6 798 0.540 0±0.006 6 4 5 552 1 567 0.280 0±0.007 1 3 12 950 2 602 0.200 0±0.003 9 2 13 838 1 328 0.096 0±0.002 6 1.5 18 078 1 045 0.058 0±0.001 8 1 24 679 837 0.034 0±0.001 2 0.75 16 673 339 0.020 0±0.001 1 0.5 16 233 220 0.014 0±0.000 9 0.25 13 608 45 0.003 3±0.000 5 0 25 871 13 0.000 5±0.000 1   注：dic.双着丝粒

表 1 拟合dic染色体自动分析剂量-效应曲线各剂量点分析细胞数及dic数 Table 1 Number of cells used for automatic scoring of dicentric chromosome for different radiation doses

2. dic染色体自动分析剂量-效应曲线的验证：20名健康志愿者离体照射 (0.25、0.5、2、4 Gy) 外周血使用“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”进行剂量估算，结果显示，估算剂量值与实际照射值的偏差均＜20%(0.25 Gy组除外)，相关系数R²=0.961(不含0.25 Gy剂量点)，估算剂量与实际照射剂量高度正相关。该“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”可以准确地进行生物剂量估算，结果见表 2~4。但0.25 Gy剂量组估算的剂量偏差为52%(分析6 430个细胞，估算剂量为0.12 Gy)。

表 2(Table 2)

表 2 “dic染色体自动分析剂量-效应曲线”验证0.5 Gy组分析结果 Table 2 Using "dicentric chromosome automatic analysis dose effect curve" to verify the analysis results of 0.5 Gy group 照射剂量 (Gy) 样本号 分析细胞数 (个) 自动dic数 (个) dic/细胞 (p±Sp) 估算剂量 (Gy) 偏差 (%) 95%CI 0.5 1 2 236 27 0.012±0.002 3 0.52 4 0.38~0.68 0.5 2 2 515 31 0.012±0.002 2 0.53 6 0.40~0.68 0.5 3 1 719 20 0.012±0.002 6 0.51 2 0.35~0.69 0.5 4 1 098 12 0.011±0.003 2 0.48 4 0.29~0.72 0.5 5 1 397 15 0.011±0.002 8 0.48 4 0.30~0.68 平均值 1 793 21 0.012±0.002 6 0.51 1 0.35~0.69   注：dic.双着丝粒

表 2 “dic染色体自动分析剂量-效应曲线”验证0.5 Gy组分析结果 Table 2 Using "dicentric chromosome automatic analysis dose effect curve" to verify the analysis results of 0.5 Gy group

表 3(Table 3)

表 3 “dic染色体自动分析剂量-效应曲线”验证2 Gy组分析结果 Table 3 Using "dicentric chromosome automatic analysis dose effect curve" to verify the analysis results of 2 Gy group 照射剂量 (Gy) 样本号 分析细胞数 (个) 自动dic数 (个) dic/细胞 (p±Sp) 估算剂量 (Gy) 偏差 (%) 95%CI 2 6 2 862 282 0.099±0.005 9 2.00 0 1.87~2.14 2 7 3 997 351 0.088±0.004 7 1.87 5 1.75~2.00 2 8 2 239 175 0.078±0.005 9 1.75 15 1.60~1.91 2 9 4 849 477 0.098±0.004 5 2.00 0 1.87~2.14 2 10 4 268 397 0.093±0.004 7 1.94 5 1.81~2.07 平均值 3 643 336 0.092±0.005 0 1.93 7 1.80~2.06   注：dic.双着丝粒

表 3 “dic染色体自动分析剂量-效应曲线”验证2 Gy组分析结果 Table 3 Using "dicentric chromosome automatic analysis dose effect curve" to verify the analysis results of 2 Gy group

表 4(Table 4)

表 4 “dic染色体自动分析剂量-效应曲线”验证4 Gy组分析结果 Table 4 Using "dicentric chromosome automatic analysis dose effect curve" to verify the analysis results of 4 Gy group 照射剂量 (Gy) 样本号 分析细胞数 (个) 自动dic数 (个) dic/细胞 (p±Sp) 估算剂量 (Gy) 偏差 (%) 95%CI 4 11 4 787 1 262 0.26±0.007 3.48 12 3.26~3.70 4 12 408 108 0.26±0.025 3.49 12 3.13~3.86 4 13 304 111 0.37±0.035 4.15 5 3.74~4.59 4 14 1 334 308 0.23±0.013 3.24 19 3.03~3.44 4 15 624 176 0.28±0.021 3.61 10 3.32~3.91 平均值 1 491 393 0.26±0.013 3.48 13 3.26~3.70

表 4 “dic染色体自动分析剂量-效应曲线”验证4 Gy组分析结果 Table 4 Using "dicentric chromosome automatic analysis dose effect curve" to verify the analysis results of 4 Gy group

大规模核事故及放射性事件发生后，短时间内，会有大量的疑似受照人员急需确认是否受到放射损伤及受照剂量。因此，放射损伤早期、高通量诊断监测指标的研究，一直是核事故医学应急首先需要解决的问题^[4]。

一个理想的生物剂量计应具备：剂量-效应关系、低个体变异、结果的早期可用性、能反映局部照射、指标存续时间长、无创性、自动化等。外周血淋巴细胞dic染色体分析被视为最特异、最灵敏的生物剂量估算方法，是国际公认的剂量估算的金标准。但该方法极其耗费人工，只适合受照人员较少的辐射事件，对于大规模的核辐射事件，无法实现快速、高通量的检测。遗传工作站的出现，使得dic染色体分析剂量估算自动化成为了可能。但遗传工作站自动分析dic染色体有假阳性和假阴性，无法根据遗传工作站自动dic分析数据进行剂量估算，遗传工作站的自动dic分析功能未能得到有效利用，染色体生物剂量估算费时、费工的难题未能解决。Vaurijoux等^[1]通过舍弃遗传工作站自动分析dic的假阴性部分，人工剔除假阳性部分，建立以遗传工作站对dic认知能力为基础的“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”，实现了dic染色体生物剂量估算自动化。

Gruel等^[2]报道的自动dic分析法可以快速准确地进行生物剂量估算，但需要对获得的中期细胞电子图像进行人工挑选, 剔除进入二次分裂周期、染色体数目>或 < 46条、染色体扭曲的、着丝粒不可见、染色单体未分离等不适合分析的细胞，然后再使用DCScore软件进行dic自动检测。本研究直接利用软件对中期细胞形态优劣的识别能力，省略了人工挑选细胞的步骤，虽然方法与文献报道的不同，但验证实验证明，结果是同样准确的，可以进一步提高分析的自动化程度，整个分析过程无需人工参与，仅在最后对软件自动检测到的dic进行确认时需要人工介入，对于训练有素的技术人员，这是极其快速的。虽然制作自动剂量-效应曲线时分析大量细胞人工逐一确认dic需要大量时间，但自动剂量-效应曲线制作完成后，实际应用时每例标本只需观察120~3 000个细胞中被软件检测到的含有dic的细胞，而软件未检测到dic的细胞无需观察，加之软件会对检测到的dic加以标注，这样完成1例样品的dic分析就变得非常快速，而常规方法无论细胞是否含有dic，全部都要逐一分析。自动分析150个细胞可以提供常规人工分析50个细胞相似的信息量^[5]，而常规人工分析50个细胞至少需要1 h，自动分析法可将人工分析效率提高约30倍。

验证实验结果表明，本研究拟合的“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”获得了理想的估算值，但对于0.25 Gy剂量组估算的剂量偏差达到了52%，因此，该“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”可能不适合估算≤0.25 Gy的剂量，或者对于≤0.25 Gy的剂量，需要增加更多的分析细胞数。此外在验证实验的4 Gy剂量点，5例样本估算的剂量偏差均＜20%，符合生物剂量估算的精度要求，但95%CI却未能覆盖实际照射值，原因不明，有待进一步研究。Romm等^[6]报道常规方法人工分析1 000个中期细胞时, 95%CI变得非常小, 照射剂量值落于估算剂量95%CI内的数量减少。

国际标准化组织 (ISO)2004建议各实验室应该建立自己的剂量-效应曲线^[7]，实践也证明不同实验室建立的剂量-效应曲线之间存在差异。Romm等^[5]的研究显示，多家实验室各自拟合的“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”二次项系数存在明显差异，但合并所有实验室的数据后拟合的“联合dic染色体自动分析剂量-效应曲线”的各项系数与各自曲线的系数并无明显差异。提示可以建立不同实验室之间通用的自动分析剂量-效应曲线，但Romm等^[5]并未在文献中公开他们拟合的“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”。本研究初步报道了本实验室建立的“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”，以及在本室实验条件下该曲线剂量估算的可重复性和准确性，值得今后深入探讨的是建立可以在不同实验室之间通用的“dic染色体自动分析剂量-效应曲线”。

dic自动分析虽然可以很快速，但遗传工作站采集、摄取中期分裂相仍然需要耗费一定时间，然而可以通过优化分析策略、优化仪器配置、增加遗传工作站数量，将这部分时间无限制地缩短，从而最终达到快速、高通量染色体生物剂量估算的目的。Romm等^[8]和Vaurijoux等^[9]的模拟实验表明，dic染色体自动分析法不仅能够估算急性均匀照射，还能估算局部照射和慢性照射剂量，可以作为大型辐射事故剂量估算的高通量筛选工具。

双着丝粒染色体自动分析生物剂量估算方法可能是目前较为接近理想的生物剂量计。